蛋白电泳与转膜.ppt

实验5电泳技术,2014-11-03,5.1电泳技术分类,5.1.1电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。5.1.2电泳技术：1936年瑞典学者蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定的技术。在生命科学研究中电泳技术主要用于蛋白质、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物质的分离和对分离物质的纯度与分子量的测定。,5.1.3电泳技术的分类：自由界面电泳：是不含支持物的电泳。溶质在自由溶液中泳动，故也称自由电泳，适用于高分子的检测，但不易完全分离。区带电泳：是含有支持物的电泳，支持物上混合样品被置于狭小的区带中泳动，分离出彼此分离的区带。支持物有很多种，由此又衍生出区带电泳的不同分支。,在生物技术研究中区带电泳应用最为广泛！区带电泳的分类：（1）按支持物的物理性状不同分为：纸电泳：支持物为滤纸;粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳；凝胶电泳：淀粉胶，琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶电泳；缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳（2）按支持物的装置形式不同分为：水平板电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式；垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。柱状（管状）电泳：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳。,凝胶电泳（以蛋白分离为例）：（1）单向电泳：在聚丙烯酰胺凝胶上分离，适于分离种类较少的蛋白。（2）双向电泳：第一向使用预制胶条进行蛋白质的等电聚焦分离，第二向将胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质的分子量大小与第一向相垂直分离。用于蛋白质的分离，可将提取的蛋白质混合物中数千种蛋白质同时分离开。,5.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,5.2.1背景介绍：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳于1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。,5.2.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：（1）阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。（2）结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。（3）这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。,浓缩胶,电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。Gly-Pro-Cl-,-,+,分离胶,孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电厂消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子量不同,通过分离胶受到的阻力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白的分子量不同而分开.Pro1-Pro2Gly-Cl-,-,+,积层胶,分离胶,SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随“甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近1：20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29配制，试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。,凝胶分离范围,凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用515%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：,双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为1：29,5.2.3体系中各成分的作用：（1）SDS作用：SDS是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量，SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。（2）电泳缓冲液中甘氨酸作用：样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界,而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。,（3）上样缓冲液作用：蛋白上样缓冲液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿。,5.2.4实验步骤：制胶灌胶（灌分离胶加蒸馏水灌浓缩胶）插入梳子加缓冲液（上、下两部分）拔掉梳子加样品盖上盖子，接通电泳仪电源染色脱色,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片,5.2.5实验注意事项（1）形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：丙烯酰胺、线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。（2）TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化产物呈黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。（3）过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂凝胶)。,（4）激活剂的用量:激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。（5）温度的影响：聚胶的最佳温度为2325，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。（6）氧气的影响：氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度(125torr)脱气至少15min。（7）凝胶添加剂：凝胶中常常加入SDS、尿素、TritonX-100等添加剂。SDS加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。,（8）聚胶时间：虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520min即可观察到凝胶的形成，但至少需90min才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时间(完全聚合需8h)。（9）单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。（10）SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。（11）有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。,5.2.6常见问题：（1）纹理和拖尾现象：由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。（2）蛋白带过宽：与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。（3）电泳时间比正常要长：可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。（4）指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。（5）凝胶时间不对：通常胶在30min内凝聚，如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS剂不够或者失效。（6）出现“皱眉”（两边向下中间鼓起）：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。,（7）出现“鬼带”如何处理：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。（8）为什么溴酚蓝不能起到指示作用：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。,5.3转移电泳（Westernblot）,蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移固定到具有一定韧性且化学惰性的高分子支持物（如尼龙膜、硝酸纤维素NC膜、聚偏氟乙烯PVDF膜）上，以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中培育，显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白（抗原）组分。,两种常用的电转移方法是湿转和半干转,两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置有所不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽，然后加电压。这是一种有效方法，但比较慢，需要大体积缓冲液，且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移2-D电泳中常规使用的大胶比较困难。湿转系统一般在恒压条件下进行，转移过程中，混合缓冲液保持电压相对恒定。,半干转移,半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大，以便快速、有效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45分钟）又好。多数半干转移方法可以使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干印迹系统因缓冲液较少不适于较长时间转移。对于大2-D胶的印迹，半干转移是理想选择。半干印迹仪一般使用恒流条件，转移过程中电压逐渐增加。也可用恒压条件（小于25V）。,实验操作流程图,PAGE转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影,Westernblot转移膜的选择,1.孔径的选择:通常当目标分子量小于20kD时，采用孔径为0.22um的膜。一般用0.45um孔径。2.膜材料的选择1）硝酸纤维素膜(NC)：纯度很重要，纯度越高，结合蛋白越强。背景低，价格便宜。缺点是结合蛋白量比PVDF膜低。2）PVDF膜：结合蛋白质的量大，几乎是NC膜的6倍。缺点是背景高，价格贵，操作麻烦。3）尼龙膜：结合蛋白的量大，缺点是：背景高，现在很少使用。3.不同膜转移缓冲液的选择：NC膜，SDS要少。,湿转电泳,1）将转移膜剪成和凝胶一样大小。2）将PVDF膜在100%甲醇中均匀润湿（约2-3秒），再在水中漂洗2-3min，然后在转移缓冲液中平衡至少15min。3）电泳结束后，将凝胶在转移缓冲液中平衡5min。4）将凝胶置于也在缓冲液中浸泡过的Whatman3mm滤纸上，然后将PVDF膜覆于凝胶上，再盖上一张浸湿的滤纸（避免在每一层间留有气泡），最后将它们一起夹入转移盒中。5）根据需要转移的蛋白质的分子量设定恒定工作电流及转移时间，一般分子量20KD的蛋白质从0.5mm厚的凝胶上转移可设电压50V，时间约需10-30min，分子量大的蛋白质转移需要的时间相应增加，但是在实验中可以发现，蛋白质的分子量100KD时，即使转移45-60min膜上吸附的蛋白质的量仍不理想。另外，如果用Tris-甘氨酸缓冲液，电压为40V，需1-4h。6）转移完毕后将膜去下在超纯水中漂洗23次，每次5min，以洗去膜上沾有的在电泳和电印迹过程中使用的缓冲液。如果用做氨基酸分析：转移缓冲液首选CAPS，这是因为CAPS对以后的氨基酸组成分析、蛋白质序列测定影响小，另外CAPS在pH11时有很好的缓冲能力，并保证绝大多数蛋白质