（分析化学专业论文）基于dna寡聚核酸链和纳米粒子体系对目标物的免标记比色测定.pdf

y f l l l l f l l f f l l l f 7 f f i i i 嬲幽 基于d n a 寡聚核酸链和纳米粒子体系对目标 物的免标记比色测定 摘要 在本论文中，工作主要基于d n a 寡聚核酸链纳米粒子的免标记比色方法展 开。( 1 ) 利用t - h 9 2 * - t 碱基配对理论和单双链d n a 与金纳米粒子间的不同作用， 发展了对h 9 2 + 的免标记比色分析方法。含有一定数量卫t 错配碱基的互补d n a 双链不能杂交，d n a 链仍可维持其单链自由舒展状态，因而可以有效保护金纳米 粒子免受盐诱导的聚集。h 矿+ 诱导的t - t 碱基配对可以促使互补双链杂交，形成 的双链结构失去了对金纳米粒子的保护能力，由此金纳米在加盐后聚集，伴随颜 色由红色到蓝色的变化。体系的测定区域、线性范围和检测限可通过改变双链中 的t - t 错配碱基数目调节。较低比例的t 错配碱基使得检测范围窄，但检测限 低；较高比例的t - t 错配碱基可以扩大检测范围，提高检测上限。此方法可能适 用于与核酸分子中某些碱基具有特定作用的其他金属离子、配体或药品分子的分 析测定。( 2 ) 基于未修饰d n a 对银纳米粒子吸附的考察，利用未修饰d n a 和银 纳米粒子实现了对与p o l y ( a ) 特定作用的配体分子( 这罩使用c o r a l y n e ) 的比色分 析。腺嘌呤脱氧核糖核苷酸对银纳米粒子表现出强的亲和力，a 碱基序列能够有 效地稳定银纳米粒子。与a 序列特定作用的配体分子的存在能够键合吸附的a 1 6 碱基序列并将其自纳米粒子表面带走，由此银纳米粒子受保护程度降低，加盐后 聚集，伴随颜色由黄色到棕色的变化。结果表明，基于d n a 和银纳米粒子的免 标记比色分析可以实现。同时在此类体系中，目标物可以由寡聚核酸链拓展到小 分子。 关键词d n a 寡聚核酸链纳米粒子比色分析免标记 l a b e l f r e ec o l o r i m e t r i cd e t e ( m o n o fc e r r f u nt f 讯g e t sb a s e do nd n a o u g o n u c l e o t i d e sa n d i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ew o r ki sf o c u s e do nd e v e l o p i n gl a b e l f r e ec o l o r i m e t r i c a s s a ym e t h o d sb a s e d o nd n a n a n o p a r t i c l e s ( 1 ) t a k i n ga d v a n t a g eo ft - h 9 2 + - t c o o r d i n a t i o nc h e m i s t r ya sw e l la st h ed i f f e r e n ti n t e r a c t i o n sb e t w e e ns s d 瞄氏心晤s a n dd s d n a a u n p s ，ac o l o r i m e t r i cd e t e c t i o nm e t h o df o ru g 十w a sd e v e l o p e d c o m p l e m e n t a r yd n as t a n d sw i t hc e r t a i nn u m b e ro ft - tm i s m a t c h e sc o u l dn o t h y b r i d i z et h u s r e t a i n e dr a n d o m c o i ls i n g l e s t r a n d e ds t a t e ，w h i c hc o u l de f f e c t i v e l y p r o t e c ta u n p sf r o ms a l t i n d u c e da g g r e g a t i o n h 9 2 + m e d i a t e db t b a s ep a i r sl e a dt ot h e f o r m a t i o no fd u p l e x e sa n dt h er i g i ds t r u c t u r e sl o s tt h ep r o t e c t i n ga b i l i t yf o ra u n p s ， t h u sa u n p sa g g r e g a t e da f t e rs a l ta d d i t i o n ，a c c o m p a n y i n gb yac o l o rc h a n g ef r o mr e d t ob l u e t h ea s s a yr e g i o n ，l i n e a rr a n g ea n dd e t e c t i o nl i m i tc o u l db et u n e db yr a t i o n a l l y v a r y i n gt h en u m b e ro ft - tm i s m a t c h e si nd n ad u p l e x e s al o wp r o p o r t i o no ft - t m i s m a t c h e sa c c o u n t e df o ras e n s i t i v ed e t e c t i o nr a n g ea n dal o wd e t e c t i o nl i m i t ，w h i l ea h i g hp r o p o r t i o nb r o u g h ta ne n l a r g e dd e t e c t i o nr a n g ea n dah i 【g hu p p e rd e t e c t i o nl i m i t t h i ss t r a t e g ym i g h tb ep o t e n t i a l l ye n l a r g e dt od i s t i n g u i s ho t h e rm e t a li o n s ，l i g a n d so r d r u g si n t e r a c t i n gs p e c i a l l yw i t hc e r t a i nb a s e si nn u c l e o t i d e s ( 2 ) b a s e do na n i n v e s t i g a t i o ni n t ou n m o d i f i e dd n aa d s o r p t i o no n t oa g n e s ，u n m o d i f i e dd n aa n d a g n p sw e r eu t i l i z e dt od e v e l o pan o v e lc o l o r i m e t r i cm e t h o df o rd i s t i n g u i s h i n gl i g a n d s b i n d i n gt oh o m o a d e n i n e ( h e r ec o r a l y n ew a su s e d ) a d e n i n ed e o x y n u c l e o s i d es h o w e da h i g ha f f i n i t y t o a g n e sa n dt h e h o m o a d e n i n es e q u e n c es t a b i l i z e dn a n o p a r t i c l e s e f f e c t i v e l y t h ep r e s e n c eo fl i g a n d sb i n d i n g t oh o m o a d e n i n ec o u l db i n dt ot h e a d s o r b e ds e q u e n c e sa n dt a k et h e ma w a yf r o mt h es u r f a c eo fa g n e s ，t h u st h ea g n p s w e r el e s sw e l lp r o t e c t e da n da g g r e g a t e da f t e rs a l ta d d i t i o n ，a c c o m p a n y i n gb yac o l o r c h a n g ef r o my e l l o wt ob r o w n t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tal a b e l f r e ec o l o r i m e t r i c a s s a yb a s e do nd n a a g n p sc o u l db ea c h i e v e d m e a n w h i l e ，t h et a r g e t sc o u l db es m a l l m o l e c u l e sr a t h e rt h a no l i g o n u c l e o t i d e si nd n a a g n p ss y s t e m s k e yw o r d sd n a o l i g o n u c l e o t i d e s ，n a n o p a r t i c l e s ，c o l o r i m e t r i ca s s a y , l a b e l f r e e 目录 第一章前言1 1 1脱氧核糖核酸d n a 1 1 1 1d n a 的基本介绍1 1 1 2 实验用d n a 的相关说明3 1 1 3d n a 的识别作用6 1 2贵金属纳米粒子简介7 1 2 1纳米粒子简介7 1 2 2贵金属纳米粒子的光学性质8 1 3d n a 在分析化学中的应用9 1 3 1基于d n a 的比色法9 1 3 2基于d n a 的电化学方法1 6 1 3 3基于d n a 的荧光法。2 3 第二章d n a 金纳米粒子体系免标记比色测定汞离子( h 矿+ ) 3 0 2 1 弓l 言3 0 2 2实验部分3 1 2 2 1药品和试剂3 1 2 2 2 仪器设备3 2 2 2 3金纳米粒子合成3 2 2 2 4 比色检测i c + 离子3 2 2 3结果与讨论3 3 2 3 1 d n a l d n a 2 a u n p s 体系对h g + 的检测3 3 2 3 2 d n a l d n a 2 a u n p s 体系的检测范围：3 6 2 3 3增加t - t 不配对碱基后溶液的颜色变化3 8 2 3 4 d n a 3 d n a 4 a u n p s 和d n a s d n a 6 a u n p s 体系测定h 9 2 + 3 9 2 3 5 传感器的选择性4 1 2 4结论4 2 第三章d n a - 银纳米粒子体系免标记比色测定小分子。4 4 3 1 弓i 言z m 3 2 实验部分。4 5 3 2 1 药品和试剂4 5 3 2 2 仪器设备4 5 3 2 3 银纳米粒子合成。4 5 3 2 4 吸附考察和测定步骤4 5 3 3 结果与讨论4 6 3 3 1 未修饰d n a 在a g n p s 表面吸附的比色考察4 6 3 3 2 比色测定c o r a l y n e 4 7 3 3 3 比色传感器的选择性5 0 3 4 小结5 1 参考文献5 3 结论6 7 致谢6 8 攻读学位期间发表的学术论文目录6 9 声明7 0 1 1 1 1 1 核酸( n u c l e i ca c i d ) 是重要的生物大分子，是生物化学和分子生物学研究的重要对 象和领域。核酸有两类，即脱氧核糖核酸( d e o x y n u c l e i ca c i d ，d n a ) 和核糖核酸 ( r i b o n u c l e i ca c i d ，r n a ) 1 1 。所有生物细胞都含有这两类核酸。生物机体的遗传信 息以密码形式编码在核酸分子上，表现为特定的核苷酸序列。d n a 是主要的遗传 物质，通过复制而将遗传信息由亲代传给子代。r n a 则与遗传信息在子代的表达 有关。核酸是一种多聚核苷酸( p o l y n u c l e o t i d e ) ，它的基本单位是核苷酸( n u c l e o t i d e ) 。 核苷酸还可以进一步分成核苷和磷酸，核苷再进一步分解生成戊糖和碱基。由此， 核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。d n a 的结构单位是脱氧( 核糖) 核苷酸 f d e o x y ( r i b o ) n u c l e o t i d e ，r n a 的结构单位是( 核糖) 核苷酸 ( d b o ) n u c l e o t i d e 。两 种核苷酸的化学结构相同，只是所含戊糖不同。图1 - 1 ( a ) 给出了5 一腺嘌呤核苷酸 和5 腺嘌呤脱氧核苷酸的分子式，脱氧核苷酸在核苷酸的2 c 原子位置脱去一个 氧( 注意，在表示说明时，糖环中的碳原子标号右上角加“ ，碱基中的原子标 号不加，以示区别) 。核糖核苷的糖环上有3 个自由羟基，能形成3 种不同的核 苷酸( 即2 一，3 或5 核糖核苷酸) ；脱氧核苷的糖环上只有两个自由羟基，所 以只能形成两种核苷酸( 即3 或5 脱氧核糖核苷酸) 。需要指出，生物体内游离 存在的多是5 核苷酸。 d n a 分子由c 、h 、o 、n 、p 等元素组成；与蛋白质相比较，d n a 一般不 含s 元素。d n a 含有四种脱氧核糖核苷酸单体，为腺嘌呤脱氧核苷酸( a d e n i n e d e o x y n u c l e o t i d e ，也写为a d e n i n ed e o x y n u c l e o s i d e ，简写为舢，胸腺嘧啶脱氧核苷 酸( t h y m i n ed e o x y n u c l e o t i d e ，简写为r ) ，鸟嘌呤脱氧核苷酸( g u a n i n e d e o x y n u c l e o t i d e ，简写为g ) 和胞嘧啶脱氧核苷酸( c y t o s i n ed e o x y n u c l e o t i d e ，简写为 c ) 。相比之下，组成r n a 的四种核糖核苷酸是腺嘌呤核苷酸( a d e n i n e r i b o n u c l e o t i d e ，简写为a ) ，尿嘧啶核苷酸( u r i n er i b o n u c l e o t i d e ，简写为们，鸟嘌 呤核苷酸( g u a n i n er i b o n u c l e o t i d e ，简写为g ) 和胞嘧啶核苷酸( c y t o s i n e r i b o n u c l e o t i d e ，简写为q 。r n a 分子中也有某些稀有碱基。单体脱氧核糖核苷酸 基于d n a 寡聚核酸链和纳米粒子体系对目标物的免标记比色测定 或单体核糖核苷酸通过3 ，5 磷酸二酯键串连形成多聚体，即分别形成脱氧核糖 核酸d n a 和核糖核酸r n a 。 1 9 5 3 年，美国的j a m e sw a t s o n 和英国的f r a n c i sc r i c k 提出d n a 双螺旋结构 模型1 2 - 3 ，为分子生物学的发展奠定了基础。这种d n a 结构的平均特征继而由后 人通过对多聚脱氧核糖核苷酸晶体的x 射线衍射分析做了修改和补充，其模型结 构作如下介绍。两条反向平行的脱氧核糖核酸链围绕同一中心轴相互缠绕。嘌呤 与嘧啶碱基位于双螺旋的内侧；核糖与磷酸在外侧，其通过3 ，5 磷酸二酯键相 连接，形成d n a 分子的骨架。碱基的平面与纵轴垂直，糖环的平面则与纵轴平 行。两条核酸链彼此依靠碱基之间形成的氢键相连而结合在一起。碱基之间所形 成的氢键，a 只能与t 相配对，形成两个氢键；g 与c 相配对，形成三个氢键； 由此g c 之间的连接较为稳定。碱基配对中的氢键连接情况详见图1 - 1 ( b ) ，箭头 处为氢键。组成碱基对的两个碱基平面并非在同一平面上，而是碱基对沿长轴旋 转一定角度，使碱基对形状类似螺旋桨叶片，称螺旋桨状扭曲。这种结构可以提 高碱基堆积力，使d n a 结构更稳定。对一条d n a 链而言，碱基的排列顺序不受 限制。由碱基配对原则，一条d n a 链的序列确定后，即可决定另一条互补链的 序列，表明遗传信息由碱基的序列所携带。每个d n a 分子的碱基都有其特定的 排列顺序，使得d n a 分子具有特异性并携带其相应遗传信息。d n a 的一级结构 是指脱氧核苷酸的排列顺序。对二级结构而言，除大部分d n a 在细胞中的构象 是b d n a 外，还包括a - d n a 、h d n a 和左手螺旋的z - d n a 以及十字形d n a 。 此外，d n a 双螺旋分子在空间可以进一步折叠或环绕成为更复杂的结构即超螺 旋，形成三级结构。对于最常见的b d n a ，其两条链均为右手螺旋。单条脱氧核 糖核酸链具有方向性，其方向性取决于核酸问磷酸二酯键的走向；因由磷酸和戊 糖的3 、5 端相连而成，所以其两个末端分别为5 末端和3 末端。两条链配对偏 向一侧，在空间上形成有区别的大沟( m a j o rg r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) 。双螺旋 的平均直径为2n m ，两个相邻的碱基对之问的相距高度即碱基堆积距离为o 3 4 n l l l ，每个碱基沿轴旋转3 6 。沿中心轴每旋转一周有1 0 个核苷酸，因此双螺旋 的螺距( 每一转的高度) 为3 4n m 。需要指出，这种二级结构并不是绝对的均一。 如在i cd i c k e r s o n 等人所研究的人工合成的十二聚体脱氧核糖核苷酸结构中，实 际平均每旋转一周包含1 0 4 个碱基对，两个碱基的夹角可由2 8 。至4 2 。不等， 分子大小的参数也随序列不同而有变动。b 一型d n a 大致的双螺旋结构图请参见图 l 一1 ( c ) 。 2 青岛科技大学研究生学位论文 ( a ) ( b ) 伊b 固弘 。一 譬管s ，- 陋 t h 厂n 丫n o ， h - n i h h a hh c 磁孙 矗 7 g 图1 1d n a 的基本组成。( a ) 5 一腺嘌呤核苷酸和5 腺嘌呤脱氧核苷酸的分子结构式。 ( b ) d n a 分子中的a - t ，g - c 碱基配对。( c ) d n a 双螺旋结构模型( 本实验室绘制) 。 f i g u r e1 - 1 i l l u s t r a t i o no ft h ec o n s t i t u t i o no fd n a ( a ) m o l e c u l a rs t r u c t u r e so f5 一a d e n i n e r i b o n u c l e o t i d ea n d5 - a d e n i n ed e o x y n u c l e o t i d e 0 3 ) s t r u c t u r e so f a - ta n dg - cb a s ep a i r si nd n a ( c ) m o d e lo ft h ed n ad u p l e xs t r u c t u r e ( d r a w nb y o u r l a b o r a t o r y ) d n a 通常为双链结构，含有d 2 脱氧核糖，并以胸腺嘧啶取代r n a 中的尿 嘧啶，使d n a 分子稳定并便于复制。相比之下，r n a 为单链结构，含有d 核糖 和尿嘧啶( 另外三种碱基两者相同) ，与其遗传信息的表达和信息加工机制的功能 有关。 1 1 2 实验用d n a 的相关说明 这里，首先要明确天然d n a 和人工合成d n a 。天然d n a 多是自动物体内 提取的，如比较常用的小牛胸腺d n a 钠盐( d n a s o d i u ms a l tf r o mc a l f t h y m u s ) 。 天然d n a 多为双链结构，且碱基数目多，通常含有几百至上千个碱基，碱基次 序不确定。实验时如需进行单链d n a 实验，可以通过热变性的方法使双链解开， 即沸水浴变性后立即冰浴。人工合成d n a 多是通过标准氨基磷酸酯化学法 ( s t a n d a r dp h o s p h o r a m i d i t ec h e m i s t r y ) 使用d n a 合成仪( d n as y n t h e s i z e r ) 合成，可以 3 基于d n a 寡聚核酸链和纳米粒子体系对目标物的免标记比色测定 根据设计好的碱基顺序合成相应的d n a 序列。人工合成d n a 为单链d n a ，序 列相对较短，一般在两百个碱基以下。天然d n a 和人工合成d n a 在不同实验中 各有用途。 定量d n a 浓度比较准确的方法是将固态d n a 溶解在水或实验用缓冲溶液 中，扣除相应的基线信号后，测定其在2 6 0a m 附近的吸光度值。对天然d n a ， 碱基的平均摩尔消光系数为s ( d ) 【) = 6 6 0 0m 。1c m 一，碱基对的平均摩尔消光系数 为( d = 1 3 2 0 0m 1c m 。对人工合成d n a ，每个碱基的摩尔消光系数为：a 碱基8 ( d a ) = 1 5 4 0 0m 1c m ，g 碱基s 似g ) = 1 1 5 0 0m dc m ，c 碱基8 ( d c ) = 7 4 0 0 m - 1c m 一，t 碱基，r ) = 8 7 0 0m dc i i l 一；一条d n a 序列的摩尔消光系数由此序列 中的每个碱基的摩尔消光系数求和得到。测得吸光度后，由朗伯比尔定律a = 曲c 求算出对应的浓度。一般的，双链d n a 的吸光度测定值要小于此双链变性后分 开的两条单链d n a 的吸光度测定值，这与形成双链d n a 时碱基包被在磷酸骨架 内部导致其光吸收能力下降有关。由此，在升温实验中2 6 0n m 处吸光度值的变 化是一重要参数。d n a 变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度 范围内，有一个相变的过程。通常把加热变性使d n a 双螺旋结构失去一半时的 温度称为该d n a 的熔解温度或热解旋温度，用t m 表示，可以将对热变性曲线求 导之后的一次导数曲线峰值对应的温度作为t m 。需要指出，在实验中有时仅对单 链d n a 做升温实验也会产生2 6 0a m 处吸光度值的增加，这很可能是单链d n a 本身形成的二级结构随温度升高逐渐解开成自由舒展状的结果。天然d n a 样品 的纯度可以用紫外分光光度法进行判断，判断依据是a 2 伽8 0 比值( 2 6 0n m 处与2 8 0n m 处吸光度之比) ，纯的天然d n a 其比值应大于1 8 。核酸在2 6 0n m 处有强吸收，蛋白质在2 8 0n m 处有强吸收，由此比值越高代表从生物体内提取 的核酸越纯( 最高可达2 0 ) 。由于人工合成d n a 中各个碱基比例可能很不相同， 加之少有蛋白质的影响，因此不能用a 2 删8 0 比值来判断人工合成d n a 的纯 度。 人工合成d n a 除可根据实验需要设计合成不同的序列外，另一大优点是可 以进行特定基团的修饰。这些基团按照其修饰目的，可以大致分类如下。( 一) 用以键合d n a 分子到基底表面的基团。一般来讲，这些基团修饰在d n a 分子的 末端。比如，毓基( 一s h ) 修饰d n a 可通过s - a u 作用键合到金基底上，氨基( 。n h 2 ) 修饰d n a 可以键合到硅基底上，生物素( b i o t i n ) 修饰d n a 可以键合到亲和素 ( s t r e p t a v i d i n ) 基底上。这些基底可以是平面如工作电极表面，也可以是曲面如 球形纳米粒子表面。除了依靠直接的基团基底作用力修饰外，通过基团的化学反 应也可以完成d n a 的固定。如通过氨 应，使d n a 固定在修饰有这些含氧基 青岛科技大学研究生学位论文 通过基团的化学反应连接上能产生响应信号的其他分子，如氨基修饰d n a 通过 n h s e d c 反应键合电活性分子二茂铁( f c ) 。( 二) 荧光基团和淬灭基团。这类 基团能够产生可检测的荧光信号，用以分析d n a 自身构象或周围环境的变化。 如果只修饰了荧光基团，其原理多是基于荧光共振能量转移( h u o r e s c c n c c r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 或是荧光极化( f l u o r e s c e n c cp o l a r i z a t i o n ，f p ) 方法，这两种方法中荧光信号可随自身或周围环境改变而有所不同。如修饰有荧 光基团和淬灭基团，则可以根据两基团靠近时荧光信号降低、远离时荧光信号增 加的基本原理对d n a 二级结构或周围环境做出判断。这罩，荧光基团和淬灭基 团可以同时修饰在一条d n a 链上，也可以分别修饰在两条d n a 链上；荧光基团 或淬灭基团不仅可以修饰在d n a 链的末端，也可以修饰在d n a 链中的相邻碱基 之间。此外，多种不同吸收、发射波长的荧光基团，也为在多组分同时测定中提 供了选择。( 三) 其他修饰基团，如磷酸化修饰基团、地高辛修饰基团等，与前 两种基团比较应用较少。最后，还有两种特殊的化学合成的d n a 类似物需要说 明。其一是肽核酸( p e p t i d en u c l e i c a c i d s ，p n a ) 。肽核酸是d n a 的类似物，d n a 中整个负电性的戊糖磷酸骨架被电中性的聚酰胺( p o l y a m i d e ) 骨架所代替，由 此p n a 为电中性。p n a 已经被用于荧光f 4 】或比色 5 - 6 1 分析d n a 中。其二是锁核 酸( l o c k e dn u c l e i c a c i d ，l n a ) 7 1 。在d n a 碱基中增加一个亚甲基( - c h 2 ) 将 戊糖上2 端氧原子和4 碳原子连接起来，使得戊糖自锁为双环结构( 一个是戊糖 环，另一个是2 、3 、4 碳原子与氧原子和亚甲基的碳原子组成的五元环) ，便得 到高刚性结构的l n a 碱基。加入l n a 碱基后，形成的配对碱基的稳定性也被认 为有所增) j h t s j 。这些新的d n a 类似物的合成因其本身自d n a 结构衍生而来，同 时又具备某些d n a 所没有的性质，也开始用于d n a 相关实验中。 另外还有必要介绍一下凝胶电泳。d n a 实验中常用到凝胶电泳。d n a 磷酸 骨架带有负电性，因而在外加电场作用下d n a 可以由负极向正极运动。不同片 段大小的d n a 在凝胶孔径中的迁移率不同，由此可以将不同相对分子质量的 d n a 分开。同时，迁移率还取决于d n a 的二级结构，如线性d n a 比环状d n a 迁移率快。基本的两种电泳方法为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂 糖凝胶电泳在水平电泳槽中进行，对1 0 0 0 个碱基m p ) 以上的d n a 片段的分离效 果较好；在高质量分数凝胶浓度时，也可以分离几十至上百碱基长度的d n a 。聚 丙烯酰胺凝胶电泳在垂直电泳槽中进行，由于凝胶孔径比琼脂糖要小，所以可分 离1 0 0 0 个碱基以下的d n a 片段；在高质量分数凝胶浓度时，可以将十几至几十 碱基长度的d n a 分开。d n a 电泳完成后，凝胶一般需要用荧光染料染色，然后 在紫外光照射下观察泳带。也可将d n a 染料加在电泳缓冲液中，电泳结束后直 接在紫外灯下观察。 5 基t - d n a 寡聚核酸链和纳米粒子体系对目标物的免标记比色测定 1 1 3d n a 的识别作用 d n a 可以天然地完成对其互补序列的识别，即嘌呤碱基对嘧啶碱基的识别作 用，基于a - t 、g c 碱基配对原则。对一个双链d n a ，可以将其中的一条链作为 探针d n a ( p r o b ed n a ) ，用以识别其互补链即目标d n a ( t a r g e td n a ) 。在科 学研究中，为使d n a 检测特异性好、灵敏度高，探针d n a 设计已不再局限于杂 交双链中的单链序列，可在原序列基础上增加或拆分碱基，如茎环结构 ( s t e m l o o p ) 的分子信标( m o l e c u l a rb e a c o n 。m b ) 、三颈式结构( t r i p l e s t e m ) d n a 、d n a 三明治结构( 将探针链拆分为捕获探针c a p t u r ep r o b e 和报告探针 r e p o r t e rp r o b e ) 等的应用。基于d n a 对互补链的识别作用，一系列大量的d n a 生物传感器发展起来。 d n a 作为识别单元，另一重要应用就是其本身作为适配体( 也称为适配子) 对于目标物的识别。1 9 9 0 年，美国的两个研究小组独立报道了利用体外筛选技术 获得与目标物具有高亲和力和高特异性的r n a 分子i 0 1 ，开创了科学研究中的适 配体时代，改变了传统意义上核酸只作为遗传信息储存和转运载体的认识。其后， 这种体外筛选技术也被用于d n a 分子的筛选。由于d n a 本身较r n a 稳定，加 之d n a 合成成本比r n a 合成低廉，因此常用筛选的d n a 片断作为与目标物特 异性作用的寡聚核酸分子。适配子( a p t a m e r ) 的定义一般为：本质上是单链寡聚 核苷酸片断，可以是单链d n a 或r n a ，能与靶分子高亲和力、高特异性结合。 高亲和力是指，适配子与其相应靶分子结合力强，解离常数( d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t , ) 通常在n m 甚至p m 级。适配子与靶分子之间的作用力主要是氢键、疏水作 用、范德华力。文献报道，适配子与目标物的结合力常大于其与互补链的结合力， 即可以实现由适配子互补链的双链结构向适配子目标物的复合体结构转变。高 特异性是指，适配子能够区分和识别靶分子的微观结构。体现适配子高特异性的 一个经典例子是：茶碱( t h e o p h y l l i n e ) 和咖啡因( c a f f e i n e ) 的分子结构仅差别一 个甲基，但茶碱适配子对茶碱的亲和力比咖啡因高1 0 ，0 0 0 倍【1 1 】。适配子筛选的方 法称为配体指数增强系统进化技术( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb y e x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 。在s e l e x 技术中，首先建立一个随机核酸库， 将靶分子在一定的缓冲条件下与文库里的分子培育，然后分离与靶分子结合的核 酸。分离出的核酸进行p c r 扩增，作为下一轮筛选使用的模板。随筛选轮数的增 加，寡聚核苷酸与靶分子的亲和力逐渐增强，最后得到亲和力和特异性很高的核 酸识体。将此核酸识体进行测序和分析，可以获知高亲和力寡聚核苷酸的序列和 特征。s e l e x 技术分正选技术和反选技术。正选技术中，在一次循环后将与目标 物亲和作用强的核酸链分离出来，进行p c r 扩增，将扩增后的核酸库用于下一轮 筛选。反选技术中，与干扰物或对比物作用强的核酸首先被弃掉，然后在剩余的 6 青岛科技大学研究生学位论文 核酸库中作目标物的筛选。通过s e l e x 技术，原则上可以筛选出能结合任意靶 分子的核酸识体。适配子所能识别的靶分子的范围很广，包括小分子、金属离子、 多肽、蛋白质、细菌和细胞等。适配子对目标物的亲和力和特异性与抗体相当或 优于抗体，并且与抗体相比其还具有其自身优势。适配子可以化学合成，抗体生 产则多需要细胞培养或自动物体内提取；适配子可以变性后复性，而作为蛋白质 的抗体变性后则会失活。此外，适配子可以修饰不同功能的基团，这使其在分析 手段和分析方法方面较抗体技术更加丰富。适配子与目标物的结合是相互诱导的 适应性识别，结合时多数适配子会发生适应性折叠，自身构象发生变化，形成稳 定的二级结构，如发夹( h a i r p i n ) 、假结( p s e u d o k n o t ) 、凸环( b u l g e ) 、g 四分体 ( g q u a r t e t ) 等，决定这些结构的碱基往往是与配体结合的重要位点。适配子结 合目标物前后的构象变化这一重要性质也成为建立基于适配子的分析方法的切 入点之一。 d n a 酶( d n a z y m e s ，d n ae n z y m e s ，o rc a t a l y t i cd n a ) 是通过体外筛选的、 在某种会属离子存在时显示出高催化活性的脱氧核酸酶( d e o x y r i b o z y m e ) 。将金 属离子作为靶分子时，由于缺乏一个良好的固定金属离子的方法，所以对金属离 子的适配子筛选难度增加。通过适体酶的筛选可以有效解决这一问题。相比于天 然存在的r n a 核酸酶( r i b o z y m e ，o rc a t a l y t i cr n a ) ，d n a 酶只能够通过体外筛 选获得。但也正是因为体外筛选时可以丰富反应的种类，相比于天然核酸酶只能 在诸如r n a 切断、结合等少数反应中起催化作用，这种“人造核酸酶 的催化 能力可以延伸到磷酸化反应、聚合反应、醛还原、d i e l s a l d e r 反应等其他反应中。 大多数d n a 酶需要金属离子的参与来发挥其催化活性，有些d n a 酶则只能依赖 于特定的金属离子。由此，这部分d n a 酶可以用来分析检测金属离子。在这些 分析中，目标金属离子扮演辅助因子( c o f a c t o r ) 的角色，用来加速或抑制催化反 应的进行。适配子与核酸酶( n u c l e i c a c i de n z y m e ，n a e ) 结合使用，得到了变构 核酸酶( a l l o s t e r i cn a e ) 或适体酶( a p t a z y m e ) 。适配子、核酸酶和适体酶统称为 功能化核酸( f u n c t i o n a ln u c l e i ca c i d f n a ) 1 2 】。 1 2 贵金属纳米粒子简介 1 2 1 纳米粒子简介 纳米( r i m ) 是一个长度计量单位，1 纳米等于1 0 母米。纳米材料广义上指在 三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围( 1 1 0 0r i m ) ( 称纳米相材料，n a n o p h a s e m a t e r i a l s ) 或由它们作为基本单元组装而成的结构材料( 称纳米结构材料， n a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a l s ) 。其中纳米相材料包括：空间三维均在纳米尺度的纳米粒 子( 零维单元) 、空间有两维处于纳米尺度的纳米棒、纳米线和纳米管( 一维单 7 基丁d n a 寡聚核酸链和纳米粒子体系对目标物的免标记比色测定 元) 、三维空间只有一维在纳米尺度的纳米薄膜( 二维单元) 以及多孔材料。纳 米材料介于原子( 或分子) 和本体材料之间，表现出许多区别于宏观体相的性质 和规律，如体积效应、表面效应、宏观量子隧道效应等，体现为材料本身独特的 光、电、热、化学或力学性能。一般来说有两种方法可以合成纳米粒子：自上而 下( t o p d o w n ) 和自下而上( b o t t o m u p ) 。前者是将宏观粒子尺寸减小到纳米尺 度，后者是从原子开始使原子聚合产生纳米尺度的粒子。纳米材料基本的表征方 法有：用于形貌表征的扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p e ，s t m ) 、 扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，s e m ) 、透射电子显微镜 ( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t e m ) 和原子力显微镜( a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p e ，a f m ) ，用于成分分析和结构分析的x 射线光电子能谱( x r a y p h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y , x p s ) 和x 射线衍射法( x - r a yd i f f r a c t i o n ，x r d ) ，用 于物理化学性质分析的紫外可见吸收光谱法( u v - v i sa b s o r p t i o ns p e c t r a ) 、红外 吸收光谱法( i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y , i r ) 、原子力显微镜( a f m ) 和核磁共振波谱法 ( n u d e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es p e c t r o s c o p y , n m r ) 等等。 1 2 2 贵金属纳米粒子的光学性质 贵金属纳米粒子主要指金纳米粒子、银纳米粒子和铂纳米粒子等。本论文工 作主要利用金、银纳米粒子的光学性质，对这两种粒子介绍如下。 金纳米粒子具有优异的光学、电学、催化性能，在化学研究中被广泛应用。 金纳米粒子的合成主要由柠檬酸钠还原氯金酸( h a u c l 4 ) 制得，柠檬酸钠自身也 作为保护剂。1 3 衄球形金纳米粒子在5 2 01 1 1 1 1 有特征吸收峰，因而显示出酒红色。 金纳米粒子的特征吸收峰位置随金纳米粒子粒径的改变而变化，且对应的摩尔消 光系数也会有所不同【1 3 】。1 3n l l l 金纳米粒子的表面等离子体共振吸收( s p r ) 强 烈依赖于其粒子问的距离( 或表述为粒子聚集程度) ，聚集后的金纳米粒子s p r 吸收峰红移，金溶胶颜色显示为紫色或蓝色。金纳米粒子的这种独特的光学性质 成为其在比色分析中转导信号的基本依据。 银纳米粒子具有与金纳米粒子相当的光学性质，且银纳米粒子的摩尔消光系 数较相同粒径大小的金纳米粒子摩尔消光系数更高。银纳米粒子的制备可通过加 热硝酸银与柠檬酸钠的混合溶液制得；或以柠檬酸钠作保护剂，用硼氢化钠还原 硝酸银制得。银纳米粒子显黄色，在4 0 0n r n 附近有特征吸收峰，其光学性质亦 与粒子间的距离密切相关。在使用紫外可见分光光度计测量中，由于银纳米粒子 的摩尔消光系数较大，其所对应的可见吸光光度值通常很高，可能会超出仪器的 检测范围，使最大吸收峰以极不稳定的毛刺峰出现。因此与金纳米相比，银纳米 粒子需要在原始合成的银溶胶基础上稀释更多才方便于分析。比如以硼氢化钠为 还原剂，以柠檬酸钠为保护剂合成的银纳米粒子，其稀释5 - 6 倍后可以获得稳定 8 青岛科技人学研究生学位论文 的最大吸收波长处的吸光度信号。 1 3d n a 在分析化学中的应用 如前