（分析化学专业论文）基于聚合物膜的新型免疫传感器研究.pdf

复旦大学硕士学位论文基于t t 奢, o 膜的新型免疫传感器研究 摘要 免疫传感器是根据抗原抗体之间的特异识别原理而制得的生物传感器，具 有选择性高、分析速度快、操作简便的特点。免疫传感器结合了生物、化学、医 学、电子等多门学科技术，广泛应用于生物医学、环境检测、食品医药等领域。 随着生物技术和电子技术的迅速发展，免疫传感器技术已经发展成为一个独立的 新兴领域。目前，免疫传感器的研究日新月异，并正朝微型化、集成化和智能化 的方向迅速发展，已经成为分析化学领域的研究热点。 高分子聚合物的发展为免疫传感生物识别膜的制备提供了一种新方法。以导 电聚合物为载体或包埋材料可以方便快捷地固定生物活性分子( 酶，抗原、抗体 等) 。导电聚合物的高导电性有利于保持蛋白的生物活性，通过氧化态与还原态 之间的相互转化方便的将生物分子掺杂进聚合物膜中，聚合物的聚合与生物识别 分子的固定可一步完成：同时通过改变电聚合参数，可以控制膜的结构和厚度， 达到提高检测限的目的。实验中采用电镀邻苯二胺绝缘膜的方法成功在玻碳电极 上制各电容型免疫传感器，用于转铁蛋白分子的检测。同时采用导电聚合物吡咯 制备免疫传感器，在梳状结构的芯片电极上分别修饰三种抗体，建立了检测三种 肝纤维化标志物的免疫传感器，获得较高的灵敏度和较宽的检测范围。 论文分为三章： 一免疫传感器概述 概要介绍了免疫传感器的原理、免疫传感器的制各方法、免疫传感器的检测 方法，以及本论文的意义。 二基于电聚绝缘膜在玻碳电极上制备电容型免疫传感器 采用硫醇的自组装技术( s a m ) 是目前电容型生物传感器的主要制备方法， 虽然金电极自组装技术可以得到有序，高密堆积和高机械稳定的单分子膜，但是 也存在固有的缺陷，在实际检测中有一些问题，例如必须采用金等贵重金属作为 电极材料；传感器整个制备过程复杂：使用后的免疫传感器无法通过酸洗脱再生 等。实验中采用电镀邻苯二胺绝缘膜的方法成功在玻碳电极上制备电容型免疫传 感器，实现对转铁蛋白的检测。实验中分别采用共价键交联和共聚的方法在聚邻 苯二胺膜修饰的玻碳电极上制备转铁蛋白免疫传感器，利用电位阶跃法研究该传 感器对目标抗原的响应。共价键交联的方法制备的转铁蛋白免疫传感器检测范围 为0 卜4 5 0n g m l ，灵敏度为o 0 6 1n g m l ，共聚的方法制备的转铁蛋白免疫传 复旦大学硕士学位论文基于聚合物膜的新型免疫传感器研究 感器检测范围为5 o 一1 7 5n g m l ，灵敏度为2 0n g m c 。两种方法制各的免疫传 感器均具有良好的选择性，同时共价键交联法制备的免疫传感器实现了再生。 采用电镀邻苯二胺绝缘膜制各电容型免疫传感器的方法未引入硫醇分子，突 破了硫醇的自组装技术只能适用于金电极的限制；同时传感器制备步骤简单，传 感器检测范围灵敏，可实现再生使用。这种基于碳基质的制备方法扩展了电容型 免疫传感器制备方法。 三基于导电聚合物膜的微芯片传感器对人血清中肝纤维化标志物的检测 实验中利用导电聚合物吡咯免疫传感器，在梳状结构的芯片电极上分别修 饰三种抗体，建立了检测三种肝纤维化标志物：透明质酸( h y a l u r o n a t e a c i d ，h a ) ，血清i v 型胶原( s e r u mt y p ei vp r o c o g e n ，i v 一0 、和层粘连蛋白 ( l n ) 的免疫传感器。其检测范围分别为1 0 - 9 0 0n g m l ，1 0 o - 7 0 0n g m l ， l - o 一4 0 0 n g m l 。实验数据表明，恒电流法比循环伏安法更适合于制备导电聚 合物型免疫传感器。 将恒电流法制各的吡咯膜免疫传感器其应用于三组正常人血清和模拟肝病 患者血清的肝纤维化标志物进行检测，结果令人满意，实验数据显示，其检测相 对误差小于2 0 。与传统的免疫分析法相比较，微电极芯片结合多通道检测技术 可实现对样品的多组平行检测，大大缩短分析时间，实现对复杂样品的快速、灵 敏、准确的检测。 复旦大学硕士学位论文基于聚合物膜的新型免疫传感器研究 a b s t r a c t i m m u n o s e n s o r sh a v ea t t r a c t e d g r o w i n g a t t e n t i o nw i t h a d v a n t a g e s o f h i g h s p e c i f i c i t y , s e n s i t i v i t y , q u i c k l yr e s p o n s e ，r e d u c e da s s a y t i m ea n d s a m p l e s i z e r e q u i r e m e n ta n dc o s t e f f e c t i v e n e s s t h ei m m u n o s e n s o r sc o m b i n et h eh i g hs e l e c t i v i t y a n ds p e c i f i c i t yo f i m m u n o l o g i c a lr e a c t i o nw i t hc o n v e n i e n c eo fe l e c t r o c h e m i c a la n d s p e c t r a lt e c h n i q u e s a n dc a n o p e r a t ee f f e c t i v e l y i nu n t r e a t e d s a m p l e s w i t h o u t r e q u i r e m e n tf o rs e p a r a t i o n t h e r e f o r e t h ei m m u n o s e n s o r sh a v eb e e n w i d e l ya p p l i e di n t h ed e t e r m i n a t i o no f d r u ga n d h o r m o n e si nc l i n i c a la n d p h a r m a c e u t i c a lc h e m i s t r ya n d c o n t a m i n a n t si nt h ee n v i r o n m e n t a la r e a e l e c t r o - a c t i v e p o l y m e rh a sd r a w nc o n s i d e r a b l e i n t e r e s t sf o rt h ed e t e c t i o no f b i o l o g i c a l l y m o l e c u l e si nt h e d e v e l o p m e n t o fb i o s e n s o r t h em a i n a n a l y t i c a l a d v a n t a g e o fe l e c t r o a c t i v e p o l y m e ra p p l i c a t i o n l i e si nt h e a b i l i t y t o m o d i f yt h e p o l y m e r s w i t hd i f f e r e n t b i o l o g i c a l l ym o l e c u l e s ，m a k i n gt h e mm o r e s u i t a b l ef o r d e t e c t i o no far a n g eo fa n a l y t e s t h ea b i l i t yt os y n t h e s i st h e s em a t e r i a l su n d e rm i l d c o n d i t i o n se n a b l e sar a n g eo f b i o l o g i c a lm o l e c u l e ss u c ha se n z y m e s ，a n t i b o d yt ob e i n c o r p o r a t e d i n t ot h ep o l y m e rs t r u c t u r e t h ee l e c t r o a c t i v e p o l y m e r a c t sa st h e i m m o b i l i z a t i o nm a t r i xa sw e l la st h et r a n s d u c e rt oc o n v e rac h e m i c a ls i g n a li n t oa n e l e c t r i c a ls i g n a l t h e p a p e rc o n t a i n st h r e ec h a p t e r s 1 t h ei n t r o d u c t i o no ft h ei m m u n o s e n s o r t h i s c h a p t e ri n t r o d u c e sb r i e f l yo n t h et o p i co ft h ep r i n c i p l eo ft h ei m m u n o s e n s o r t h ef a b r i c a t i o no f t h e i m m u n o s e n s o li m m u n o a s s a y a n dt h es i g n i f i c a n c eo f t h e p a p e r 2 an o v e l c a p a c i t i v e i m m u n o s e n s o r u s i n ge l e c t r o p o l y m e r i z e di n s u l a t i n gp o l y ( o p h e n y l e n e d i a m i n e ) f i l mo n t h eg l a s sc a r b o ne l e c t r o d ef o rp r o b i n gt r a n s f e r r i n a c a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o r o ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) w a sf a b r i c a t e d s u c c e s s f u l l yu s i n ga ni n s u l a t i n gp o l y ( o p h e n y l e n e d i a m i n e ) ( o p d ) f i l m t w om e t h o d s c o v a l e n t l yc o u p l i n g a n d c o p o l y m e r i z a t i o n ，w e r ed e v e l o p e d t oi m m o b i l i z et h e a n t i t r a n s f e r r i no nt h eg c ef o rp r o b i n gt r a n s f e r r i ns e n s i t i v e l y t h ec a p a c i t a n c ec h a n g e o ft h ee l e c t r o d ec a u s e db yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na n t i g e n - a n t i b o d yw a sm o n i t o r e db y t h e p o t e n t i o s t a t i c s t e p t h ei m m u n o s e n s o r sb e h a v e d h i g h l ys p e c i f i cr e s p o n s e t o i i i 蔓里大学硕士学位论支基于聚合物膜的新型免疲传感器研究 t r a n s f e r r i ni n s a m p l es o l u t i o n t h es t a b l ei n s u l t i n gp r o p e r t y o fo p df i l mm a d e i m m u n o s e n s o rr e n e w a b l ei na c i de l u t i o n f o ri m m a n o s e n s o rb yc o v a l e n t l yc o u p l i n g m e t h o d t h el i n e a rd e t e c t i o nr a n g ew a so 1t o4 5 0n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f o0 61 n g m l ( s i n = 3 ) f o ri m m u n o s e n s o rb yc o - p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d ，t h el i n e a r d e t e c t i o nr a n g ew a s5 0t o17 5 n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i t o f2 0 n g m lt h i s i n d i c a t e di m m u n o s e n s o rp r e p a r e d b yc o v a l e n t l yc o u p l i n g m e t h o ds h o w e db e t t e r s e n s i t i v i t y a n dw i d e rd e t e c t i o n r a n g e t h a nt h a to f c o - p o l y m e r i z a t i o n m e t h o d c o m p a r e dw i t hs a m s ，t h em e t h o do fu s i n gt h ei n s u l t i n go p d f i l ms i m p l i f i e dt h e p r o c e s s o fi m m t m o s e n s o rf a b r i c a t i o na n dp r o v i d e dan e wa p p r o a c ht o p r e p a r e c a p a c i t i v ei m m u n o s e n s o r o nc a r b o ns u b s t r a t e 3 ，ac o n d u c t i n g p o l y m e r - b a s e d m u l t i c h a n n e l i n t e r d i g i t a t e d e l e c t r o d e s a r r a y f o r p r o b i n gt h et h r e ec l i n i c a lm a r k e r so f l i v e rf i b r o s i si nt h eh u m a n s e r u m am u l t i - c h a n n e li m m u n o s e n s o rw a sf a b r i c a t e db yc o n d u c t i n gp o l y m e rp y r r o l e o dt h e i n t e r d i g i t a t e de l e c t r o d e sa r r a y ( i d a ) t op r o b e t h et h r e ec l i n i c a lm a r k e r so fl i v e r f i b r o s i s ( h a ，i v - c ，l n ) t h ea n t i b o a yw a si n c o r p o r a t e di n t ot h ep o l y m e rs t r u c t u r eb y g a l v a n o t a c t i cp o l y m e r i z a t i o no n t h es u r f a c eo fl d a s t h el i n e a rd e t e c t i o nr a n g eo ft h e i m m u n o s e n s o rf o rh a ，i v - ca n dl nw a si 0 9 0 0n g m l ，1 0 0 7 0 0n g m l ，1 0 - 4 0 0 n g m l u n d e ro p t i m a le x p e r i m e n t sc o n d i t i o n ，t h ei m m u n o s e n s o rw a ss u c c e s s f u l l y a p p l i e dt od e t e c tt h ec o n c e n t r a t i o no f c l i n i c a lm a r k e r so fl i v e rf i b r o s i si nt h en o r m a l h u m a ns e r u ma n dm o c k p a t i e n ts e r u m t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sl e s st h a n 2 0 f r o mt h e e x p e r i m e n t r e s u l t s c o m b i n e dw i t hm u l t i c h a n n e l t e c h n i q u e ，t h e i m m u n o s e n s o rb a s e do n , t h e i n t e r d i g i t a t e d e l e c t r o d e s a r r a yp r o v i d e d as e n s i t i v e ， q u i c k - d e t e c t i o n a n d h i g h l ye f f i c i e n tm e a s u r e m e n t f o rc l i n i c a ls a m p l e - i v 复旦大学硕士学位论文 基于聚合物膜的新型免疫传感嚣研究 第一章免疫传感器概述 免疫传感器是将特异性的免疫反应与高灵敏度的传感技术结合，用以检测抗 原一抗体反应的生物传感器【l 】。免疫传感器具有选择性高、分析速度快、操作简便 的特点。免疫传感器结合了生物、化学、医学、电子等多门学科技术，广泛应用 于生物医学、环境检测、食品医药等领域拉。随着生物技术和电子技术的迅速 发展，免疫传感器技术已经发展成为一个独立的新兴领域。目前，免疫传感器的 研究日新月异，正朝着微型化、集成化和智能化的方向发展，已经成为分析化学 领域的研究热点。 11 免疫传感器的原理【1 5 】 自然界中各种生命个体必须适应外界环境，尤其是具有抵御其它生物侵害的 能力，动物在抵御病原、微生物侵害的自主调节过程中形成免疫系统。免疫系统 包括淋巴组织、免疫活性细胞和免疫活性介质。当称为抗原的外源性物质侵入高 等动物体后，在对抗原刺激的免疫应答中，b 淋巴细胞产生一类糖蛋白，称为抗 体。抗体能与相应抗原特异性结合，产生各种免疫效应，起到对外源性物质破坏 和分解的作用。 抗体分子的基本结构可以用免疫球蛋白g ( i g g ) 亚类结构为代表加以说明。 i g g 抗体是由四条多肽链组成的大分子，包括两个完全相同的轻链和两个相同的 重链，轻链由2 1 2 个氨基酸构成，重链由4 5 0 个氨基酸构成，两者能形成一个柔 韧易弯曲的y 型结构。每一条链都有可变区v ，位于n 端，是抗原抗体的结合 位点；恒定区c 在重链中决定抗体的同种型和功能特性。轻链和重链通过非共 价键相互作用和二硫键结合。轻链和重链的v 区配对产生两个同样的抗原结合 位点，位于y 字型两臂的顶端，使得抗体分子能交联抗原。 抗原一抗体间的反应具有高度的特异性，两者的结合只局限于一些大分子的 特定部位，即抗原簇与抗体结合位点之间，以亲和力作用方式结合在一起，而不 是共价键形成。这些特定部位之间的吸引力只有在极短的距离内有效，因而抗原 簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能够产生足够的结合力。 这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。 复亘大学硕士学位论文基于聚合物膜的新型免疫传感器研究 f i g 1 1b a s i cs t r u c t u r eo f a n t i b o d y 免疫传感器能够实时检测抗原一抗体反应，有利于分析反应的动力学。同时 由于抗原一抗体间的反应高度的特异性，提高了检测的准确性。免疫传感器包括 标记型和无标记型。标记型是在分析体系中引入探针系统以实现检测，常用的标 记技术包括放射免疫法( r i a ) 、酶标记免疫分析法( e i a ) 、化学发光免疫分析 法( c l i a ) 和荧光免疫分析法( f i a ) 等1 1 6 】。近年来，以电容型免疫分析l ”。 和分子印迹技术 2 3 】为代表的无标记免疫传感器发展迅速，无标记免疫传感器灵敏 度高，操作简便，已经成为研究热点。 l2 免疫传感器的制备方法 免疫传感器根据其结构，可以分为两个部分：分子识别层和信号转换器。分 子识别层是由具有分子识别能力的生物活性物质构成，例如抗原、抗体等；信号 转换器主要是电化学或光学检测元件，例如电流、电位测量电极、压电晶体等。 当待检物与分子识别物特异结合后，产生的复合物( 或光、热等) 通过信号转换 器转变为可输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。 免疫传感器制备过程中一个非常关键的步骤是识别分子在传感器表面的固 定。识别分子的有效固定可以提高传感器的稳定性和灵敏性。目前，常用的制备 方法有：自组装单层膜技术，溶胶凝胶技术，导电聚合物包埋技术、分子印痕技 术以及直接吸附技术。 i 2 1 自组装单层膜技术 自组装单层膜( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r , s a m ) 是分子自发地化学吸附在 固液或气固界面形成热力学稳定和能量最低的有序体系，它具有高密堆积、均 匀一致和低缺陷等特性，并且通过预先设计和精确的化学控制，可获得特定的功 复旦大学硕士学位论文基于聚合物膜的新型免疫传感器研究 能。自组装单层膜具有广泛的仿生和生物亲和特性，在化学和生物传感器方面有 着广泛的应用前景。其中，有机硫醇分子在金上的自组装膜最具代表性同时广泛 应用。 1 21 1 金电极上的自组装单层膜 有机硫醇类化合物在金表面有很强的亲和力。将清洗干净的金基底直接插入 硫醇或二硫化物修饰剂溶液中，浸泡一段时间后，在金电极表面可形成硫醇分子 单层膜。将抗体等生物识别分子通过功能试剂( 戊二醛、碳二亚胺等) 以化学键 合作用固定在白组装膜电极表面，可得到具有高度选择性的免疫传感器【2 5 ”】。 6 2 了2 善2 毒2 区j i 曲 f i g 1 2m o d e lo fs e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ：( a ) t h i o c t i ca c i do na u ，( b ) c y s t e a m i n e o i la u 1 2 1 2 碳电极上有序膜 a u 碳电极是电化学研究和应用最广泛的电极体系，近年来在碳电极上有序组 装膜的研究已经弓l 起注意。碳电极上的有序单层膜的制备首先要将碳基底功能 化。其过程都是通过溶液中活性自由基的生成，该自由基与碳原子共价键合，从 而形成稳定的单层膜。常用的方法有胺基的氧化p ”，重氮盐还原p ”，乙醇溶 液中的氧化【3 “。有文献报道在碳电极表面键合生物素，可直接与溶液中的亲和素 作用，提供种基于生物素一亲和素反应制备生物传感器的简便方法i j 。 碳电极上有序膜修饰过程简单、迅速，同时无须昂贵试剂。但是同金电极上 的自组装单层膜相比，由于碳电极在化学结构、产地差异，无法得到高度有序致 密的膜。同时修饰过程涉及活性自由基的生成，也为膜的制备和控制带来困难。 1 2 2 溶胶凝胶( s o l g e i ) 技术 溶胶凝胶法固定生物识别分子已经成为化学修饰电极的一大研究热点。溶胶 凝胶法是将金属醇盐等原料配制成均质溶液，在饱和条件下经水解缩聚等化学反 复旦大学硕士学位论文基于聚合物膜的新型免疲传感器研究 应，生成物聚集成溶胶，在经过蒸发干燥转变为凝胶，在低温下制备纳米粉末或 多空玻璃的技术。溶胶凝胶由于其载体为无机多孔网状材料，适用范围广泛，不 仅适合固化小分子也适合固定生物大分子。包埋于溶胶凝胶中的生物识别分子可 以保持起结构、活性和功能，另外溶胶凝胶孑l 大小具有可调性，这进一步提高了 生物化学反应的选择性1 3 ”。 溶胶凝胶技术在光化学传感器、酶电化学传感器和免疫传感器中得到广泛应 用。目前常用的溶胶凝胶体系为s i 0 2 ，a 1 2 0 3 。本课题组江德臣成功了研制一种 超薄y a 1 2 0 3 溶胶凝胶体，其厚度只有2 0 4 0 r i m 。将其应用于电容型免疫传感器， 包埋肝纤维化标志物，得到较高的灵敏度1 2 “。 f i g 1 3p r o t e i ne n t r a p m e n ti nas i l i c a t em a t r i xd u r i n gs o l g e lp o l y m e r i z a t i o n a f o r m a t i o no f s o lp a r t i c l e sd u r i n gi n i t i a lh y d r o l y s i sa n dp o l y c o n d e n s a t i o n b a d d i t i o n so f p r o t e i nt ot h es o l c t h eg r o w i n gs i l i c a t en e t w o r kb e g i n st ot r a pt h ed o p a n tp r o t e i nm o l e c u l e s d ，t h ep r o t e i nm o l e c u l e sa l ei m m o b i l i z e di nt h eg e l 12 3 分子印迹技术 分子印迹技术是一种人工合成具有分子识别功能的一种新技术，其核心是 分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , m i p ) 的制备。一般的制备过 程为：印迹分子与功能单体相互作用，在交链剂作用下形成聚合物，然后在一 定条件在除去印迹分子，聚合物中就形成与印迹分子空间结构互补的具有多重 作用的孔穴。这些孔穴与印迹分子的形状、电荷及大小具有互补性，因此具有 选择性识别印迹分子的功能。根据功能单体与印迹分子的作用机理，分子印迹 技术可分为共价分子印迹技术( 利用共价键) 、非共价分子印迹技术( 离子作 用、氢键、疏水作用等) 和半共价分子印迹技术( 共价键与非共价键共用) 2 3 1 o 复旦大学硕士学位论文基于聚合物膜的新型免疫待感器研究 目前分子印迹技术在手性药 物分离、酶模拟催化和仿生化学传 感器上获得了长足的发展。其中以 蛋白质为印迹分子的高特异性凝胶 在此领域有着诱人的前景。以酶或 抗体作为特异识别元件，分子印迹 聚合物对分析物产生的结合可通过 转换器作出快速反应。 磐鹜罂 鸬。! ! 照 m m 一【“ l # h 脾pc = ：oi ；0 1 | t 目- “_ c d f $ f i g1 4as c h e m ef o ri m p r i n t i n gm o d i f i c a t i o no f o p do nt h eg o l de l e c t r o d es u r f a c e 1 2 4 导电聚合物包埋技术 导电聚合物一直是化学修饰电极的研究热点，导电聚合物具有大n 键共轭大 环结构，可形成三维刚性骨架，而且修饰方法简便。以导电聚合物为载体或包埋 材料可以方便快捷地固定生物活性分子( 酶，抗原、抗体等) 。导电聚合物的高 导电性有利于保持蛋白的生物活性，通过氧化态与还原态之间的相互转化方便的 将生物分子掺杂进聚合物膜中，聚合物的聚合与生物识别分子的固定可一步完 成；同时通过改变电聚合参数，可以控制膜的结构和厚度，达到提高检测限的目 的；不少聚合物膜具有选择性透过某些物质的功能，可以降低干扰p 7 。3 8 】。目前有 聚吡咯( p p y ) 膜，聚噻吩( p t h ) 和聚苯胺( p a n ) 三大类。其分子结构如下图 所示： a 兀k 溉 从 恰l 2 拎“吐， b 擀 畔 擀 复旦大学硕士学位论文 基于聚各物虞的新型免疫传感器研究 妞；了坠q o - c o h 1 h 单单 妞p l i d 气 f i g 1 5a s t r u c t u r eo f s o m ec o n d u c t i n gp o l y m e rc o m m o n l yu s e di nb i o s e n s o r b r e p e a tu n i to f t h ep y r r o l ea n de m e r a l d i n eo x i d a t i o ns t a t eo f p o l y a n i l i n ei nt h eu n d o p e d b a s ef o r m ( t o p ) a n dt h ef u l l yd o p e d ，a c i df o r m ( b o t t o m ) d o p i n gc a nb ec a r r i e do u tw i t h a n ys t r o n ga c i d ，h x ，w h e r exs e l v e s a st h ec o u n t e r i o nt om a i n t a i n c h a r g e b a l a n c ed e d o p i n gc a nb ea c c o m p l i s h e dw i t ha n ys t r o n gb a s e ，o h 聚毗咯( p p y ) 是导电聚合物中研究最多和应用最广的一类【3 8 j 。主要原因是 聚吡咯膜的电聚合可以在p h 酸性到中性的水溶液中进行，而聚苯胺通常需要在 酸性条件下聚合，聚噻吩通常在有机溶剂中聚合同时需要较高的电位。聚吡咯膜 修饰电极具有良好的电化学活性，可以在氧化态( 导电态) 与还原态( 绝缘态) 之间相互转换，见图1 5 b 。聚吡咯膜的导电性和生物相容性为生物传感器的制 备提供了一种优良的载体，酶、抗原抗体、d n a 等生物识别分子均可掺入聚吡 咯膜中。例如抗体是以带负电的形式掺杂在带正电荷的聚吡咯膜中，因此抗体不 易从膜中脱落。目前，功能化聚毗咯膜研究已经成为热点，大量文献报道将各种 功能团修饰在吡咯环上，通过电聚合制成各种功能化聚吡咯膜，同时将吡咯与其 他单体共聚，生成共聚物膜。可以改善聚吡咯膜的稳定性和可逆性i j ”“。 近年来，纳米结构的导电聚合物研究也日趋活跃。j u nl i u 等人报道了利用 三阶段恒电流法制备的聚苯胺纳米环，这种方法无需模版，纳米环直径在5 0 一7 0 n n 之间，将六氰基高铁酸盐( f e h c f ) 掺杂到聚苯胺纳米环里，可用于过氧化 氢的检测【3 9 1 。j i a x i n gh u a n g 等报道了采用界面共聚技术制备无需模版的聚苯胺 纳米线，其平均直径为5 0 舢。这种苯胺纳米线对氯化氢气体的响应要远大于普 通的聚苯胺膜【4 们。纳米结构的导电聚合物研究将为其在传感器中的应用开辟新的 领域。 5 直接吸附技术 用含有生物识别分子的溶液涂覆或浸泡与电极表面，通过物理或化学吸附作 用使电极表面生成具有识别功能的生物膜。这种方法简单、快速，但是生物识别 复旦大学硕士学位论文 基于聚合物膜的新型免疫传感器研究 分子容易脱落，稳定性差，会产生非特异性吸附i 1 3 免疫传感器检测方法： 1 31 电流检测法 电流检测是生物传感器中最常用的检测方法。电流检测是测定在恒定电压f 通过电极表面的电流，待测物通过氧化还原反应在电极上产生的电流与电极表面 的待测物浓度成正比。电流检测式免疫传感器一般都需要标记，标记物均是酶类， 包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等吼 审一咄 f i g 1 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f v a r i o u st y p e so f a m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r 1 3 2 电容检测法 1 3 2 1 电容检测原理 电容传感器是建立在双电层理论上的一种传感技术。当一根电极插到溶液 中，电极一溶液界面的行为可以近似认为是一个平板电容器，它能储存一定的电 荷，并能给出类似于电容器界面区的模型。物质的吸附和表面电荷的改变对双电 层结构都会产生显著的影响。电容器的电容值取决于平板表面介电层的厚度及介 电性质，在给定电压下，电极上的双层电容( c d ) 可以用以下方程式表达f 3 5 1 ： c = eo r a d( 1 1 ) 其中e 。是真空介电常数，er 是电极与移动电荷隔离开的物质介电常数， a 为电极面积，d 是移动电荷同电极表面最近的距离。电解电容取决于电绝缘层 和固液界面厚度和介电性质。当电极表面修饰上一层电绝缘性物质时，d 的增大 导致电容会相应的降低。c h r i s t i n e 等人认为电极溶液界面的电容是由几个电容 串联构成，即电极表面绝缘层电容( c i 。) ，电极表面生物识别分子膜电容( c 。) 和电极与溶液之间的扩散层电容( c 。) 。它们之间的关系式可用以下方程式表达 【2 8 1 ： 1 c t o j = i ci n s + l c r e c + 1 c g c( 1 2 ) 复旦大学硕士学位论文基于聚合物膜的新型免疫待感器研究 由上式可以看出，最小的电容将主导整个电容器电容。因此，生物识别分 子膜必须绝缘，否则会构成一种短路的状态，扩散层电容( c g 。) 将在整个电容 中占主导地位。抗原抗体结合后，电极表面绝缘膜厚度变化引起的电容变化将无 法在整个电容中反映出来。 f i g i 7 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fac a p a c i t i v eb i o s e n s o r ，w h e r et h et o t a lc a p a c i t a n c ei s d e s c r i b e db ys e v e r a lc a p a c i t o r si ns e r i e s t h ef i r s tc a p a c i t o r ，c i n s ，c l o s e s tt ot h em e t a ls u r f a c e d e s c r i b e st h ei n s u l a t i n gl a y e r , t h es e c o n d c a p a c i t o r ，c r e c ，c o n s t i t u t e st h eg r a f t i n gm o l e c u l e s ，t h e b o u n d r e c o g n i t i o ne l e m e n t , b i n d i n go f a n a l y t ea n da n yc o n t r i b u t i o nf r o mt h es t e ml a y e r t h et h i r d c a p a c i t o r , c g c ，d e s c r i b e st h ec o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n td i f f u s el a y e r 1 3 2 2 电容的测定 电容的测定有两种常用方法：交流阻抗和电位阶跃。 1 3 2 2 1 交流阻抗法1 4 i j ： 交流阻抗是测量电极溶液双电层电容和溶液电阻的有效方法。交流阻抗 方法是施加一个小振幅的交流电压( 或电流) 信号，使电极电位在平衡电极电位 附近微扰，在达到稳定状态后，测量其响应电流( 或电压) 信号的振幅和相，依 次计算出电极的复阻抗。然后根据设想的等效电路，通过阻抗谱的分析和参数拟 合，求出电极反应的动力学参数。由于这种方法使用的电信号振幅很小，又是在 平衡电极电位附近，因此电流和电极电位之间的关系往往可以线性化，给动力学 参数的测量和分析带来很大的方便。作为种敏感的检测手段，电化学交流阻抗 法已经广泛应用与电极表面修饰层的表征。 交流阻抗通常在含有氧化还原探针( f e ( c n ) 6 】“4 ) 溶液中进行。利用氧化 还原探针获得的图谱重现性较好，可获得较可靠真实的信号，但使用氧化还原探 针有可能腐蚀电极表面，对整个生物识别层产生一定的影响。记录一个完整的交 涝卜叠g 厶愁 i 堇 啉 c c c 上h j - 牛 复旦大学项士学位论文基于聚合物膜的新型免疫传感器研究 流阻抗图谱需在一个较广泛的频率范围内进行，往往需要数十分钟，同时由于拟 合过程较为复杂，这也限制了交流阻抗法的实际应用。 1 3 2 2 2 电位阶跃【2 5 】 电位阶跃是一种测量电极溶液双电层电容和溶液电阻的快速方法。其原理 为：将电极体系简化为一r c 模型。施加一个电压脉冲( 5 0m v ) 后，该电路的 电流呈指数衰减，可用以下方程式表达： i ( t ) 2u r se x p ( 一t r sc s ) ( 1 3 ) 其中i ( t ) 为电极电流响应值，u 为施加电压，r s 为电解液电阻，c s 为电极电 容。对该表达式取对数，可得： i n 删2l n ( u r s ) + ( - t r s c ) ( 1 4 ) 从上式的斜率和截距即可计算出电极的电容。 电位阶跃法可在极短的是时间内( 通常微秒) 通过电极电流的衰减计算出电 极电容，同时计算过程简单，易于样品的快速检测。 电位阶跃法将电极体系简化为( r c ) 模型，而实际体系中，电极表面存在 一定电阻，体系的准确模型为r ( r c ) 。通常，如果电极体系绝缘膜电阻远大于 溶液电阻，可简化模型，得到相对精确的电容值。但是该前提将极大地限制电位 阶跃法的应用。 r sc f ab f i g 1 8 ：s i m p l i f i e d r a n d l e se q u i v a l e n tc i r c u i t f o r a ne l e c t r o d e c o a t e d w i t ha t h i n i s o l a t i n g f i l m as i m p l er c e q u i v a l e n tc i r c u i t ；b r ( r c ) e q u i v a l e n tc i r c u i t r si st h er e s i s t a n c eo f t h es o l u t i o n r fi st h eo h m i cr e s i s t a n c eo f t h e l a y er c f i st h ec a p a c i t a n c eo f t h el a y e r 复旦大学项士学位论文基于聚合物膜的新型免疫传感器研究 1 - 3 - 3 质量检测法：石英晶体微天平( q c m ) 4 3 石英晶体微天平( q c m ) 技术是一种具有高度灵敏性的质量变化检测器， 检测灵敏度可达1 0 4g 数量级。石英是具有压电性质的物质之一，当外加交变电压 的频率为某一特定频率时，石英晶片振幅会急剧增加，这就是压电谐振在真空或 气相中，谐振频率变化f ( 频移值) 与晶体表面上的质量变化am 有如下简单线 性关系： f = - 2 0 ( a m a ) ( pq ”q ) 。( 1 5 ) 这就是s a u e r b r e y 方程，是压电质量传感( 即q c m ) 的理论基础。负号表示质 量增加弓l 起谐振频率下降，式中f 是石英晶振的频率变化量或称频移值( h z ) ；， o 是测量起始时的谐振频率( m h z ) ：m 是晶振表面的质量改变；a 是参与压电谐 振的晶体面n ( c m 2 ) ；vq 是石英剪切波速；am 是石英晶振上的质量变化( g ) 。最 常用的q c m 石英晶片是一种a t - c u t 石英晶体振荡片( 用厚度切割模式与晶体主 晶轴成3 5 。1 5 ) 。 石英晶体微天平在化学、生物等领域有广泛的应用前景。在电极表面修