（环境科学专业论文）典型手性农药拟除虫菊酯及其代谢产物对斑马鱼的发育毒性研究.pdf

i ，e v e l o d m e l l l ：a it 0 x l c 】t vo iw d l c a lc i l l r a ll n s e c t i c i c i e 、1几11 s y n t h e t i co v r e t h r o i d sa n dt h e i rm e t a b o l i t e so nz e b r a f i s h a u t h o r ss i g n a t u r e ： 一 bu p e r v l s o r 。ss i g na t u r e ： e x t e r n a lr e v i e w e r s ：a n o n y m o u sc o m m e n t a n o n n o u sc o m m e n t a n 0 1 3 v m o u sc o m m e n t a n 0 1 1 v m o u sc o m m e n t a n o n n 0 u sc o m m e n t e x a m i n i n gc o m m i t t e ec h a i r p e r s o n ： y a h 2x i a o e p r o f e s s o r z h e j i a n gu n i v e r s i t y e x a m i n i n gc o m m i t t e em e m b e r s ： y uy u n l o n 2 p r o f e s s o r z h e i i a n 2u n i v e r s i t y l i uw e i p i n g p r o f e s s o r z h e j i a n gu n i v e r s i t y 圣鱼鲤gy q 跫g 曼q 垒g 逭! q 鱼曼q 丝h 白i 垫g 堕堕i y 星堡i 垃 w uj i n g p r o f e s s o r h a n g z h o un o r m a lu n i v e r s i t y d a t eo f o r a ld e f e n c e ：m a y3 1 2 0 1 0 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 今羡菊 签字日期： 矽p 年 卵g 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝江盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝婆盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：力和年石月 易日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： = 隐占日 电话： 致谢 时光飞逝，五年的博士生涯即将结束，感慨颇多，谨以此文向所有关心帮助 过我的老师、同学、朋友和家人表达我最诚挚的感谢。 首先，要感谢我的导师刘维屏教授。感谢刘老师为我提供了一个宽松优越的 科研与学习环境，感谢刘老师五年来在学业上的悉心指导、在生活上的关心与鼓 励。刘老师在科研上的执着、严谨及创新精神，在生活上的平易近人与严以律己 的作风都深深地影响了我，使我受益匪浅，将成为我终身的宝贵财富。 同时，我的论文及学业得以顺利完成，离不开众多老师、同学和朋友的帮助 与支持。衷心感谢蔡喜运博士在科研上领我进门，感谢林坤德博士后、马云博士、 陈胜文博士、张安平博士、王鲁梅博士、徐超博士、周珊珊博士在实验上的指导 以及生活中的关心，感谢叶臻博士、张颖博士与我一起相互陪伴的美好时光。感 谢赵美蓉老师在实验设计及论文写作上给予的有益指导与帮助，王佳佳硕士、王 翠博士、章晓凤硕士在实验及论文上的热情帮助和支持，感谢刘璩老师、陆娴婷 博士、李玲博士、金丽霞博士、张琼博士、杨华云博士、张锋硕士给予的帮助与 鼓励。又有幸在博士期间作客温州医学院，感谢温州医学院环境与公共卫生学院 院长黄长江老师为我的实验提供了一个很好的平台，特别感谢白承莲硕士、汪礼 军硕士、黄海花硕士、陈元红硕士、陈将飞硕士、胡伟硕士、徐涛硕士等温州医 学院水域科学与环境研究所的所有同学在实验和生活中的无私帮助与支持，你们 在我温州医学院将近半年的学习生活中增添了无数的美好回忆。 最后，要感谢我的家人一直以来对我的默默支持与鼓励，他们是我漫漫的求 学路上遮风避雨的港湾，是我冬日里的小小的太阳。也要感谢我的亲爱的朋友们， 是你们在我遇到困难停滞不前时，不断地给我予鼓励，才让我得以走到今天。 回首五年博士生涯，认识很多人，经历很多事，酸甜苦辣，喜怒哀乐，一生 难忘! 难忘杭州，难忘思师，难忘帮助关心过我的所有人! 祝愿大家身体健康、 金美青 m 兀同 2 0 10 年4 月于杭州 摘要 拟除虫菊酯类农药，是天然除虫菊素基础上发展起来的一类高效低毒的新型 杀虫剂，广泛地应用于农作物害虫和卫生害虫的防治。虽然该类农药对哺乳类及 鸟类的毒性较低，它们对鱼类等水生生物的毒性却很大。再者，拟除虫菊酯作为 当前最主要的一种手性农药，不同对映体在生物过程中存在着较大的差异性，故 在水生生物毒性中也表现出显著的对映体选择性。因此，拟除虫菊酯的水生生物 毒性及其对映体选择性已经引起了越来越广泛的关注，成为当前的一个研究热 点。 目前，有关手性拟除虫菊酯类农药的水生生物毒性研究，主要集中在急性毒 性方面，有少部分在鱼类的胚胎发育及内分泌干扰上的工作，但是在对鱼类的心 血管发育、行为毒性及其对映体选择性方面仍未见报道。此外，拟除虫菊酯的水 生生态风险评价，大多基以母体化合物的毒性数据，很少考虑到其代谢产物的影 响。因此，本研究以目前广泛使用的几种拟除虫菊酯类农药氯菊酯( p m ) 和氯 氰菊酯( c p ) 及其三种代谢产物3 - p h e n o x y b e n z a l d e h y d e ( p b c h o ) ， 3 - p h e n o x y b e n z o i ca l c o h o l ( p b c o h ) ，和3 - p h e n o x y b e n z o i ca c i d ( p b c o o h ) 以及 联苯菊酯( b f ，包括1 r b f 和1 s - b f ) 为测试化合物，作了以下几方面的研究： ( 1 ) t ；z a b 品系斑马鱼和f l i 1 ：e g f p ( 增强型绿色荧光蛋白) 转基因斑马鱼 为模式生物，研究了p m ，c p 及其代谢产物p b c o h ，p b c h o 和p b c o o h 对斑马 鱼的早期发育( 包括心血管发育等) 及行为的影响。研究结果显示，p m ，c p 及 p b c o h ，p b c h o 和p b c o o h 对斑马鱼胚胎仔鱼的正常发育有着毒害作用，产生 了身体歪曲，卵黄囊肿，心包囊肿等亚急性畸形现象甚至是引起了仔鱼的死亡。 此外，对斑马鱼的运动行为的检测结果表明，拟除虫菊酯及其代谢产物对斑马鱼 仔鱼在光周期刺激下的运动特征及变化规律也有着显著的影响。本研究还进一步 以f l i 1 ：e g f p ( 增强型绿色荧光蛋白) 转基因斑马鱼为模式生物对各拟除虫菊酯 及其代谢产物对斑马鱼心血管系统的发育的影响进行了考察。结果显示，不论是 两种母体化合物还是其代谢产物，均对斑马鱼的早期发育( 包括心血管发育等) 及行为有着不同程度的毒性效应。而且，母体化合物p m 和c p 相比较，c p 的毒性 要远远大于p m 。三种代谢产物中，i ) , , ( p b c h o 的毒性效应最为显著，p b c o h 和 p b c o o h 的相对次之。 ( 2 ) 已有研究表明氯氟氰菊酯，联苯菊酯，氰戊菊酯和苯醚菊酯等拟除虫 菊酯都具有雌激素活性。由于斑马鱼与人类同源基因的高度保守性( 相似度可达 8 5 ) 及胚胎发育过程中激素调控的重要性，本研究进而以研究环境雌激素的经 典体外模型m c f 7 细胞评价了p m ，c p 及p b c o h ，p b c h o 和p b c o o h 的雌激素 效应。结果表明，除p b c h o 之外，p m ，c p ，p b c o h 和p b c o o h 都具有明显的 雌激素效应。其中，p b c o h 不管是在细胞增殖上，还是在对雌激素响应基因p s 2 和e r am r n a 表达的影响上，都比其母体化合物表现出更为显著的雌激素效应。 体外实验结果与第二章中的结果相一致，说明拟除虫菊酯及代谢产物对斑马鱼等 水生生物的早期发育及行为的影响有可能是通过对内分泌系统的干扰而产生的。 ( 3 ) 迄今为止，关于拟除虫菊酯的行为毒性对映体选择性的研究基本局限 于神经毒性造成的对啮齿类动物的运动功能的影响上。已有的研究结果显示，拟 除虫菊酯类杀虫剂，对鱼类等水生生物的行为也具有明显的干扰作用，但在对映 体水平上尚未见任何相关报道。因此，本研究以联苯菊酯( b f ) 为测试化合物， 来研究手性农药对斑马鱼等水生生物的早期发育及行为的对映体选择性。结果显 示，不论是在对斑马鱼胚胎仔鱼的发育还是对仔鱼的运动活性的影响上，两个 对映异构体都存在着极其显著的差异性。以存活率，畸形率及平均运动活性为观 察终点，1 r b f 的毒性都明显要大于1 s - b f 。同时，1 r b f 还导致斑马鱼躯干血管 特别是节间血管出现分支交叉甚至是断裂或缺失的现象，而1 s - b f 对于斑马鱼的 心血管发育没有明显毒害效应。1 r b f 引起的心血管发育的异常，有可能是导致 心包囊肿、身体歪曲等畸形现象的发生以及运动行为异常的一个原因。 综合以上内容，并结合其他研究结果，可以得到以下两个结论：第一，拟除 虫菊酯类农药对非靶标水生生物斑马鱼的发育及行为具有毒性效应，而且不同对 映异构体存在着显著的差异性。拟除虫菊酯的发育及行为毒性有可能是通过对斑 马鱼的内分泌系统以及心血管发育的干扰造成的。行为是生物体对外界环境和内 部环境变化的一个灵敏反应，建立以行为变化作为检测指标的方法有利于对手性 化合物的对映体选择性水生毒性进行快速有效的评价。第二，本研究表明，拟除 虫菊酯类农药的代谢产物亦具有发育及行为毒性以及内分泌干扰效应，因此，其 代谢过程并不一定是一个解毒过程，今后在对拟除虫菊酯类农药的环境安全性的 评价中，不仅要考虑到其母体化合物，还要考虑到其代谢产物的环境影响与危害。 n 关键词：手性农药；拟除虫菊酯；代谢产物；对映体选择性；运动行为；心血管 发育；雌激素效应；斑马鱼 a b s t r a c t t h es y n t h e t i cp y r e t h r o i d s ( s p s ) a r eac l a s so fp o t e n ta n de f f e c t i v ei n s e c t i c i d e s t h a th a v eb e e nd e s i g n e da n do p t i m i z e db a s e do nt h es t r u c t u r e so ft h en a t u r a l i n s e c t i c i d ep y r e t h r u ma n dw i d e l yu s e df o ra g r i c u l t u r a la n di n d o o r p e s tc o n t r 0 1 a l t h o u g hs p sa r ec h a r a c t e r i z e da sl o wm a m m a l i a na n da v i a nt o x i c ，t l l e yh a v eb e e n 1 1 i g l l l yt o x i ct oa q u a t i co r g a n i s m ss u c ha sf i s h f u r t h e r m o r e ，a l lk n o w ns p sc o n t a i n t w ot ot h r e ea s y m m e t r i cp o s i t i o n s ，m a k i n gt h e maf a m i l yo fp e s t i c i d e sw i mt w ot o f o u rp a i r so fe n a n t i o m e r s ，w h i c hu s u a l l yi n t e r a c tw i t hb i o l o g i c a ls y s t e m ss e l e c t i v e l y a n dm a yr e s u l ti ne n a n f i o s e l e c t i v ea q u a t i ct o x i c i t y a sar e s u l le n a n t i o s e l e c t i v i t yi n a q u a t i ct o x i c i t yo fs p sh a sb e e na ni s s u eo fg r e a tc o n c e r na n da t t r a c t e dw o r l d w i d e a t t e n t i o n t h eo c c u r r e l l c eo fe n a n t i o s e l e c t i v i t yi na q u a t i ct o x i c i t yh a sb e e na d d r e s s e df o r s p sm o s t l yo na c u t et o x i c i t y , a n ds e v e r a lr e p o r t sh a v ea l s ob e e ni s s u e do nt h e d e v e l o p m e n t a la n de n d o c r i n ed i s r u p t i o ne f f e c t so ff i s h h o w e v e r , n oi n f o r m a t i o nh a s b e e na v a i l a b l ew i t hr e s p e c tt ot h ee n a n t i o s e l e c t i v et o x i c i t i e so nv a s c u l a rd e v e l o p m e n t a n db e h a v i o ri nf i s hs of a r b e s i d e s ，t h ea q u a t i ct o x i c o l o g i c a la s s e s s m e n to fs p sh a s b e e nd o n eb a s e do nt h ep a r e n tc o m p o u n d sw i t h o u tt a k i n gr i s k so ft h em e t a b o i t e si n t o c o n s i d e r a t i o n t h e r e f o r e ，t w op y r e t h r o i d sp e r m e t h r i n ( p m ) ，c y p e r r n e t h r i n ( c p ) a n d n l e i rm e t a b o l i t e s 3 - p h e n o x y b e n z o i ca l c o h o l ( p b c o h ) ，3 - p h e n o x y b e n z a l d e h y d e ( p b c h o ) ，3 - p h e n o x y b e n z o i ca c i d ( p b c o o h ) a sw e l l a st w oe n a n t i o m e r so f b i f e n t h r i n ( b f ) i n c l u d i n g1 r - b fa n d1s - b fw e r ec h o s e na st h et e s tc o m p o u n d s ，a n d t h ed e t a i l so fo u rs t u d yw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) w i l d t y p e ( a bs t r a i n ) z e b r a f i s ha n df l i 一1 ：e g f pt r a n s g e n i cz e b r a f i s hw e r e u s e dt os t u d yt h ee f f e c t so nl o c o m o t o rb e h a v i o ra n de a r l yd e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yo f p m ，c pa n dt h e i rm e t a b o l i t e sp b c o h ，p b c h o ，p b c o o h r e s u l t si n d i c a t e dt h a ta l l t h et e s tc o m p o u n d sw e r et o x i ct ot h e d e v e l o p m e n to fz e b r a f i s h , i n d u c i n gt h e o c c u r r e n c eo fs u b l e t h a lm a l f o r m a t i o n ss u c ha sc u r v e db o d ya x i s ，y o l ks a ce d e m aa n d p e r i c a r d i a le d e m aa sw e l la sm o r t a l i t yo fz e b r a f i s h b e s i d e s 1 0 c o m o t o ra c t i v i t i e so f z e b r a f i s hl a r v a eu n d e ra l t e r n a t i n gl i g h tc o n d i t i o n sh a v eb e e na f f e c t e dg r e a t l yb yt h e p y r e t h r o i d sa n dt 1 1 e i rm e t a b o l i t e s w ea l s of u r t h e ri n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so nv a s c u l a r d e v e l o p m e n tu s i n gf l i l ：e g f pt r a n s g e n i cz e b r a f i s ha sm o d e l s t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a ta l lt h et e s tc o m p o u n d sw e r et o x i ct ot h e e a r l yd e v e l o p m e n ta n dl o c o m o t o r a c t i v i t yo fz e b r a f i s h ，w i 也c pb e i n gt h em o r et o x i cp a r e n tc o m p o u n d ，a n dp b c h ot h e v m o s tt o x i cm e t a b o l i t e ( 2 ) p r e v i o u ss t u d i e sh a v ei n d i c a t e d t h a ts e v e r a l p y r e t h r o i d si n c l u d i n g l a m b d a - c y h a l o t h r i n , b i f e n t h r i n , f e n v a l e r a t ea n ds u m i t h r i np o s s e s se s t r o g e n i ca c t i v i t i e s d u et ot h eh i g hs i m i l a r i t yo fh o m o l o g o u sg e n eb e t w e e nz e b r a f i s ha n dh u m a na sw e l l a st h es i g n i f i c a n c eo fe s t r o g e nr e g u l a t i o ni ne m b r y od e v e l o p m e n t , t h em c f - 7h u m a n b r e a s tc a r c i n o m ac e l ll i n ew a sf u r t h e rc h o s e nt oe v a l u a t et h ee s t r o g e n i ce f f e c t so fp m ， c pa n dt h e i rm e t a b o l i t e sp b c o h ，p b c h o ，p b c o o h r e s u l t sd e m o n s t r a t e d ，w i t h e x c e p t i o nt op b c h o ，a 1 1t e s tc o m p o u n d se x h i b i t e de s t r o g e n i ca c t i v i t i e s ，w i t l lp b c o h b e i n ge v e nm o r e e f f e c t i v et h a ni t sp a r e n tc o m p o u n d s b yt h em c f 一7c e l lp r o l i f e r a t i o n a s s a y ( i e ，t h ee s c r e e na s s a y ) a n dt h er e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( q r t - p c r ) t h er e s u l t sc o i n c i d e dw i 1w h a tw eh a v ea c h i e v e di nc h a p t e r2 ， i n d i c a t i n gt h a te n d o c r i n ed i s r u p t i o nm a y b eo n eo ft h ep o s s i b l em e c h a n i s m sb yw h i c h s p se x e r te f f e c t so ne a r l yd e v e l o p m e n ta n dl o c o m o t o rb e h a v i o ri nz e b r a f i s h ( 3 ) i n f o r m a t i o no ne n a n t i o s e l e c t i v i t y i nb e h a v i o rt o x i c i t yo fs p sh a sb e e n r e s t r i c t e dt ot h el o c o m o t o rd y s f u n c t i o no fr o d e n tm o d e l ss of a r a l t h o u g hp r e v i o u s s t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a ts p sp o s s e s s e dt o x i c i t i e so nb e h a v i o ro fa q u a t i co r g a n i s m s s u c ha sf i s h ，n or e p o r t sh a v eb e e ni s s u e do nt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t ee f f e c t s t h e r e f o r e ， w ec h o s eb i f e n t h r i n ( b f ) t oi n v e s t i g a t et h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo nt h ea c u t el o c o m o t o r a c t i v i t ya n dt h ed e v e l o p m e n t a lt o x i c i t i e so fe m b r y o l a r v a lz e b r a f i s h , a n ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e db e t w e e nt h et w oe n a n t i o m e r s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t 1 r b fw a sm o r et o x i ct h a n1s - b fi nc a u s i n gm o r t a l i t ya n dm o r p h o l o g i c a l i m p a i r m e n t sa sw e l la st h el o c o m o t o rb e h a v i o rd i s r u p t i o n m e a n w h i l e ，1 r b fa l s o h a da d v e r s ee f f e c t so nv a s c u l a rd e v e l o p m e n t , c a u s i n gi n t e r s e g r n e n t a lb l o o dv e s s e l st o b ec r o s s e do re v e na b s e n t 1 r - b f i n d u c e da b n o r m a lv a s c u l a rd e v e l o p m e n tm a yb e o n eo ft h er e a s o n sf o rt h em o r p h o l o g i c a li m p a i r m e n ta n dl o c o m o t o rb e h a v i o r d i s r u p t i o n t os u mu p ，w ea c h i e v e dc o n c l u s i o n sa sf o l l o w s ：f i r s t ，s p sh a v ee n a n t i o s e l e c t i v e t o x i c i t i e so ne a r l yd e v e l o p m e n ta n dl o c o m o t o rb e h a v i o ri nz e b r a f i s h ，a n dt h ee f f e c t s m a yb ee x e r t e db yd i s r u p t i o no fe n d o c r i n es y s t e ma n dc i r c u l a t o r ys y s t e m b e h a v i o r r e p r e s e n t st h eu n i q u ei n t e r f a c e b e t w e e ni n t r i n s i ca n de x t r i n s i cf o r c e s ，a n dt h e l o c o m o t o rb e h a v i o ra s s a yu s i n gl a r v a lz e b r a f i s hm a yb eau s e f u la n ds e n s i t i v e a p p r o a c hf o ra s s e s s i n g t h ee n a n t i o s e l e c t i v ea q u a t i ct o x i c i t yo fc h i r a lc h e m i c a l s s e c o n d l y , 0 1 1 1 r e s u l t sa l s od e m o n s t r a t e dt h a tm e t a b o l i t e so fs p sa r ee f f e c t i v eb o t hi n c a u s i n gd e v e l o p m e n t a lt o x i c i t ya n de n d o c r i n ed i s r u p t i o n , i n d i c a t i n gt h em e t a b o l i s m 、兀 m a yn o ta l w a y sb ead e t o x i f i c a t i o np r o c e s s t h e r e f o r e ，t h em e t a b o l i t e sa sw e l la st h e p a r e n tc o m p o u n ds h o u l db et a k e ni n t oc o n s i d e r a t i o ni nt h ee n v i r o n m e n t a ls a f e t y a s s e s s m e n to fs p s k e y w o r d s ：c h i r a lp e s t i c i d e s ；s y n t h e t i cp y r e t h r o i d s ；m e t a b o l i t e s ；e n a n t i o s e l e c t i v i t y ； l o c o m o t o rb e h a v i o r ；v a s c u l a rd e v e l o p m e n t ；e s t r o g e n i ca c t i v i t y ；z e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) 目录 摘要i a b s t r a c t v 第一章绪论1 1 1 打言1 2 拟除虫菊酯类农药概述2 2 1 天然除虫菊素与拟除虫菊酯2 2 2 分类及作用机制5 3 拟除虫菊酯类农药的水生生态毒理学研究6 3 1 急性毒性6 3 2 亚致死效应6 3 3 不同发育阶段及物种的敏感性8 3 4 拟除虫菊酯的代谢对水生毒性的影响9 4 斑马鱼及其在毒理学中的应用1 1 4 1 斑马鱼的基本特征与毒理学应用优势1 1 4 2 斑马鱼在毒理学中的应用1 1 5 体外雌激素效应评价体系13 5 1 细胞增殖实验1 4 5 2 受体结合实验1 4 5 3 酵母重组系统实验。1 5 5 4 转录报告基因实验1 5 6 拟除虫菊酯类农药的手性研究进展1 6 6 1 手性与拟除虫菊酯的生物活性1 6 6 2 拟除虫菊酯类农药的手性分离1 8 6 3 拟除虫菊酯类农药的对映体选择性毒性2 3 7 本课题的立题依据及研究内容2 6 参考文献2 9 第二章拟除虫菊酯及其代谢产物对斑马鱼的发育毒性及行为的影响4 1 1 前言4 1 2 材料与方法4 2 2 1 主要试剂4 2 2 2 主要仪器4 3 2 3 斑马鱼的饲养与胚胎的收集4 3 2 4 斑马鱼的胚胎幼鱼发育毒性实验4 4 2 5 斑马鱼仔鱼急性运动行为实验。4 5 2 6 心血管发育实验4 5 2 7 定量分析及统计4 6 3 结果与讨论4 6 3 1 对斑马鱼胚胎仔鱼发育过程的影响4 6 3 2 对斑马鱼仔鱼心血管发育的影响5 0 3 3 光周期刺激下对斑马鱼仔鱼运动行为的影响5 2 4 本章小结。5 7 参考文献5 9 第三章拟除虫菊酯及其代谢产物雌激素效应的研究6 5 1 前言6 5 2 材料与方法6 7 2 1 主要仪器与试剂6 7 2 2 细胞系及细胞培养6 7 2 3 细胞增殖实验6 8 2 4r n a 的提取及反转录6 9 2 5 荧光定量p c r 7 0 3 实验结果7 0 3 1 对m c f 7 细胞的增殖效应7 0 3 2 对m c f 7 细胞中p s 2 及e r o t m r n a 表达的影响7 0 4 分析与讨论7 3 5 本章小结7 5 参考文献7 7 第四章联苯菊酯对斑马鱼发育及行为影响的对映体选择性8 l 1 前言81 2 材料与方法8 3 2 1 试剂与联苯菊酯对映体的制备8 3 2 2 斑马鱼的饲养与胚胎的收集。8 4 2 3 斑马鱼胚胎仔鱼发育毒性实验8 4 2 4 斑马鱼仔鱼行为的光周期刺激反应实验8 5 2 5 心血管发育实验8 5 2 6 统计分析8 5 3 结果与讨论8 5 3 1 对斑马鱼胚胎仔鱼发育的影响8 5 3 2 对斑马鱼仔鱼运动行为的毒性9 0 3 3 对斑马鱼心血管发育的影响9 5 4 本章小结9 7 参考文献9 9 第五章研究结果与未来工作展望1 0 3 1 研究结果10 3 1 1 拟除虫菊酯及其代谢产物的胚胎发育毒性1 0 3 1 2 拟除虫菊酯及其代谢产物的心血管发育毒性1 0 3 1 3 拟除虫菊酯及其代谢产物的行为发育毒性1 0 3 1 4 拟除虫菊酯及其代谢产物的雌激素效应1 0 4 1 5 联苯菊酯在胚胎发育及行为毒性上的对映体选择性1 0 4 2 未来工作展望10 4 2 1 水生生物行为毒性的对映体选择性方面研究亟待加强1 0 4 2 2 胚胎发育毒性方面研究有待于进一步深入1 0 5 2 3 关注长期低剂量效应及综合考虑其代谢产物的毒性效应1 0 5 攻读博士学位期间发表或录用的文章10 6 i i i 浙江大学博士学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 前言 拟除虫菊酯类农药，是现代使用农药中最主要的一种，在世界杀虫剂市场中 占了3 0 n 份额( k 6 p r i i c i ia n da y a 氓2 0 0 4 ) ，是在天然除虫菊素基础上发展起 来的一类高效、安全的新型杀虫剂( c a s i d a , 1 9 8 0 ) ，广泛应用于农作物害虫和 卫生害虫的防治( k 6 p r i i 西a n da y d i 玛2 0 0 4 ) 。天然除虫菊素，是由白除虫菊 ( c h r y s a n t h e m u mc i n e r a r i a e f o l i u m ) 中提取的有效成分( 刘尚钟e ta 1 ，2 0 0 4 ) ， 具有高效、低毒、低抗性、广谱性等众多独特的优点，但是对日光跟空气不稳定， 不适于田间操作，因此，研究人员不断地从其结构上进行改进，合成了一系列拟 除虫菊酯，在改善其光稳定性的同时又保留其原有的高效除虫性及对哺乳动物的 低毒性等特征( k a t s u d a , 1 9 9 9 ；s o d e r l u n de ta 1 ，2 0 0 2 ；韩耀宗e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 随着氨基甲酸盐和有机磷农药的进一步禁用，拟除虫菊酯的使用量不断增 加，其引起的环境污染与人类安全问题也越来越受到重视( g l i c k m a na n dl e 也 19 8 2 ；k 6 p r i i e i ia n da y d i n ，2 0 0 4 ；m o r g a ne ta 1 ，2 0 0 7 ；f r a n ka n dm a r s h a l l ，2 0 0 8 ) 。 拟除虫菊酯类农药可以通过地表径流或土壤淋溶等多种途径进入到水体环境中， 对地表用水及溪流河床底泥等造成污染( k r e u g e r ，1 9 9 9 ；刘维屏，2 0 0 5 ) 。研究发 现，拟除虫菊酯虽然对哺乳类及鸟类的毒性较低，对鱼类等水生生物的毒性却很 大，除了急性毒性( 9 6 - h - l c 5 0 低至1 昭l 。1 ) 之外，还会在低浓度下引起蚤类、 虾、鱼类等水生生物的亚致死效应，包括行为变化( c h r i s t e n s e ne ta 1 ，2 0 0 5 ； h e c k m a n ne ta 1 ，2 0 0 5 ；u s e p a , 2 0 0 5 ) ，生长迟缓( t a n n e ra n dk n u t h , 1 9 9 6 ) ，免 疫系统影响( z e l i k o f f , 1 9 9 8 ；c l i f f o r de ta 1 ，2 0 0 5 ) ，生殖内分泌效应( d a y , 1 9 8 9 ； b a r r y e ta 1 ，19 9 5 ；t a n n e ra n dk n u t h ，19 9 6 ；m o o r ea n dw a r i n g ，2