（生物化学与分子生物学专业论文）石蒜生物碱分析及其生物合成的初步研究.pdf

摘要 本试验研究了石蒜的组织培养的条件，优化了石蒜中生物碱加兰他敏提取的条 件，建立石蒜生物碱的薄层色谱分析方法，用液体培养法研究了加兰他敏、力可拉 敏、石蒜碱对石蒜生物碱生物合成的影响，固体培养法研究了在石蒜组织培养芽的 诱导过程中石蒜生物碱含量的变化及加兰他敏对其生物生物碱生物合成的影响。对 石蒜生物碱的生物合成途径进行了初步的研究。主要内容如下： 通过组织培养找到石蒜快速繁殖合适的条件。试验结果如下：m s + 0 3m g l n a a + 3 0m g l 6 b a 培养基是不定芽诱导的最佳培养基，m s + 0 5m g l6 - b a + 0 8m g l n a a 是较好的生根培养基组合；3 h 3 0 蛭石营养土最有利于幼苗的成活。在1 1 月份 进行组织培养最有利于石蒜鳞茎的快速繁殖。石蒜组织培养的季节性，属首次研究。 通过单因素试验和正交试验得到如下较好的提取加兰他敏的试验条件：7 5 乙 醇、微波处理时间6 0s 、浸取时间1 小时、固液比1 ：1 0 、微波功率4 8 0w 。用此方 法研究了石蒜不同部位加兰他敏的含量，结果表明鳞茎中含量最高，其次为花梗、 花、叶。这种方法耗时短，效率高，有利于研究石蒜生物碱生物合成时大批材料的 处理。 本试验研究了石蒜生物碱的单向和双向薄层色谱( t l c ) 分析法，结果表明单向 t l c 中以氯仿、甲醇、氨水配比9 ：1 ：0 2 分离效果最好，分离斑点最多，且十分清 晰：建立了以乙酸乙酯、甲醇、氨水配比9 ：l ：o 2 为第一向，氯仿、甲醇、氨水配 比9 ：1 ：o 2 为第二向的石蒜生物碱的双向薄层色谱分析法，分离效果更好，分离出 的生物碱种类多，且都十分清晰。是分析石蒜生物碱的一种快速简便耗样量少的新 方法。 通过液体培养石蒜鳞茎圆片，研究了加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱对石蒜生物 碱生物合成的影响，结果显示，加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱均能明显抑制石蒜生 物碱的合成。推测石蒜中生物碱都来自一种共同的前体，加兰他敏、力可拉敏同属 一条合成路线，其中生物碱d 和e 位于加兰他敏和力可拉敏之间，石蒜碱和生物碱i 处于另一分支。 试验还研究了在组织培养芽的诱导过程中，石蒜中各种生物碱的变化，除加兰 他敏外均表现出先增加后减少的趋势，加兰他敏表现出一直增加的趋势。在培养基 中加入加兰他敏后，表现出与液体培养鳞茎圆片一样的结果，生物碱的合成明显受 到加兰他敏的抑制。此方法也可用于研究石蒜生物碱的生物合成。为石蒜生物碱生 物合成的研究提供了另外一种方法。 关键词石蒜，薄层色谱，生物碱，生物合成 a b s t r a c t i nt h i ss t u d yt h et i s s u ec u l t u r ec o n d i t i o n so fl y c o r i sr a d i a t aw a si n v e s t i g a t e d ；t h e e x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fg a l a n t a m i n ei n 三r a d i a t aw a so p t i m i z e d ；t h et l ca n a l y s i s m e t h o do fa l k a l o i di nl r a d i a t aw a sc o n s t i t u t e d ；t h ei n f l u e n c eo fg a l a n t a m i n e ，l y c o r a m i n e ， l y c o r i n eo nt h eb i o s y n t h e s i s o fl r a d i a t aa l k a l o i d sw a ss t u d i e d ( 1 i q u i dt i s s u ec u l t u r e m e t h o dw a su s e d ) ；a n dt h ec h a n g e so fa l k a l o d sc o n t e n ti nt h ep r o c e s so fb u di n d u c e d t i s s u ec u l t u r ew a ss t u d i e dt h r o u g ht h es o l i dc u l t u r e ，o nt h ew h i l e ，t h ei n f l u e n c eo f g a l a n t a m i n eo nt h eb i o s y n t h e s i so f 三r a d i a t aa l k a l o i d sw a ss t u d i e d t h ei n i t i a lr e s e a r c h w a sc a r r i e dt h r o u g ho nl r a d i a t aa l k a l o i d sb i o s y n t h e s i sp a t h w a y t h em a i nc o t e n ta s f o l l o w s ： t h em e t h o do f l r a d i a t af a s tb r e e d i n gw a se r e c t e d t h er e s u l ts h o w e d ：t h em e d i u m m s + 0 3m e , l n a a + 3 0m g l 6 一b aw a so p t i m a lf o rb u di n d u c e d ，m s + 0 5m g l6 - b a + 0 8m g ln a aw a st h es u i t a b l em e d i u mf o rr o o ti n d u c e d t h en u t r i e n ts o i lw i t h3 0 v e r m i c u l i t em a d ef o rt h es u r v i eo fy o u n gp l a n t s n o v e m b e rw a st h es u i t a b l eg r o w t hp e r i o d f o rt h et i s s u ec u l t u r eo fl r a d i a t ab u l b s t h es t u d ya b o u tt h es e a s o n a lc h a r a c t a ro f l r a d i a t at i s s u ec u l t u r ew a st h ef i r s tt i m e t h r o u g ht h es i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n tt h eb e t t e rt e s tc o n d i t i o n sw a s o b t a i n e d ，a sf o l l o w s ：7 5 e t h o n a l ，m i c r o v a v ep r o c e s s i n gt i m e6 0s , m a r i n a t i n gt i m e lh ，s o l i dt ol i q u i dr a t i o1 ：10 ，m i c r o w a v ep o w e r4 8 0w jn l eg a l a n t a m i n ec o t e n to f d i f f e r e n tp a r t si nl r a d i a t aw a ss t u d i e db yt h e s ec o n d i t i o n s ，t h er e s u l tw a s ：t h ec o n t e n ti n b u l bw a st h em o s t ，f o o t s t a l k ，f l o w e r , l e a ft o o kt u l t i s t h i sm e t h o dc o u l de x t r a c tm o r e a l k a l o d si ns h o r tt i m e w a ss u i t a b l ef o rd e a l i n gw i t l ll o t so fm a t e r i a l sw h e n t h eb i o s y n t h e s i s p a t h w a y o fl r a d i a t aa l k a l o i d sw a ss t u d i e d i nt h i se x p e r i m e n to n es y s t e ma n dt w os y s t e m st l c a n a l y s i sm e t h o d s w a ss t u d i e d i n o n es y s t e mt l cm e t h o d s s o l v e n tc h c l 3 ：m e o h ：n h 3 h 2 0 ( 9 ：1 ：0 2 ) w a st h eb e s t f o rl y c o r i sr a d i a t aa l k a l o i d ss e p a r a t e d ，s h o w e dt h em o s ts p o t sw h i c hw e r ev e r yc l e a r t h e e f f e c to ft w os y s t e m sm e t h o d sw a sb e t t e rt h a no n es y s t e mm e t h o d s t w os y s t e mw a s s o l v e n t1e t o a c ：m e 0 h ：n h 3 h 2 0 ( 9 ：l ：o 2 ) ，s o l v e n t2c h c l 3 ：m e o h ：n h 3 h 2 0 ( 9 ：1 ：0 2 ) w 1 1 i c hc o u l ds e p a r a t em o r el r a d i a t aa l k a l o i d st h a no n es y s t e mm e t h o d ， a n dt h es p o t sw e r ea l lc l e a r - c u t i tw a san e wm e t h o dt o s e p a r a t el r a d i a t aa l k a l o i d s ， s p e n tl e s sm a t e r a i l sa n d t o o kl i t t l et i m e ，w a sv e r yf a c i l i t y w a f e ro fl r a d i a t ab u l b sw a sc u l t u r e di nl i q u i dm sm e d i u m ，a n dt h ee f f e c to f i i g a l a n t a m i n e ，l y c o r a m i n e ，l y c o r i n eo nt h eb i o s y n t h e s i so fl r a d i a t aa l k a l o i d sw a s s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg a l a n t a m i n e ，l y c o r a m i n e ，l y c o r i n ec o u l di n h i b i tt h eb i o s y n t h e s i s o fl r a d i a t aa l k a l o i d so b v i o u s l y w ec o u l ds p e c u l a t et h a ta 1 1l y c o r 括r a d i a t aa l k a l o i d s h a do n ec o m m o np r e c u r s o r ，a n dw ep r e s u m e dt h a tw e r ei nt h es a l t l ew a yo fl y c o r 捃 r a d i a t aa l k a l o i d sb i o s y n t h e s i s a l k a l o i d “d a n d “e ”w e r el o c a t e db e t w e e na n dl y c o r a m i n e l y c o r i n ea n d a l k a l o i d “i ”w e r ei nt h eo t h e re m b r a n c h m e n t t h ea l k a l o i dc o n t e n tc h a n g e sw a ss t u d i e di nb u di n d u c e dt i s s u ec u l t u r ep r o c e s s e x c e p tg a l a n t a m i n e ，a l lt h eo t h e ra l k a l o i dc o n t e n ti n c r e a s e da n dt h e nd e c r e a s e d ，b u t g a l a n t a m i n eh a db e e ni n c r e a s i n ga l lt h ew h i l e a f t e rg a l a n t a m i n ea d d e d ，w ea c q u i r e dt h e s a m er e s u l ta st h eb u l bw a f e r sl i q u i dc u l t u r e ，g a l a n t a m i n ei n h i b i t e dt h eb i o s y n t h e s i so fa l l a l k l o i di nl r a d i a t a t h i sm e t h o da l s oc o u l ds t u d yt h eb i o s y n t h e s i so fl r a d i a t aa l k a l o i d s i t sa n o t h e rm e t h o dt os t u d y 三r a d i a t aa l k a l o i d sb i o s y n t h e s i s k e yw o r dl y c o r i sr a d i a t a ，t l c ，a l k a l o i d ，b i o s y n t h e s i s i i i 目录 摘要i a b s t r a c t 一i i 1 文献综述1 1 1 石蒜简介1 1 2 石蒜的系统学研究1 1 2 1 核型1 1 2 2 花粉形态及叶的解剖学研究l 1 2 3 分子生物学方法研究石蒜的遗传关系o 2 1 2 4h p l c 图谱分析石蒜种属间关系3 1 3 石蒜的快速繁殖3 1 4 石蒜生物碱提取分析方法3 1 4 1 提取方法一4 1 4 2 分析检测5 1 5 石蒜的药用价值及前景5 1 6 加兰他敏的研究6 1 6 1 加兰他敏在石蒜中分布及含量一6 1 6 2 加兰他敏高产品系研究及加兰他敏产量的提高6 1 6 3 加兰他敏的生物合成及化学合成的研究6 2 引言1 2 2 1 石蒜研究现状1 2 2 2 加兰他敏生物合成途径研究现状1 2 2 3 本研究的目的与意义1 3 2 3 1 石蒜组织培养13 2 3 2 加兰他敏提取条件的优化l3 2 3 3 石蒜生物碱薄层色谱条件的优化1 3 2 3 4 加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱对石蒜生物碱生物合成的影响1 3 2 3 5 芽诱导过程中鳞片生物碱含量变化及加兰他敏对其影响的研究1 4 3 材料与设备1 5 3 1 材料15 3 2 仪器设备l5 4 试验方法与试验设计16 4 1 石蒜的组织培养与植株再生的研究1 6 4 1 1 材料处理：16 4 1 2n a a 和6 - b a 不同配比对双鳞片出芽影响的双因素实验1 6 4 1 3 不同生长季节对石蒜鳞茎出芽的影响1 6 4 i 4n a a 浓度对小鳞茎生根影响的单因素实验1 6 4 1 5 不同土壤条件对生根苗移栽成活率的影响1 6 i v 4 1 5 培养条件1 6 4 2 1 材料预处理16 4 2 2 加兰他敏的提取流程j 1 6 4 2 3 标准曲线的制作17 4 2 4 精密度实验1 7 4 2 5 重现性实验17 4 2 6 乙醇浓度对加兰他敏提取影响的单因素试验1 7 4 2 7 微波处理时间、浸取时间、固液比、微波功率对加兰他敏提取影响的正交试验 1 7 4 2 8 石蒜不同部位加兰他敏含量测定1 8 4 3 石蒜生物碱薄层色谱条件的优化及不同部位生物碱分析1 8 4 3 1 样品制备18 4 3 2 显色剂的配制18 4 3 3 显色及数据处理，1 8 4 3 4 展开剂的选择1 9 4 4 加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱对石蒜鳞茎中生物碱合成的影响2 0 4 4 1 材料的处理2 0 4 4 2 样品的制备2 0 4 4 3 薄层板的预处理2 0 4 4 4 样品的薄层色谱分析2 0 4 5 石蒜组织培养诱导芽过程中各种生物碱的含量变化，及加兰他敏对其影响的研究 ：! l 4 5 1 材料的处理2 l 4 5 2 组织培养2 1 4 5 3 观察取样处理2 1 4 5 4 样品的薄层色谱分析2 1 4 6 数据处理方法2 1 5 结果与分析2 2 5 1 石蒜的组织培养和植株再生2 2 5 1 1n a a 和6 - b a 的不同浓度组合对石蒜双鳞片出芽影响的双因素实验2 2 5 1 2 不同生长季节石蒜双鳞片出芽结果比较2 3 5 1 3 不同浓度的n a a 对石蒜小鳞茎生根的影响2 3 5 1 4 不同土壤条件对石蒜幼苗移栽成活率的影响2 4 5 2 加兰他敏的提取条件的优化设计及含量测定2 5 5 2 1 加兰他敏最大吸收峰波长的确定2 5 5 2 2 标准曲线2 5 5 2 3 精密度试验2 5 5 2 4 重现性试验2 5 5 2 5 乙醇浓度对加兰他敏提取影响的单因素试验2 5 5 2 6 微波处理时间、浸取时间、固液比、微波功率对加兰他敏提取影响的正交试验 2 5 5 3 石蒜生物碱薄层色谱条件的优化及不同部位生物碱分析2 7 5 3 1 氯仿、甲醇不同配比对生物碱分离的影响2 7 v 5 3 2 丙酮对生物碱分离的影响2 8 5 3 3 氨水加入量的不同对石蒜生物碱分离的影响2 8 5 3 4 乙酸乙酯对石蒜生物碱分离的影响2 9 5 3 5 石蒜生物碱的双向薄层色谱3 0 5 3 6 石蒜鳞茎、根、叶生物碱的薄层色谱分析3 1 5 4 加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱对石蒜鳞茎中生物碱合成的影响3 2 5 5 石蒜组织培养诱导芽过程中各种生物碱的含量变化，及加兰他敏对其影响的研究 ：；z 6 讨论与结论3 6 6 1 讨 仑3 6 6 1 1 石蒜的组织培养和植株再生3 6 6 1 2 石蒜中加兰他敏提取条件的优化及不同部位含量测定3 6 6 1 3 石蒜生物碱薄层色谱条件的优化及不同部位生物碱分析3 7 6 1 4 加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱对石蒜鳞茎中生物碱合成的影响3 7 6 1 5 石蒜组织培养芽诱导过程中各种生物碱的含量变化，及加兰他敏对其影响的研 究3 8 6 2 结论3 8 6 2 1 石蒜的组织培养和植株再生3 8 6 2 2 加兰他敏提取条件的优化及含量测定：3 9 6 2 3 石蒜生物碱薄层色谱条件的优化及不同部位生物碱分析8 so60obd 3 9 6 2 4 加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱对石蒜鳞茎中生物碱合成的影响3 9 6 2 5 石蒜组织培养芽诱导过程中各种生物碱的含量变化，及加兰他敏对其影响的研 究3 9 参考文献4 0 致谢4 4 个人简介4 5 1 文献综述 1 1 石蒜简介 石蒜( l y c o r i sr a d i a t ah e r b ) 为石蒜科( a m a r y l l i d a c e a e ) 石蒜属( l y c o r i sh e r b ) 植物， 别名：蟑螂花、龙爪花、红花石蒜，是一种草本花卉，有很高的观赏价值【l 】。含有加兰 他敏、力可拉敏、石蒜碱等多种生物碱，药用价值很高。石蒜居群复杂，生物碱成分 复杂，且含量有季节变化，研究起来困难较大，研究的并不深入。 1 2 石蒜的系统学研究 1 2 1 核型 石蒜的核型研究表明石蒜是复合体。不同的石蒜居群核型不同。主要有以下几种 类型： ( 1 ) 2 n = 3 3 = 3 3 t ( s t ) ，园艺栽培植株【2 1 ，安徽滁州居群6 】； ( 2 ) 2 n = 2 1 + 1 b = l m + 1 2 s t + 8 t + l b ，产地为安徽芜湖1 2 】； ( 3 ) 2 n = 2 2 = 1 2 s t + 1 0 t ，产地为安徽黄山1 2 j ； ( 4 ) 2 n = 2 2 + 1 b = 6 s t + 1 4 t + 2 t + 1 b ，属“4 a ”核型，产地为安徽黄山【2 】； ( 5 ) 2 n = 2 2 = 6 s t + 16 t ，产地为安徽九华山【3 】； ( 6 ) 2 n = 2 4 = 6 m + 8 s m + 6 s t + 4 t ，产地为安徽马鞍山【4 j ； ( 7 ) 2 n = 4 s t + 1 8 t ，产地为安徽怀宁凉亭【5 】； ( 8 ) 2 n = 4 4 = 2 8 s t + s t + 8 t ，2 n = 2 2 = 6 s t + 1 2 t + 4 t ，产地安徽霍山【6 j ； ( 9 ) 2 n = 2 2 = 2 2 t ，2 n = 2 2 = 1 8 s t + 4 t ，2 玎= 2 l = 1 2 s 什7 t + 2 t ；产地安徽黄山【6 1 ； ( 1 0 ) 2 n = 3 3 = 1 8 s t + 1 5 t ，2 n = 2 5 = 1 m + 2 0 s t + 2 t + 2 t ，产地安徽马鞍山【6 】： ( 1 1 ) 2 n = 2 2 = 2 0 s t + 2 t ，2 n = 2 1 = 1 m + 2 0 s t ，产地安徽宣城【6 】； ( 1 2 ) 2 n = 2 2 = 1 2 s t + 4 t + 6 t ，2 n = 2 1 = 1 8 s t + 3 t ，产地浙江杭9 、1 4 t 6 j ； ( 1 3 ) 四倍体，产地安徽霍山。 不同居群的石蒜核型不同，变异较大，但并不影响石蒜的延存与发展，可能与野 生石蒜主要的增殖方式为无性繁殖，很少产生种子有关【2 矧。由于石蒜核型种类多样， 给石蒜的各种研究工作带来了很大的困难，也为石蒜品种选育及石蒜生物碱的生物合 成的研究提供了多样的材料。 1 2 2 花粉形态及叶的解剖学研究 石蒜花的形态是其分类的重要特征之一。花粉形态是植物分类的重要标志，石蒜 花粉的形态为两侧对称，属无乳突粗网亚型，由于石蒜属植物花粉形态与百合科某些 植物相似，因而有的学者倾向于将石蒜属归入百合科【7 ，8 1 。 叶也是植物分类的重要特征之一，石蒜叶部结构处于较原始的状态，是有明显乳 突的一类；石蒜叶端部大的导管数目与基部差异较大，而石蒜属其他大部分种在叶的 端部、中部和基部分布大的导管的数目一般相差不多，此特征表明石蒜与其他1 1 种 有明显的区别【9 1 。而从叶的微形态来看，石蒜与中国石蒜亲缘关系较近【1 0 】。 石蒜的不同居群中染色体数目和核型多样，不同种群的石蒜在花粉、叶的解剖结 构和微形态等各方面却有共同的特征，在不同方面表现出与其他种石蒜的亲缘关系远 近不同。这表明石蒜核型多样，但控制发育的相关基因表达却是一致的，这为石蒜的 发育生物学研究，提供了一定的信息。 1 2 3 分子生物学方法研究石蒜的遗传关系 分子水平上进行分类学研究的方法很多，有r a p d 标记指纹图谱，i s s r 标记，单 染色体分离及体外扩增，s r a p 标记，同功酶等。用不同的方法对石蒜进行研究，可 以从不同的方面反映石蒜的遗传多样性。 张露等构建了r a p d 标记的1 3 种石蒜属植物的指纹图谱。由指纹图谱可以看出 石蒜与玫瑰石蒜、红蓝石蒜、稻草石蒜和换锦花亲缘关系较近，而与忽地笑亲缘关系 较远【l 。为研究石蒜属植物的亲缘关系提供了新的方法。 杨志玲等【12 j 建立了i s s r 标记研究石蒜的新方法，其反应条件为：2 0n g d n a 模板、 o 5p m o l l 随机引物、1 5 0 t m o l l d n t p s 、2 0m m o l l m 9 2 + 、1 0u t a qd n a 聚合酶，总 反应体系2 5 “l ；反应程序：9 4 预变性5m i n ，4 5 个循环( 循环过程为：9 4 变性 4 5s ，5 5 退火6 0s ，7 2 延伸2m i n ) ；最后7 2 延伸7m i n 。对于石蒜的种质资源及 遗传多样性的研究比较有意义，i s s r 标记可能为石蒜生物碱生物合成提供某些信息。 邓传良等【13 j 以二倍体石蒜为材料，建立了石蒜单染色体分离及体外扩增的方法， 为石蒜的发育生物学研究提供一定的信息。 石蒜核型复杂，虽然研究的较多，但石蒜居群间差异的分子机理研究的并不深入， 上述这些分子方面的研究手段，为从基因及其因表达水平上研究石蒜不同居群间遗传 亲缘关系及石蒜居群遗传多样性提供了方法基础，也为研究石蒜生物碱的生物合成途 径提供定的信息。 1 2 4h p l c 图谱分析石蒜种属间关系 石蒜含有加兰他敏等十多种生物碱，由于环境等因素的影响，不同居群石蒜中生 物碱在含量上差异很大1 1 引。 生物碱是石蒜属植物化学分类的特征性成分，袁菊红等建立了高效液相色谱 ( h p l c ) 检测石蒜属及其近缘植物中国水仙生物碱的方法，共检测了1 7 份样品，结果 显示包括石蒜碱、力可拉敏和加兰他敏在内的1 0 个色谱峰为石蒜属植物的特征峰，不 同产地石蒜生物碱的色谱峰具有一定的差异，其中加兰他敏、力可拉敏在含量上差异 很大，可能与不同产地生态环境条件不同有关【l6 | ，也可能与不同产地石蒜的遗传差异 有关【15 1 。 1 3 石蒜的快速繁殖 石蒜具有很高的观赏价值和药用价值，野生石蒜繁殖率低狰j ，野生资源不足以满 足市场需求，因而人工栽培石蒜，进行快速繁殖就显得比较重要。近年来对石蒜快繁 的研究还是比较多的，其主要方法有人工切割法、茎盘刳取法、茎盘沟切法、伤心法 和双鳞片法等。 人工切割法可明显的提高石蒜的繁殖系数，但子球较小；茎盘刳取法虽不能明显 的提高石蒜的繁殖系数，但所得子球较大，质量较高；茎盘沟切法和伤心法能够比较 明显的提高石蒜的繁殖系数，且能够获得质量好的子球【1 7 】。双鳞片法能够快速提高石 蒜的繁殖系数，但要想得到符合质量要求的子球需要较长的时间【1 8 , 1 9 】。吕玉华等【1 9 1 在研究双鳞片法时发现，红花石蒜在光照条件下出芽率较高，小鳞茎生根效果较好的 生长调节剂为n a a ，6 的蔗糖浓度有利于小鳞茎的增重，小鳞茎增殖比较合适的培 养基为m s + 6 b a 4m g l + n a a 0 5m g l ，试验结果说明只要条件合适，也可以在较短 的时间内得到符合质量要求的鳞茎。组织培养材料的采集季节对石蒜的快繁影响也很 大，何树兰【2 0 】等在对石蒜鳞茎进行组织培养时发现，在用鳞茎作为组织培养材料时， 地上部分衰老期和花期采集材料最为合适，且材料需在低温4 8 下冷藏6 8 周效 果才好。 此外谢菊英【2 1 】等用生长调节剂对石蒜鳞茎进行浸球处理，发现选择合适的生长调 节剂，用合适浓度生长调节剂进行处理，也可以提高石蒜的繁殖系数。 1 4 石蒜生物碱提取分析方法 石蒜鳞茎含有多种生物碱，如石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏等，其结构式如图1 1 。 石蒜碱具有一定抗癌活性，并能消炎、解毒、镇静及催吐。所含的加兰他敏和力可拉 敏是很好的胆碱酯酶抑制剂，可用于治疗小儿麻痹症及重症肌无力等症。 h 石蔫碱( b r i 舱)力可拉敏( 1 y c 蛐啦i i k )h 睇一明 图1 一i 石蒜碱、力可拉敏、加兰他敏的分子结构 f i g 卜1t h es t r u c t u r eo fl y c o r i n e ，l y c o r a m i n e ，g a l a n t a m i n e 1 4 1 提取方法 石蒜中生物碱药用价值很高，尤其是加兰他敏市场前景看好1 2 引，因而在石蒜生物 碱提取方法上研究的较多，主要有传统的溶剂回流法、酸性醇提取法、微波辅助提取 法、微波辐射溶剂回流法、超声波法、离子液体微波辅助提取法等。 在酸性条件下，生物碱通常以盐的形式存在，更易溶于水中，吴彦等【2 3 】建立了酸 性醇溶液提取石蒜生物碱的方法和条件：p h 值为l 的提取液，提取2 4 , 时，5 0 的乙醇。 极性强的生物碱以盐的形式溶于酸性溶液中，而极性弱的生物碱则易溶于乙醇中，利 用酸性醇提取法，可以充分的提取出石蒜生物碱。 微波辅助提取法( m a e ) 在植物天然产物提取方面应用的较多，m a e 应用于植物有 效成分的提取，可缩短提取时间、减少污染、提高效率。范华均等建立了m a e 提取 石蒜中石蒜碱、力可拉敏和加兰他敏等生物碱的方法，传统的溶剂回流法在相同的条 件下提取率只有m a e 法的2 3 ，要达到相同的提取效果，传统的溶剂回流法处理时间 至少要是其3 倍，充分体现了m a e 法的快速高效性【2 4 1 。之后范华军等又建立了微波辐 射溶剂回流提取法( p m i r e ) ，提取石蒜中生物碱更为有效，其提取率明显高于传统溶 剂回流法( s r e ) 和密闭微波辅助提取法( c m a e ) ，以石蒜碱为例，p m i r e 提取率为 1 3 6 m g g ，s r e 提取率为1 1 2 m g g ，c m a e 提取率为1 2 8m g g 。其主要的原因是微波 的辐射作用使石蒜细胞壁破碎，这样更有利于石蒜生物碱的溶出【2 引。经过微波的处理 作用，在短时间内石蒜中的生物碱可被充分提取出来，是一种快速高效的石蒜生物碱 提取方法。 超临界萃取是一种环境友好的萃取技术。汪兵1 2 6 j 等用粉碎、超声波、碱化预处理， 超临界萃取技术进行石蒜生物碱的提取，提取率可达0 0 3 5 3 干重，石蒜原料经粉碎 后细胞壁只有小部分破碎，超声波处理可以明显的增加细胞壁的破碎程度，因而超声 4 波处理可以明显的促进加兰他敏等石蒜生物碱的游离，大大提高了加兰他敏等生物碱 的提取率。c 0 2 超监界萃取技术，可以提取出较多的石蒜生物碱，对环境几乎没有污 染，是一种环境友好的萃取技术。虽然时间较长要2 d , 时，但是环境友好，污染小， 还是一种比较好的提取方法的。 杜甫佑【2 7 】等建立的离子液体微波辅助萃取法，其提取石蒜中生物碱的萃取效率较 传统有机溶剂和传统萃取技术有明显提高，在1 0m o l l b m i m c 1 溶液为溶剂，液固比 ( m l ：g ) 1 5 ：1 ，8 0 微波处理1 0m i n 的条件下，石蒜碱、力可拉敏和加兰他敏生物碱 的萃取率分别可达2 7 3 0 、0 8 5 7 和0 1 7 9m g g 干重。真正实现了快速高效且环境友好。 是一种有发展前途的石蒜生物碱提取方法。 1 4 2 分析检测 分析石蒜生物碱的方法主要有紫外分光光度法、荧光分光光度法、h p l c 分析、 薄层色谱分析等方法。 紫外分光光度法简单快速【2 8 1 ，但只能测总碱，且样品耗量大，测定的精确度不够。 荧光分光光度法【2 9 】灵敏度要比紫外分光光度法高1 个数量级，样品耗量小，简便快速， 且精确度高，但操作要求较高，限制了其使用范围。 紫外法灵敏度比荧光法低，但由于与h p l c 等分离技术相结合，应用范围更为广 范。范华均【2 4 】等用三乙胺水溶液( p h9 0 ) 乙腈甲醇作为流动相，通过h p l c 对石蒜 中石蒜碱、力可拉敏和加兰他敏生物碱进行了分析测定，得到了较好的效果。 薄层色谱法设备要求简单，处理方便，只要展开剂合适，就能很好的分离生物碱， 成本较低。如果结合薄层扫描还可以做到定量分析。张俊树3 0 j 等以二氯甲烷甲醇 氨水( 9 0 ：1 0 ：0 5 ) 为展开剂，对石蒜生物碱生物碱进行分析，能很好的分离加兰他敏、 力可拉敏和石蒜碱。并以二氯甲烷甲醇( 1 0 0 ：8 ) 为流动相进行硅胶高效液相色谱分 离石蒜生物碱，能很好的分离加兰他敏、力可拉敏，并能精确的定量。 虽然分析检测方法较多，但要分析石蒜中1 0 多种生物碱，还有一定的困难，还需 要研究更好的分离分析方法。 1 5 石蒜的药用价值及前景 石蒜中含有加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱等多种生物碱，外用可治疗d , j l 急性肾 炎【3 1 1 、急喉风、妊娠水肿、毒蛇咬伤等【3 2 1 ；还可用于治疗小儿麻痹症后遗症和阿米 巴痢疾等【3 3 】；石蒜碱在肿瘤治疗方面有重要价值，可用来治疗胃癌、卵巢癌等【3 3 】， 石蒜碱经改造后的石蒜内铵可以有效的治疗妇科晚期恶性肿瘤【3 4 1 ，动物实验还显示石 蒜生物碱在治疗癌症方面有更广泛的用途，对艾氏腹水癌、腹水肝癌、白血病l 1 2 1 0 、 腹水型吉田肉瘤平i l e w i s 肺癌有较强抑制作用【3 3 】；此外石蒜碱还有抗菌、抗病毒( 包 括s a s c o v 病毒【3 6 】) 、抗疟疾等作用【3 3 】；石蒜碱由于毒性较大，可用来制成低浓度生 物农药，高效无污染【35 1 。动物实验表明加兰他敏和二氢石蒜碱可以明显改善药物处理 小鼠的记忆能力，并能促进正常小鼠记忆获得，两药联用效果更好1 37 。近年来发现加 兰他敏在治疗阿尔茨海默病( 老年痴呆的一种) 方面有特殊的疗效，还可以改善脑血 管痴呆患者的情绪状态及生活处理能力，在提高智商方面明显好于其他药物【35 1 。 石蒜是一种药用价值极高的植物，自从加兰他敏作为抗老年痴呆药物以来，市场 价值进一步提高。2 0 0 6 年国内市场加兰他敏的需求- 量为3 0 0 k g ，国际市场1 5 0 0 k g 2 2 j 。 虽然有人在研究加兰他敏的化学合成，由于合成过程太长，成本比天然材料提取还要 高，限制了其展，刘涛等进一步优化了外消旋加兰他敏合成的条件【3 8 】，将外消旋加兰 他敏的工业化生产向前推进了一步，但目前仍以天然材料提取为主【2 2 】。石蒜自然繁殖 率低，野生资源明显不足，因而一方面要通过组培的方式来增加石蒜的繁殖效率，另 一方面还要寻找和培养高加兰他敏含量的品种，以满足国内外市场的需求。 以石蒜为材料研究加兰他敏的生物合成途径在国内外均未见报道。j e f f s 4 3 】等以 非洲番杏s c e l e t i u ms t r i c t u r e 为材料研究了其中的松叶菊碱( m e s e m b r i n ea l k o n o i d s ) 的 生物合成途径，如图1 2 。由于松叶菊碱与石蒜属生物碱h a e m a n t h a m i n e 有着相似的 结构，因而推测这两组化合物有着平行的生物合成途径，苯丙氨酸和酪氨酸是其碳骨 架最初的来源。 e i c h h o r n 等以l e u c o j # a ma e s t i v u m 为材料通过放射性同位素标记生物合成的前体， 研究加兰他敏的生物合成途径，其推测的可能的加兰他敏的生物合成途径如图1 3 。 并且确定加兰他敏直接由去甲基加兰他敏生成o e i c h h o m l 撕究结果显示加兰他敏 更可能是诺维定合成的前体，而根据图1 4 ，b a s t i d aa n dv i l a d o m a t 的石蒜科生物碱合 成路径图，诺维定是加兰他敏合成的前体 4 5 】，由此可以看出石蒜科生物碱的生物合 成途径还并不清楚，哪种