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硕士学位论文高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 摘要 本文旨在研究高压均质技术在壳聚糖降解中的应用，为利用物理方法制备低分子量 壳聚糖提供参考。本文主要采用了高压均质降解和高压均质一过氧化氢( h 2 0 2 ) 联合降解两 种方法来降解壳聚糖，考察了浓度、压力、温度等因素对降解效果的影响，讨论了降解 产物性能及结构的变化，主要研究内容及结果如下： ( 1 ) 采用高压均质降解壳聚糖，其降解效果随原料分子量的增大而提高，随壳聚糖溶 液浓度的增大而降低，随均质压力的增大而提高，随循环次数的增加而提高，不随乙酸 ( h a c ) 溶液浓度、乙酸钠( n a a c ) 溶液浓度及温度发生变化。此外，初步建立了高压均质 降解壳聚糖的理论模型，并探讨了高压均质机的作用机理。 ( 2 ) 采用高压均质一h 2 0 2 联合降解壳聚糖，其降解效果随h 2 0 2 溶液浓度的增大而提 高，随壳聚糖溶液浓度的增大而降低，随h a c 溶液浓度的增大先升高后降低，随均质 压力和温度的升高而提高，随循环次数的增加而提高。 ( 3 ) 高压均质降解和高压均质一h 2 0 2 联合降解都没有破坏壳聚糖的基本官能团和结 构单元，绝大部分的断链位置都位于b ( 1 ，4 ) 糖苷键上。 ( 4 ) 高压均质一h 2 0 2 联合降解壳聚糖的效果优于高压均质降解或h 2 0 2 氧化降解，高 压均质技术在保持自身对壳聚糖机械剪切断链作用的同时，还促进了h 2 0 2 对壳聚糖的 氧化降解。 关键词：高压均质技术，壳聚糖，降解，机械剪切，过氧化氢 a b s t r a c t硕士学位论文 a b s t r a c t i no r d e rt op r e p a r el o w - m o l e c u l a r - w e i g h tc h i t o s a ni np h y s i c a lw a y , t h i sd i s s e r t a t i o ni s i n t e n d e dt os t u d yo nt h ea p p l i c a t i o no fh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o nt e c h n i q u ei nt h e d e g r a d a t i o no fc h i t o s a n t w om e t h o d s ，o n ei sh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o n ，t h eo t h e ri st h e c o m b i n a t i o no fh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o na n dh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) ，w e r ea d o p t e dt o d e g r a d ec h i t o s a n t h ei n f l u e n c eo fs o m ef a c t o r s ， s u c ha sc o n c e n t r a t i o n ，p r e s s u r ea n d t e m p e r a t u r ew a si n v e s t i g a t e d ，a n dt h ep e r f o r m a n c ea n ds t r u c t u r eo fp r o d u c t sw e r ed i s c u s s e d t h em a i nc o n t e n ta n dr e s u l t sa r es h o w e da sf o l l o w s ： ( 1 ) c h i t o s a nw a sd e g r a d e db yh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o n ，a n di t se f f e c ti n c r e a s e dw i t h m o l e c u l a rw e i g h to fo r i g i n a lc h i t o s a n ，p r e s s u r ea n dn u m b e ro fc y c l e s ，d e c r e a s e dw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n ，w h i l eb o t ht h ec o n c e n t r a t i o no fa c e t i ca c i d ( h a c ) o rs o d i u ma c e t a t e f n a n c ) a n dt e m p e r a t u r eh a dan e g l i g i b l ei n f l u e n c e w h a t sm o r e ，t h e o r e t i c a lm o d e lw a sb u i l t a n dt h em e c h a n i s mo fh o m o g e n i z e rw a sd i s c u s s e d ( 2 ) c h i t o s a nw a sd e g r a d e db yt h ec o m b i n a t i o no fh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o na n d h 2 0 2 a n di t se f f e c ti n c r e a s e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 ，p r e s s u r e ，t e m p e r a t u r ea n d n u m b e ro fc y c l e s ，d e c r e a s e dw i mt h ec o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n ，w h i l ee x h i b i t e da n i n c r e a s e t o d e c r e a s et r e n dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fh a c ( 3 ) t h ed e g r a d a t i o no fc h i t o n s a nb yb o t hh i 曲p r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o na n dt h e c o m b i n a t i o no fh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o na n dh 2 0 2 ，d i d n td e s t r o yb a s i cf u n c t i o n a l g r o u p sa n ds t r u c t u r eu n i to fc h i t o s a n ，i n d i c a t i n gt h a tm o s to ff r a g m e n t a t i o nh a p p e n e do n p 一( 1 ，4 ) i n d i c a nb o n d ( 4 ) t h ee f f e c to ft h ec o m b i n a t i o no fh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o na n dh 2 0 2w a sb e t t e r t h a nt h ea d o p t i o no fo n l yo n eo ft h e m ，i n d i c a t i n gt h a th i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o nt e c h n i q u e h a s t e n e dt h ed e g r a d a t i o no fc h i t o s a nb yt h eo x i d a t i o no fh 2 0 2 ，w h i l ek e e p i n gi t so w ne f f e c t k e yw o r d ：h i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o nt e c h n i q u e ，c h i t o s a n ，d e g r a d a t i o n ，m e c h a n i c a l s c i s s i o n ，h y d r o g e np e r o x i d e i i 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：圳年6 月砑日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：f 茎3 垒囱2 1 5 f 年6 月力日 硕士学位论文高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 1 绪论 壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰处理而得到的一种多糖，具有很多优异的性能，在国民 经济各个行业中的用途越来越广泛，其中尤以医学、药物、化工、食品、化妆品、纺织 纤维等领域的应用最为活跃。 壳聚糖的分子量对其物理、化学及生理等方面的性质具有很大的影响，低分子量的 壳聚糖表现出更好的功能特性和应用前景，因此，通过降解以制备低分子量的壳聚糖成 为了研究的热点。目前，壳聚糖降解主要包括化学降解、酶降解和物理降解三种方法， 其中物理降解法因不会引入化学毒物而越来越受到人们的关注。本文将高压均质技术应 用到壳聚糖降解中，为利用物理方法制备低分子量壳聚糖提供参考。 1 1 甲壳素和壳聚糖 甲壳素是地球上数量仅次于纤维素的天然有机化合物，主要由动物生成，每年自然 界生物合成的甲壳素将近1 0 0 亿吨 1 1 。甲壳素在自然界的存在量虽然极为丰富，而且一 直在默默地为人类作出贡献，然而直到1 8 1 1 年，才被法国一位研究自然科学史的科学 家h b r a c o n n o t 发现，当时他用水、乙醇和稀碱反复处理蘑菇，最后得到一些呈纤维状 的白色残渣，就把它当作为一种纤维素，并命名为f u n g i d e ，意即真菌纤维素。1 8 2 3 年， 又一位法国科学家a o d i e r 从甲壳昆虫的翅鞘中分离出同样的物质，他没有进一步化验 此物质中是否含有氮，他认为此物质是一种新型纤维素，命名为c h i t i n ( 甲壳素) ，这个 词由希腊文衍变而来，意为被膜、铠甲。1 8 4 3 年，法国的a p a y e n 发现c h i t i n 与纤维素 不同，同年，另一位法国人j l l a s s a i g n e 发现c h i t i n 中含有氮，从而证明c h i t i n 不是纤 维素。1 8 7 8 年，g l e d d e r h o s e 用盐酸水解c h i t i n 得到氨基葡萄糖和醋酸。1 8 5 9 年，法国 人c r o u g e t 将c h i t i n 放在浓k o h 溶液中煮沸，洗净后可溶于有机酸中，1 8 9 4 年， f h o p p e s e i l e r 把这种化学修饰过的c h i t i n 叫做c h i t o s a n ( 壳聚糖) 【2 j 。19 0 9 年v o n f u r t h 与r u s s o 的研究表明，壳聚糖与酸形成结晶的盐类，并可由生物碱沉淀剂从酸中沉淀出 来，同年，l o w y 确定了壳聚糖的基本组成及硫酸壳聚糖的结晶形态。1 9 6 3 年，b u d a l l 根据x 衍射光谱得到的结果，提出了壳聚糖存在着0 【、p 、丫三种晶型：a 壳聚糖具有紧 密的组成，大多数结晶的多晶区是逆平行链状排列，d 壳聚糖的多晶型是平行链状排列， y 壳聚糖是两条链之间上下排列【3 】。从此，人们才对壳聚糖的化学结构、性质和制备方 法有了较透彻的了解。 自19 世纪6 0 年代起，对壳聚糖及其衍生物的研究开发变得十分活跃，尤其是近十 几年来研究工作更深入广泛。壳聚糖具有良好的化学物理性质，能拉丝、成膜制粒，能 通过化学改良物化特性，能和多种物质( 如胆固醇、脂肪、重金属、蛋白质、肿瘤细胞 l 绪论硕士学位论文 等) 结合，无毒且具有生物相容性，因而广泛用于许多领域。目前，日本和美国已大规 模生产壳聚糖，我国在2 0 世纪5 0 年代开始了这方面的研究开发，而且很快就成为生产 壳聚糖的主要国家，从8 0 年代开始，越来越多的科技工作者投入了这方面的研究。壳 聚糖及其衍生物应用的领域已涉及医药、食品、农业、水处理、化妆品、造纸、纺织、 印染等行业，前途十分广阔r 4 1 。 甲壳素是由n 乙酰2 氨基2 脱氧d 葡萄糖以p ( 1 ，4 ) 糖苷键形式连接而成的多糖， 其化学结构式如图1 1 1 所示： a 晦喁 图1 1 1甲壳素的化学结构式 也就是n 乙酰d 葡萄糖胺的聚糖。从结构式可以看出，如果将糖基上的乙酰氨基 ( c h 3 c o n h 一) 换成羟基( 一o h ) ，则便是纤维素( 如图1 1 2 所示) ： f 0 h h 0 h 0 d 图1 1 2 纤维素的化学结构式 因此，甲壳素与纤维素有着许多类似之处【5 1 。壳聚糖是甲壳素的n 脱乙酰基的产物， 其结构式如图1 1 3 所示： 2 c h , o h h n h 0 图1 1 3 壳聚糖的化学结构式 硕士学位论文 高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 一般而言，n 乙酰基脱去5 5 以上的就可称之为壳聚糖，它能够溶于1 乙酸或l 盐酸，因此，凡是能溶于1 乙酸或1 盐酸的甲壳素都可称之为壳聚糖。若作为有 实用价值的工业壳聚糖，则n 一脱乙酰度必须在7 0 以上。n 一脱乙酰度在5 5 7 0 范 围内的壳聚糖定义为低脱乙酰度壳聚糖，7 0 8 5 的定义为中脱乙酰度壳聚糖，8 5 9 5 的定义为高脱乙酰度壳聚糖，9 5 1 0 0 的定义为超高脱乙酰度壳聚糖。n 一脱乙 酰度1 0 0 的壳聚糖是极难制备的。凡是n 一脱乙酰度在5 0 以下的，都称之为甲壳素， 因为它不溶于上述浓度的稀酸。由此可见，甲壳素与壳聚糖的差别，仅仅是n 一脱乙酰 度不同而已。 目前，壳聚糖产品的研究及开发主要集中在降解壳聚糖、化学修饰和增加脱乙酰度 三个方面。其中，通过降解来制备低分子量的壳聚糖，因可以提高壳聚糖的性能，并扩 展其应用领域，而越来越受到人们的重视。 1 2 壳聚糖分子量对其性能的影响 壳聚糖具有生物活性 6 司、絮凝和吸附性【8 9 】、生物降解性m 1 2 1 、抗菌和抑菌性 1 3 1 6 1 、 吸湿性和保湿性 1 6 - 1 8 】、粘合性和成纤成膜性渺2 2 1 及其它许多优异性能2 3 - 2 6 ，而不同分子 量范围内的壳聚糖在性能上通常有不同的表现。一般说来，低分子量的壳聚糖由于链长、 键位、构象等化学结构与高分子量壳聚糖的差异，往往展现出独特的生理活性和功能性 质。前人的研究结果表明，壳聚糖的分子量对其物理、化学、生物性质均有很大影响， 当分子量降到一定程度时，壳聚糖许多特殊功能就能表现出来。 1 2 1 分子量对壳聚糖物理性质的影响 ( 1 ) 水溶性 壳聚糖为天然直链高分子化合物，分子中含有大量的- n h 2 和o h 。当壳聚糖降解时， 分子量下降，壳聚糖分子内的氢键作用随之减弱，使壳聚糖分子在溶液中有更大的扩展 趋势，从而引起壳聚糖分子构象发生变化。而分子链长度减短和分子构象的变化使水溶 液中各分子链间运动更加无序，分子链上游离n h 2 水合作用增强，从而使得壳聚糖的水 溶性大为改善 2 7 】。 ( 2 ) 溶致液晶性 汪剑炜等人渊报道了5 3 1 0 5 、1 4 7 1 0 6 、2 8 4 1 0 6 三种不同分子量的壳聚糖对溶 致液晶性的影响。研究发现分子量越小，重复单元越少，分子构象持续长度越短，则临 界浓度越高。三种壳聚糖在适当浓度的二氯乙酸溶液中都能呈现胆甾型液晶相，随着分 子量减小，平均螺距增大。 ( 3 ) 溶液流变性 王伟等人研究了壳聚糖分子量对其溶液流变性质的影响【2 9 】，结果表明壳聚糖稀溶液 3 1 绪论硕士学位论文 中，其分子量越小，分子链越短，键之间的缠结减少，表现出更好的流动性。 h ) 成膜性 壳聚糖具有良好的成膜性，已广泛应用于生物医学工程中。研究表明壳聚糖膜的结 晶性、力学特性、渗透性、透气透光性等特性与其分子量有很大关系【3 0 】：高分子量壳聚 糖膜的表面较为光滑，透光性较好，但透气性、渗透性和生物降解性较差；低分子量壳 聚糖膜的表面较为粗糙，透气性、渗透性和生物降解性较好，但透光性较差。 1 2 2 分子量对壳聚糖生理活性的影响 ( 1 ) 保湿增湿性 分子量的大小对壳聚糖的吸湿保湿性能具有决定性作用。低分子量壳聚糖分子中大 量的- n h 2 和o h 强极性基团的存在，不仅使其水溶性大为改观，还使其具有良好的保 湿增湿性。夏文水等【1 6 】人的研究表明：一定分子量的低分子量壳聚糖具有优于甘油和透 明质酸的吸湿保湿功能，并且随着壳聚糖分子量的减小，吸湿率逐渐增加。 ( 2 ) 抗菌抑菌性 低分子量壳聚糖具有明显的抗菌抑菌效果。夏文水等人【16 通过大肠杆菌抗菌抑菌活 性试验，证明了壳聚糖的抗菌抑菌效果是随着分子量的降低而逐渐升高的，而且通过对 比实验，表明游离氨基的存在是壳聚糖抗菌抑菌作用的基础。杨继生等人 3 1 研究表明， 将低分子量壳聚糖添加到酱油中，对引起酱油变质的酵母菌群有明显的抑制作用，可以 延长酱油的存放时间，而不影响其口感、颜色、香味和成分，证明了酱油中添加0 1 低分子量壳聚糖，在夏季敞开的条件下，可存放3 0 天不会变质。研究还发现壳聚糖随 分子量的降低，对革兰氏阴性菌抗菌性逐渐增强，其原因主要是分子量越小，越容易进 入细胞壁的空隙结构内，干扰细胞的新陈代谢，从而达到杀死细菌的目的。郑连英等人 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行抑菌试验【3 2 1 ，也获得了类似的结果。 ( 3 ) 抗肿瘤作用 研究发现，低分子量壳聚糖能更大限度地增强人体内巨噬细胞的吞噬功能及分泌水 解酶的活性，刺激巨噬细胞产生淋巴因子，启动免疫系统，有效提高机体的抗肿瘤免疫 功能。动物实验表明，低分子量壳聚糖的抗肿瘤活性大于已被公认的高抗肿瘤活性物质 痊疮丙酸杆菌的细胞壁骨架，其机理是能活化巨噬细胞、n k c 细胞、t 细胞和b 细胞，进而诱导体内干扰素产生。在日本，低分子量壳聚糖已被广泛应用，在配合药物 抑制肿瘤生长及转移方面较单一药剂有更显著效果 3 3 】。 ( 4 ) 降低胆固醇 低分子量壳聚糖是聚阳离子，易与胆汁结合并能全部排出体外，大大降低胆固醇酶 催化活性，阻碍胆固醇的转化吸收。同时低分子量壳聚糖能聚集带负电荷的脂肪，形成 屏障阻碍脂肪消化酶活化从而抑制脂肪消化吸收。较低浓度的低分子量壳聚糖就能有效 4 硕士学位论文 高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 地阻止脂肪消化酶活化。另外，低分子量壳聚糖与胆汁酸结合并排出体外后，胆固醇在 肝脏中迅速转化成胆汁酸，大大减少了进入血管内的胆固醇总量。 ( 5 ) 动植物活性 s h i g e h i r o 等人【3 4 】将低分子量壳聚糖注射到兔子静脉中，发现可提高血浆中溶菌酶活 性2 到3 倍，大大增强了兔子对致病菌的免疫力。日本有关学者通过对大豆、南瓜等试 验，发现低分子量壳聚糖可诱导植物抗毒素产生，激活植物抗病系统，提高其抗病力。 另外，低分子量壳聚糖还能加速蛋白质合成，促进植物细胞活化，从而刺激植物快速地 生长。 1 3 低分子量壳聚糖的应用 鉴于低分子量壳聚糖具有多种特殊的功能性质和生理活性，它在食品、生物医药、 日用化妆品、农业等方面具有独特的应用价值。 ( 1 ) 在食品工业方面的应用 低分子量壳聚糖作为一种具有生物活性的天然高分子化合物，具有低甜度、低热值、 降血脂、降血糖等功效，而且无毒、无副作用。以低分子量壳聚糖为主要原料生产的生 物保健品，不仅有利于人体肠内双歧杆菌的增殖，同时可抑制肠内有毒菌和腐败物质的 生成，增加人体内纤维素的质和量，提高机体的免疫力。低分子量壳聚糖的保健功能并 不限于某些特定的器官，而是可作用于人体全身，而且低分子量的壳聚糖产品更有利于 人体的快速吸收【3 5 1 。此外，低分子量壳聚糖还可以用作保鲜剂、增稠剂、稳定剂，保健 食品添加剂、饮料澄清剂及无任何毒副作用的理想的调味品防腐剂，也可作为微量元素 鳌合剂【36 ，成为一类新的功能性食品添加剂。 ( 2 ) 在生物医药方面的应用 低分子量壳聚糖具有促进脾脏抗体生成、抑制肿瘤生长的生理功能，可通过活化人 体中的淋巴细胞、抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌抑癌作用【3 7 1 ，对治疗骨病也极有 疗效。低分子量壳聚糖还可用作诊断试剂。溶菌酶存在于人的血、尿中，当有某种疾患 时病人则显示出溶菌酶高于正常值。利用这一特性，低分子量壳聚糖被用于溶菌酶活性 的临床诊断或医药、食品的质量检验。此外，低分子量壳聚糖可有效地降低肝脏和血清 中的胆固醇，增强免疫力和抗疾病能力，强化肝脏功能，防止痛风和胃溃疡 3 8 1 。低分子 量壳聚糖的分子结构与人体内存在的氨基葡萄糖结构相似，即具有类似于人体骨胶原组 织的结构，这赋予了低分子壳聚糖极好的生物医药特性，使其拥有理想的生物相容性和 生物活性，具有抑菌、止血、消炎、镇痛、促进伤口愈合等作用，其纤维可做成手术缝 合线、止血棉、纱布、绷带、创可贴等各种医用敷料，还可用混合纺丝法将其制成无纺 布的人造皮肤或抗菌纤维。日本富士纺织株式会社于1 9 9 6 年首次将这种抗菌纤维和棉 混纺制成布料，制成了商品化的婴儿内衣产品，为婴儿提供可靠的生理保护【3 9 1 。 5 1 绪论硕士学位论文 ( 3 ) 在化妆品方面的应用 低分子量壳聚糖在日用化妆品方面的应用，主要是利用其优良的保湿增湿性、成膜 性、抗静电性，以及对皮肤无刺激、无毒等特性。低分子量壳聚糖本身具有成膜功能， 又具有良好的透气性能，是一种强的吸湿剂和保湿剂，与传统的保湿增湿剂相比，低分 子量壳聚糖的保湿增湿效果更佳，在洗发膏、护发剂、洗面奶及各类护肤液、护肤霜、 面膜中使用更显其优越性 4 0 。4 1 1 。 ( 4 ) 在农业方面的应用 低分子量壳聚糖在植物生长、分化及生物体抗御方面具有信息传达活性，可用于制 备液体复合肥料的添加剂，还可用作种子包衣，防止有害物质及病毒对种子的损害。除 此之外，还可用作降解性地膜、农药、土壤改良剂和植物生长调节剂等。低分子量壳聚 糖含量大于8 0 时，在多个品种的水果、蔬菜、粮食等的抗病虫害和促进生长方面有显 著作用【4 2 1 。 综上所述，低分子量壳聚糖以其多种独特的功能性质，在医药、食品、化妆品、和 农业等方面具有广泛的用途。随着越来越多的国家和研究机构在低分子量壳聚糖性能和 用途方面的大力研究，必将使低分子量壳聚糖产品的开发与应用得到迅速的发展。 1 4 壳聚糖降解的方法 壳聚糖分子量的大小对壳聚糖的许多性能尤其是壳聚糖的生理活性有着很大的影 响，而低分子量的壳聚糖由于链长等化学结构存在特殊性，往往展现出独特的生理活性 和功能性质。因此，制备低分子量的壳聚糖成为人们研究的热点。目前，国内外学者提 出了许多各具特色的降解方法，以制备低分子量的壳聚糖，综合起来大致可概括为化学 降解法、酶降解法和物理降解法三类。 1 4 1 化学降解法 1 4 1 1 酸降解法 壳聚糖很容易溶于稀酸溶液中，但是要用酸对壳聚糖进行降解反应以制备低分子量 壳聚糖，必须强化其反应条件。早在2 0 世纪5 0 年代就有人用酸对壳聚糖进行降解，得 到了低分子量壳聚糖。目前，己有多种以酸作为主要反应试剂的降解壳聚糖的方法，较 有代表性的几种如下： ( 1 ) h c l 降解法 用酸和碱将壳聚糖纯化后，加入浓盐酸进行降解反应，反应4 8 h 后的溶液在真空瓶 中冷却，然后用乙醇洗涤、浓硫酸真空干燥后，制得聚合度较小的壳聚糖盐酸盐【4 3 1 。 ( 2 ) 酸亚硝酸盐法 将壳聚糖溶于乙酸或盐酸稀溶液中，然后加入亚硝酸盐( 如n a n 0 2 ) 进行降解反应， 6 硕士学位论文高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 或是先将壳聚糖分散于亚硝酸盐的水溶液中，然后在室温下慢慢加入一定浓度的酸进行 反应。反应2 锄后，用碱调节溶液的p h 为5 “，经净化分离得到降解产物【4 4 1 。其反应 机理被认为是：h 2 n 0 2 + 选择性地进攻壳聚糖分子中的氨基，使得聚合物的p 糖苷键断 裂 4 5 】，其反应机理见图1 4 1 1 ： o r 2 一勰旦o 斛掰耍r 2 v 磊。、h + h 2 n 0 2 ( h o n o + 丑向+ r 2 n 十n 2 + o 图1 4 i 1 酸亚硝酸盐法反应机理 ( 3 ) 过醋酸法 以过醋酸或浓硫酸为催化剂，用h 2 0 2 先将醋酸酐( a c 2 0 ) 氧化成过醋酸 ( c h 3 c o o o h ) ，然后加入到壳聚糖的乙酸溶液中进行降解反应。利用这种方法制备的低 分子量壳聚糖产品具有可以长期存放的特点，较适用于食品及化妆品用的低分子量壳聚 糖的生产【4 6 】。 ( 4 ) 其它酸降解法 除了上面几种酸降解法外，其他的酸降解法还有浓硫酸法和氢氟酸法。浓硫酸法是 在某些无机酸( 如h c i ) 中加入6 5 的浓硫酸对壳聚糖进行降解反应，反应一定时间后再 用体积比为( 5 7 ) ：l 的m e 2 c o h 2 s 0 4 混合液进行处理，得到较高收率的低分子量壳聚糖 产品 4 刀。氢氟酸法是将壳聚糖溶于稀酸中，加入h f 溶液，然后和未反应掉的h f 一起 过滤，将滤液冷冻干燥、分离，可得到低分子量壳聚糖4 8 1 。 1 4 1 2 氧化降解法 氧化降解是目前研究比较多的一种壳聚糖的降解方法，较有代表性的几种氧化降解 法如下【4 9 】： ( 1 ) h 2 0 2 氧化法 将壳聚糖溶于l 的乙酸溶液中，在催化剂存在下，加入适量的h 2 0 2 溶液，调节溶 液的p h 值为3 5 进行降解反应；也可以在碱性条件下反应，调节壳聚糖溶液的p h 值 为1 1 5 ，温度7 0 c 左右，分批加入一定量3 5 h 2 0 2 溶液进行降解反应。 ( 2 ) h 2 0 2 - h c l 法 将壳聚糖溶解在稀盐酸中，加入适量n a o h 溶液使其形成悬浊液，然后加入一定量 的h 2 0 2 溶液在7 0 。c 下进行降解反应；也可以在壳聚糖的稀酸溶液中，直接加入2 8 的 h 2 0 2 和浓h c l 溶液在8 0 下进行降解反应，得到低分子量壳聚糖。 ( 3 ) 其它氧化降解法 除了上面所述的两种h 2 0 2 氧化法外，其它的一些氧化法还有n a b 0 3 法、c 1 0 2 法和 c 1 2 氧化法。这几种氧化降解方法，从目前研究进展来看，还只能得到分子量较高的降 7 1 绪论硕士学位论文 解产物。 1 4 2 酶降解法 酶法降解是用专一性酶或非专一性酶来对壳聚糖进行生物降解而得到分子量较低 的壳聚糖。目前，已发现有3 0 多种酶可用于壳聚糖的降解。这些酶主要包括专一性降 解酶( 如壳聚糖酶) 和非专一性降解酶( 如脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶、元酶、聚糖酶等) 。 1 4 2 1 专一性水解酶对壳聚糖的降解 专一性水解酶主要是指壳聚糖酶( c h i t o s n a a s e ) ，它主要存在于真菌细胞中。自然界中 真菌和无脊椎动物( 主要结构成分为甲壳素) 的壳聚糖年产量估计高达数十亿吨，它们的 降解主要由细菌和真菌分泌的甲壳素酶( c h i t i n a s e ) 来完成，或者通过脱乙酰化作用形成壳 聚糖，再由壳聚糖酶来降解。t a s k i g u c h i l 5 0 1 使用芽孢杆菌属s e 7 m 株得到的壳聚糖酶对 壳聚糖进行降解，成功得到了聚合度较小的壳聚糖。v e v a r i a m o v 等【5 i 】以从b a c i l l u s s p 7 3 9 产生的壳聚糖酶对脱乙酰度为8 54 - 2 的壳聚糖在乙酸缓冲溶液中进行降解，酶 底比为4 u g ，p h 值为5 2 0 ，在5 5 下反应1 小时，得到低分子量壳聚糖。 1 4 2 2 非专一性水解酶对壳聚糖的降解 ( 1 ) 溶菌酶 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 存在于鸡蛋蛋白、人的血清及唾液中，其中从鸡蛋蛋白中提取的 溶菌酶的转糖苷化能力较强，而从人的血清及唾液中提取的溶菌酶裂解 3 - ( 1 ，4 ) 糖苷键能 力较强 5 2 】。 ( 2 ) 脂肪酶 脂肪酶( 1 i p a s e ) 是作用在水有机界面上不溶性底物的酶。近年来，脂肪酶对壳聚糖 的降解作用已引起了不少学者的兴趣。p 锄a l e o n e 5 3 1 等研究了不同来源的5 种脂肪酶( 1 种来自猪胰腺、其余4 种来自真菌) 在p h = 3 6 时对壳聚糖的降解作用，发现来自猪胰腺 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 的脂肪酶( l i p a s e a t e ) 对壳聚糖有强烈的降解作用，超过了壳聚糖酶的 水解作用。m u z z a r e l l i 等【5 4 j 的研究结果表明，在2 5 c 、微酸性条件下，壳聚糖很容易被 麦胚脂肪酶降解。 ( 3 ) 蛋白酶 y a l p a n i 等【5 5 】研究了胃蛋白酶( p e p s i n ) 、菠萝蛋白酶( b r o m e l a i n ) 、无花果蛋白酶( f i c i n ) 和胰液素( p a n c r e a t i o n ) 对壳聚糖作用后发现，它们对壳聚糖都有明显的降解作用，其降 解能力甚至超过了壳聚糖酶和溶菌酶的降解能力。 ( 4 ) 其它非专一性酶 迄今为止，己发现有近4 0 种各类水解酶对壳聚糖有部分或完全非专一性水解作用。 除了上述几种酶以外，半纤维素酶的降解百分比达9 3 ，葡萄糖酶的降解百分比为 7 0 一8 0 。y a l p a n i 5 5 】等研究表明，在一定的酶与底物比率下，半纤维素酶具有比壳聚 8 硕士学位论文高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 糖酶及溶菌酶更好的降解能力。 1 4 3 物理降解法 除了上述降解方法外，我们还可以用物理的方法来降解壳聚糖，近年来由于可以尽 量避免化学杂质的介入，物理方法越来越受到人们的重视。下面介绍几种常见的物理降 解法： ( 1 ) 光降解法 紫外线、可见光和红外线对壳聚糖的辐照可以引起光降解反应。光降解过程中壳聚 糖分子链上的乙酰胺基葡萄糖单元发生脱乙酰化反应，同时使b ( 1 ，4 ) 糖苷键断裂，而且 降解过程中生成了羰基。 ( 2 ) 超声波法【5 6 】 超声波对壳聚糖的降解作用是十分明显的。选用适当频率和功率的超声波照射壳聚 糖，能有效地将大分子链切断。日本的景世兵等用2 8k h z 的超声波对溶解于稀盐酸之 中的壳聚糖作用3 0 h ，得到了相对分子质量较低的产品。升高温度和延长照射时间有利 于降低产物的分子量。另有研究表明，延长超声波的作用时间可以使降解产物的相对分 子质量分布明显变窄，从而得到较为均一的、相对分子质量低的壳聚糖，同时降解过程 中氨基的含量不变。 ( 3 ) y 射线辐射法 壳聚糖在y 射线的照射下可发生降解反应。红外光谱分析表明，在y 射线的照射下， 壳聚糖主链上的1 3 ( 1 ，4 ) 糖苷键发生断裂，导致相对分子质量下降，辐射降解过程中没有 产生羰基，也没有使壳聚糖发生交联、形成支链或网状结构。胡健等人采用y 射线辐射 2 的壳聚糖溶液【5 。7 1 ，辐射后，用乙醇和乙醚将降解产物分离，对所得的沉淀物用无水 乙醇洗涤，发现降解产物分子量随辐射剂量的增加而减小，分子量的均一程度随着辐射 剂量的提高而提高。 ( 4 ) 微波法 微波辐照在有机合成方面已经受到人们越来越多的关注，因为它能显著地将一些常 规反应的效率提高，近年来微波加热技术在降解壳聚糖方面也取得了进展。微波法降解 壳聚糖5 8 1 可以使甲壳质脱乙酰化反应与壳聚糖降解反应同时进行，这样降低了甲壳质脱 乙酰化反应过程的碱用量，缩短了反应时间，有效地降低了成本。 ( 5 ) 高温裂解法 将壳聚糖原料置于2 8 0 环境下进行热降解，研究发现降解后壳聚糖产物在 1 5 9 0 c m 。处对应的氨基吸收减弱，1 6 5 0 c m _ 处对应的乙酰基吸收增强，这些变化可能是 由于毗喃环受热后被破坏所引起，还可能是由于大量壳聚糖链发生热交联所引起的，此 外，热降解后8 9 3 、1 1 5 3 c m 。对应的糖的特征吸收减弱，并且峰形变宽，这些信息表明 9 l 绪论硕士学位论文 壳聚糖热降解后1 3 ( 1 ，4 ) 糖苷键断裂。壳聚糖受热后主链可能发生了无规降解，在c 0 c 链上某点先发生断裂，主链与乙酰氨基侧链可能存在交互作用，从而促进了主链的降解。 1 4 4 各种降解方法的比较 下面对各种主要的壳聚糖降解的方法进行比较： ( 1 ) 酸降解法可分离得到低至单糖的各种低分子量壳聚糖，其降解反应所用试剂价廉 易得，易于实现工业化，但酸降解法制备得到低分子量壳聚糖的产率较低，并且降解产 物的分子量分布很宽，另外，酸降解法引入了强酸，这给环境造成了一定的污染。 ( 2 ) 氧化降解法原理简单，见效快，成本适中，但可能引入毒物，产品质量不易控制， 且有些方法还只能得到分子量较高的降解产物。 ( 3 ) 酶降解法是在较温和的条件下直接进行的，不需要加入大量的化学试剂，对环境 污染少，是一种很有前途的降解方法，但关键问题是成本目前还相当高。 ( 4 ) 物理降解法设备单一，操作过程简单，不会引入杂质，也不会造成污染，但一些 关键技术尚待突破。 从降解机理、原料、质量控制、环保及成本等方面综合考虑，物理降解法必将是未 来发展的趋势之一。本文根据国内外壳聚糖降解研究的现状，结合设备技术的发展，采 用高压均质技术切断高分子链，来机械降解壳聚糖。 1 5 高压均质技术简介 均质技术是一种非常重要的细化分散技术，广泛应用于乳品、饮料、食品、化妆品 和化工行业等。多年来，应用最多的便是高压均质技术，它依靠高压均质机来实现。高 压均质机是一种应用广泛，效果显著，已系列化、标准化和专业化的均质设备。高压均 质机由高压泵和均质阀两部分组成，高压泵通常采用柱塞往复泵，其结构与一般柱塞泵 相同。均质阀安装在柱塞泵的排出管路上，一般由阀芯和阀座构成，阀芯和阀座的结构 形式对均质效果、能耗以及阀的磨损影响极大。 高压均质流程为：物料一柱塞泵一均质阀。一般认为，高压均质过程主要发生 在均质阀( 见图1 5 1 ) 处，被均质物料通过阀座与阀杆间大小可调的间隙h ( 一般为0 1 m m 级别) 时，其流速在瞬间被加速到2 0 0 3 0 0 m s ，从而产生巨大的压力降，当压力降低到 工作温度下液体的饱和蒸汽f 5 ( 或空气分离压) 时，液体就丌始“沸腾 ，迅速“汽化”， 内部产生大量汽泡。含有大量微汽泡的液体朝缝隙出口流出，流速逐渐降低，压力又随 之提高，压力增加到一定值时，液体中的汽泡突然破灭而重新凝结，汽泡在短时间内大 量生成和破灭就形成了空穴现象。空穴现象似无数的微型炸弹，能量剧烈释放产生强烈 的高频振动，同时伴随着急速的湍流产生的强烈的剪切力，液体中的软性、半软性颗粒 就在空穴、湍流的剪切力的共同作用下被粉碎成微粒，其中空穴效应所起作用被认为较 l o 硕士学位论文高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 大。被粉碎的微粒接着又高速冲击到冲击环上，被进一步粉碎和分散。 h 阡一 l r ) 1 图1 5 1 均质阀示意图 高压均质机中物料的均质化主要来自三个方面：空穴作用、湍流作用和碰撞作用。 目前有关均质机的均质作用机理，主要有3 种理论：剪切理论、撞击理论和空穴理论。 这3 种作用机理可同时存在于某种结构的均质阀中，但也可通过阀的结构设计使其中的 某一机理起主要作用。近年来，已有部分国外学剖5 蛐i 】应用高压均质技术处理高分子聚 合物，取得了一些不同的成果。其中，将高压均质机所产生的强大能量作用于多糖及其 它天然高分子，将可以获得更高经济价值的产品，具有诱人的发展前景。 1 6 本文的主要研究内容 从壳聚糖的发展历史和它在各个行业中的应用可以看出，壳聚糖是一种非常有前途 的生物资源，而分子量较低的壳聚糖性能更优，应用更为广泛。所以研究壳聚糖的降解 方法，获得较低分子量的壳聚糖，对充分挖掘壳聚糖的利用价值，具有非常重要的意义。 如前所述，从环保、产品性能等方面考虑，壳聚糖的物理降解法具备十分广阔的发展前 景。本文将高压均质技术应用到壳聚糖降解中，充分利用高压均质机所产生的强大机械 力，切断壳聚糖分子链以达到降解的目的，为物理降解法的发展提供参考。 本文的主要研究内容如下： ( 1 ) 选择合适的方法对壳聚糖的脱乙酰度、分子量等基本性能进行测定，以确定壳聚 糖原料及其降解产物的表征手段。 ( 2 ) 采用高压均质技术降解壳聚糖，考察原料分子量、壳聚糖溶液浓度、h a c 溶液 浓度、均质压力及温度等因素对降解效果的影响，分析降解产物性能及结构的变化，并 推断降解机理。 ( 3 ) 初步建立高压均质技术降解壳聚糖的理论模型，并分析所使用的高压均质机对处 理对象产生的机械作用和可能的作用机理。 ( 4 ) 采用高压均质技术与h 2 0 2 氧化法联合降解壳聚糖，考察h 2 0 2 溶液浓度、壳聚糖 溶液浓度、h a c 溶液浓度、均质压力及温度等因素对降解效果的影响，分析降解产物性 能及结构的变化，以推断联合降解机理，并对比高压均质h 2 0 2 联合降解、高压均质降 解以及h 2 0 2 氧化降解三种不同方法的降解效果。 2 壳聚糖基本性能的测定硕士学位论文 2 壳聚糖基本性能的测定 不同来源的原料、不同的制备条件及反应条件所制得的壳聚糖性能不同。除了来源 不同以外，最为重要的便是脱乙酰化反应，这是影响原料壳聚糖性能的关键因素，而甲 壳素在浓碱高温或酶解反应条件下，除发生脱乙酰化反应外，还伴随着分子主链的降解 反应，致使分子量降低。脱乙酰度和分子量是反映壳聚糖性能的两个重要指标，本文采 用酸碱滴定法来测定壳聚糖的脱乙酰度，用粘度法和凝胶渗透色谱来考察壳聚糖的相对 分子量及其分布。 2 1 壳聚糖脱乙酰度的测定 壳聚糖的脱乙酰度( d d ) ，也就是壳聚糖分子链上自由氨基的含量，是一项极为重要 的技术指标。壳聚糖的脱乙酰度可定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基占壳聚糖分 子中总的糖残基的百分数。壳聚糖脱乙酰度的高低，直接关系到它在稀酸中的溶解能力、 粘度、离子交换能力、絮凝性能和与氨基有关的化学反应能力。目前文献中提到的方法 有碱量法( 包括酸碱滴定法、电位滴定法、氢溴酸盐法等) 、红外光谱法、胶体滴定法、 热分析法、气相色谱法、元素分析法、紫外光谱一阶导数法、紫外光谱法、苦味酸分光 光度法等 6 二6 4 。本文采用仪器简单，操作简便的酸碱滴定法，并使用甲基橙苯胺蓝混 合指示剂滴定。 2 1 1 酸碱滴定法的基本原理 酸碱滴定法是比较简单的一种测定壳聚糖自由氨基含量的方法，不需要特殊的仪 器，操作简便，试剂易得，特别适合于生产、实验过程中测定壳聚糖产品的脱乙酰度。 其原理是：壳聚糖的自由氨基呈碱性，可与盐酸定量地发生质子化反应( 如图2 1 1 1 所 示) ，形成壳聚糖的胶体溶液。 1 2 图2 1 1 1 壳聚糖与酸发生质子化反应示意图 硕士学位论文高压均质技术在壳聚糖降解中的应用研究 然后，溶液中游离的氢离子再用碱反滴定，这样，从用于溶解壳聚糖的酸量与滴定 用去的碱量之差，即可推算出试样中壳聚糖自由氨基的含量，从而计算出壳聚糖的脱乙 酰度。 过去酸碱滴定法一直使用甲基橙作为指示剂，由于甲基橙在胶体溶液中从红至橙的 变色不如真溶液中灵敏，从而使得滴定终点较难判断，造成较大误差，有时高达1 0 ， 本文采用甲基橙一苯胺蓝混合指示剂代替甲基橙【6 5 】，颜色变化从紫色至蓝黑色，采用这 种混合指示剂测定壳聚糖脱乙酰度，变色灵敏度得到了显著提高。 2 1 2 实验试剂和仪器 试剂：编号分别为、b 群、d 撑、的壳聚糖( 山东奥康生物科技有限公司产品， 来源于海蟹壳) ；盐酸( h c l ，3 6 3 8 ) ，氢氧化钠( n a o h ) 等，均为分析纯；苯胺蓝，甲 基橙。 仪器：s c 6 9 0 2 c 型水分快速测定仪( 上海精密科学仪器公司) ，a b l 0 4 n 电子分析 天平( 上海m e t t e rt o l e d o 有限公司) ，碱式滴定管，容量瓶，锥形瓶。 2 1 3 实验方法 准确称取1 0 5 。c 下烘干至恒重的o 1g 壳聚糖原料，置于1 0 0m l 锥形瓶中，加入o 1 m o l l 盐酸标准溶液3 0m l ，再加入2 0 m l 蒸馏水，在常温下搅拌至溶解完全，加入1 2 滴已配好的混合指示剂，其配比为甲基橙( 1 ) ：苯胺蓝( 1 ) = 1 ：2 ( v v ) ，用o 1m o l l 氢氧化钠标准溶液滴定游离盐酸，当溶液颜色从紫色变至蓝黑色时，即为滴定终点。重 复测试3 次，取平均值计算其脱乙酰度。 2 1