（细胞生物学专业论文）提高昆白小鼠二倍体孤雌胚生成效率的激活方式研究.pdf

摘要 提高昆白小鼠二倍体孤雌胚生成效率的激活 方式研究 摘要 孤雌胚胎干细胞是一种新的治疗性克隆胚胎干细胞，与体细胞克隆胚胎干细 胞相比具有与其来源动物完全相同的组织相容性抗原，可以用以组织细胞的替代 疗法，在人医学上应用前景广阔，意义重大。体细胞克隆胚胎干细胞是近年来全 世界研究能够用于组织替代治疗无性繁殖途经的热门课题，但是取于患病动物的 体细胞是一种隐含有突变基因的分化细胞，不但克隆囊胚生成率很低，而且隐含 有突变基因胚胎干细胞的质量也存在问题，与此相比孤雌胚胎干细胞则来源于具 端粒酶活性且尚未经历个体分化途经的生殖细胞，理伦上这种来源于生殖细胞的 干细胞不存在当代受治疗动物的突变基因。 但目前从孤雌囊胚分离获取孤雌胚胎干细胞的成功率很低，研究表明，孤雌 胚胎干细胞的低分离率在很大程度上与孤雌囊胚细胞的染色质倍性有很大关系 【1 ，2 j ，而孤雌囊胚的染色质倍性又与卵母细胞激活后激活卵的染色质倍性核型呈 正相判2 1 。目前研究者都不加选择的应用未知核型来源的囊胚获取干细胞，事实 上从理论上分析只有杂合二倍体核型的囊胚细胞与正常胚胎的体细胞核型具有相 似的发育潜力，因此孤雌胚胎染色体核型有可能严重影响孤雌囊胚的生成比率和 胚胎干细胞的分离筛选效率。然而，孤雌胚胎一旦做了核型分析后将不复存在， 很难通过核型分析直接验证何种染色体核型的孤雌胚胎分离提取干细胞的成功率 高。但是，从孤雌胚胎不同染色体核型来源于不同激活程度的成熟卵母细胞可知， 人工激活卵母细胞的方法对孤雌胚胎染色体核型的生成具有直接的影响。 本研究根据激活卵母细胞的原理，人工选择5 种激活方法并对激活的卵母细 胞进行染色质倍性观察，通过检测囊胚生成比率，比较不同类型激活卵的孤雌胚 胎发育率，通过优选激活方法生产孤雌囊胚，应用杂合二倍体核型比例高的孤雌 囊胚分离筛选孤雌胚胎干细胞，旨在探索一条能够有效分离出来用于克隆性治疗 目的孤雌胚胎干细胞的孤雌囊胚生成途径。试验总结如下： 试验1 ：提高昆白小鼠杂合二倍体孤雌囊胚生成比率的孤雌激活方法研究。 试验通过5 种不同化学方法激活昆白小鼠成熟卵母细胞，在显微操作仪下观察激 活卵第二极体是否排出并进行核型分析，旨在研究不同激活方法所得到激活卵的 倾向类型，并对不同染色质倍性的激活卵体外培养发育至囊胚，比较其发育率， 两南大学7 矛! l ：学位论文 选择生成二倍体孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法。结果发现：( 1 ) 乙醇及s r c l 2 单独激活后出现单倍体的比率较高；而乙醇联合6 - d m a p 以及s r c l 2 联合c b 激 活后出现杂合二倍体的比率较高；( 2 ) 1 0 的乙醇单独作用1 0 m i n ，卵母细胞激 活率最高，达到6 3 3 ，在激活卵的原核类型上，2 细胞( 嵌合单倍体) 的比率 较高，但随后囊胚的发育率较差( 6 7 ) ：( 3 ) 1 0 的乙醇处理5 m i n ，再用2 m m 6 d m a p 处理2 h 、4 h 、6 h ，激活率随时间增长而提高( 3 7 8 ，3 9 7 ，7 5 o ) ， 作用6 h 的激活率最高( 7 5 0 ) ；在激活卵的原核类型上，乙醇联合6 - d m a p 激 活后抑制第二极体排出情况下出现2 个原核的杂合二倍体的比率较高，且囊胚的 发育率也显著高于乙醇单独激活( 1 6 7 v s 6 7 ，p 0 0 5 ) ；在激活卵的原核类型 上，s r c l 2 单独激活后出现单倍体类型的比率较高，而联合c b 后出现杂合二倍体 的比率较高，且囊胚发育率与s r c l 2 单独作用相比差异显著( 2 2 7 v s 8 1 ， p 0 0 5 ) 。 试验3 ：单倍体与二倍体孤雌囊胚干细胞分离的初步研究。根据试验1 的结 论获得杂合二倍体及单倍体孤雌胚。由试验2 可知全胚法和免疫血清法分离类干 细胞集落形成率差异不显著，但考虑到孤雌囊胚在体外处理时间过长，胚胎不易 穿破透明带使得囊胚的孵化率和贴壁率降低的因素，因此选用免疫血清法分离两 n 捅蛰 种类型的孤雌囊胚干细胞，并采用a k p 染色做初步鉴定，旨在比较单倍体孤雌囊 胚和二倍体孤雌囊胚分离出类e s 细胞集落的差异程度。结果发现：( 1 ) 共将3 1 6 个小鼠卵母细胞孤雌激活，获得二倍体孤雌囊胚6 8 个( 囊胚形成率2 1 5 ) ，采 用免疫血清法分离干细胞，最后出现2 个类e s 细胞样集落，集落形成率为3 ( 2 6 8 ) ；( 2 ) 4 4 8 个卵母细胞得到单倍体孤雌囊胚5 8 个( 囊胚形成率1 2 9 ) ， 采用免疫血清法分离干细胞，最后只出现1 个类e s 细胞样集落，集落形成率为 1 7 ( 1 5 8 ) ；( 3 ) 集落具有典型的e s c s 形态，a k p 检测为阳性，说明所得到的 类e s 细胞样集落具有与胚胎干细胞类似的多能性。结果表明：选择二倍体孤雌 囊胚比单倍体孤雌囊胚分离获取类e s 细胞集落的比率高( 3 v s l 7 ) ，其集落形 成率两者差异不显著( p 0 0 5 ) 。 结论：采用1 0 m ms r c l 2 结合5 u g m l c b 作用4 h 的激活方法对昆白小鼠成熟卵母 细胞激活后能够有效抑制第二极体排出，获得较多杂合二倍体孤雌胚胎，与单倍 体孤雌胚相比，其发育形成孤雌囊胚的比率明显提高。对二倍体孤雌囊胚采用免 疫血清法去除透明带后置于含l i f 丰u i g f 的胚胎干细胞培养液的饲养层上增殖，可 以分离得到类p e s 细胞集落，其分离效率较单倍体孤雌胚高。因此，在研究使用孤 雌胚干细胞作为新的组织细胞替代性治疗途径时，选择1 0 m ms r c l 2 结合5 u g m l c b 作用4 h 的孤雌激活方法，能够获得较多杂合二倍体孤雌囊胚，并对这种囊胚采用 免疫血清法去除透明带后，比较容易分离得到类孤雌胚胎干细胞。+ 关键词：昆白小鼠卵母细胞孤雌激活激活卵核型孤雌囊胚发育 i i i 两南大学硕十学位论文 t h er e s e a r c ho n p a r t h e n o - a c t i v a t i o nm e t h o d t o i m p r o v et h ef o r m a t i o nr a t eo fh e t e r o z y g o u s d i p l o i db l a s t u l a a bs t r a c t p a n h e n o g e n e t i cs t e mc e l l ，an e wk i n do ft h e r a p e u t i cc l o n i n ge m b r y o n i cs t e mc e l l ， o w i n gt oi t si d e n t i c a lm h cw i t ho r i g i n a la n i m a l ，c a na p p l yt oh i s t i o c y t i cs u b s t i t u t e t h e r a p e u t i c sc o m p a r e dt os o m a t i cc l o n i n ge m b r y o n i cs t e mc e l l t h el o wr a t eo fc l o n i n g b l a s t u l ad e v e l o p m e n ta n dq u a l i t yp r o b l e m so fo b t a i n e de m b r y o n i cs t e mc e l l ，m a k et h e a p p l i c a t i o n s o fs o m a t i c c l o n i n ge m b r y o n i c s t e mc e l lh a v es o m el i m i t s b u t p a r t h e n o g e n e t i cs t e mc e l l i so b t a i n e df r o mg e r mc e l lw h i c hs t i l ln o te x p e r i e n c e d c l e a v a g e 、p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n s ot h i sk i n do fs t e mc e l ld o e s n tc o n t a i n m u t a b l eg e n e so f s u f f e r i n ga n i m a l si nt h e o r i e s a tp r e s e n t ，t h ei s o l a t i o nr a t eo fp a r t h e n o g e n e t i cs t e mc e l lf r o mp a r t h e n o b l a s t u l a i sv e r yl o w t h er e s e a r c hi n d i c a t e st h a tt h el o wi s o l a t i o nr a t eh a sg r e a tr e l a t i o n s h i pw i t h t h ek a r y o t y p eo fp a r t h e n o - b l a s t u l a ，w h i l et h a ta g a i nh a sc o r r e l a t i o nw i t ht h ek a r y o t y p e o fa c t i v a t e do o c y t e n o wm o s tr e s e a r c h e r sa p p l yu n k n o w nk a r y o t y p eb l a s t u l at oi s o l a t e t h es t e mc e l lw i t h o u tc h o i c e i nf a c t ，o n l yb l a s t u l ac e l lw i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i d k a r y o t y p e h a ss i m i l a rd e v e l o p m e n ta b i l i t i e sw i t hn o r m a ls o m a t i cc e l li nt h e o r i e s s ot h e k a r y o t y p eo fp a r t h e n o - b l a s t u l am a y b ei n f l u e n c e si t sd e v e l o p m e n ta n di s o l a t i o nr a t eo f s t e mc e l ls e r i o u s l y a n dt h ed i f f e r e n tk a r y o t y p e so fp a r t h e n o b l a s t u l ac o m ef r o m m a t u r e do o c y t e sa c t i v a t e db yd i f f e r e n ta c t i v a t o r s s ot h ep a r t h e n o - a c t i v a t i o nm e t h o d s h a v ed i r e c tr e l a t i o n s h i pw i t ht h ef o r m a t i o no fp a r t h e n o - b l a s t u l ak a r y o t y p e s i nt h i se x p e r i m e n t ，o o c y t e sw e r er e c o v e r e df r o mm i c ek i l l e da f t e r1 8h o u r s ， d e n u d e do fc u m u l u sw i t hh y a l u r o n i d a s e t h ef o r m a t i o no fd i f f e r e n tp a r t h e n o g e n e t i c a c t i v a t i o nt y p ea n db l a s t o c y s t d e v e l o p m e n tr a t eo ft h er e s u l t i n gp a r t h e n o g e n e t i c e m b r y o st r e a t e dw i t hf i v ea c t i v a t o r sw e r ei n v e s t i g a t e da n db yc h o o s i n gb e s ta c t i v a t i o n m e t h o dt op r o d u c eb l a s t u l aw i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p et oi s o l a t et h es t e mc e l l i no r d e rt of i n dae f f e c t i v eb l a s t u l af o r m a t i o nm e t h o du s e dt oi s o l a t et h es t e me e l lf o r c l o n i n gt h e r a p e u t i co b j e c t i v e s e x p e r i m e n ts u m m a r i z e da sf o l l o w s ： i v a b s 兀t a c l e x p e r i m e n t1 ：t h er e s e a r c ho np a r t h e n o - a c t i v a t i o nm e t h o d st oi m p r o v et h er a t e o fb l a s t u l aw i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e o o c y t e sw e r ed e n u d e do fc u m u l u s w i t hh y a l u r o n i d a s ea n dt h e na c t i v a t e db yf i v ea c t i v a t o r sa n dt h e nw eo b s e r v ew h e t h e r p b 2d i s c h a r g e do rn o ta n dp r o c e s sk a r y o t y p ea n a l y s i st oi n v e s t i g a t et h ef o r m a t i o no f d i f f e r e n tp a n h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o nt y p et r e a t e dw i t hf i v ea c t i v a t o r sa n dt h e nc u l t u r ei n v i t r ot od e v e l o pt o b l a s t u l a st oi n v e s t i g a t eb l a s t o c y s td e v e l o p m e n tr a t eo ft h er e s u l t i n g p a n h e n o g e n e t i ce m b r y o s ，w h i c hi no r d e rt oc h o o s et h eb e s ta c t i v a t i o nm e t h o dt o p r o d u c eb l a s t u l aw i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e r e s u l t s ：( 1 ) m o u s eo o c y t e sc o u l d b ea c t i v a t e d b y d i f f e r e n tt r e a n t m e n t sa n df o u r t y p e s o f p a n h e n o g e n e t i c a c t i v a t i o n ( u n i f o r mh a p l o i d ，m o s a i ch a p l o i d ，h e t e r o z y g o u sd i p l o i dw i t ho n ep r o n u c l e u s a n dh e t e r o z y g o u sd i p l o i dw i t ht w op r o n u c l e i ) w e r ep r o d u c e d a l c o h o la n ds r c l 2a l o n e p r o d u c e dh i g h e rr a t eo fu n i f o r mh a p l o i d ，w h i l ea l c o h o lu n i t e dw i t h6 - d m a pa n ds r c l 2 u n i t e dw i t hc bp r o d u c e dh i g h e rr a t eo fd i p l o i d ( 2 ) t h ea c t i v a t i o nr a t eo o c y t e sw a s 6 3 3 a f t e rt r e a t m e n tw i t h1 0 a l c o h o la l o n ef o r1 0m i n u t e s a n dp r o d u c e dh i g h e rr a t e o fm o s a i ch a p l o i d ，b u tl o w e rr a t eo ft h ec l e a v a g er a t ea n db l a s t o c y s td e v e l o p m e n t r a t e ( 6 7 ) ( 3 ) 1 0 a l c o h o lt r e a t e d5m i n u t e sf i r s ta n dt h e n6 - d m a p f o r2 、4 、6 h ，t h e a c t i v a t i o nr a t ei m p r o v e da st i m e ( 3 7 8 ，3 9 7 ，7 5 0 ) t h ec l e a v a g er a t eo fo o c y t e s t r e a t e dw i t h1 0 a l c o h o la n d6 - d m a pf o r6h o u r sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a t f o r2a n d4h o u r s ，p r o d u c i n gh i g h e rr a t eo f2 p nh e t e r o z y g o u sd i p l o i da n dr a t eo f b l a s t o c y s td e v e l o p m e n tw h i c hw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n1 0 a l c o h o lt r e a t e d a l o n e ( 1 6 7 v s6 7 ，p 0 0 5 ) ( 4 ) 1 0 m ms r c l 2a l o n ea n du n i t e dw i t hc bc a nb o t h a c t i v a t eo o c y t e se f f i c i e n t l ya f t e rt r e a t m e n tf o r2a n d4h o u r s s r c l 2a c t i v a t i o na l o n e p r o d u c e dh i g h e rr a t eo fh a p l o i d ，w h i l eh i g h e rr a t eo fd i p l o i dw h e nu n i t e dw i t hc b ，a n d c l e a v a g e a n d b l a s t o c y s t d e v e l o p m e n t r a t e sw e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( 2 2 7 v s 8 1 ，p o 0 5 ) t h ec o n c l u s i o n ：1 0 m ms r c l 2a n d5 u g m l c bt r e a t e d4 hi st h e b e s tm e t h o dt oo b t a i nt h eh i g h e rr a t eo fh e t e r o z y g o u sd i p l o i db l a s t u l a e x p e r i m e n t2 ：t h ee f f e c to b s e r v a t i o no fs t e mc e l li s o l a t i o nw i t ht h ew h o l e e m b r y oa n di m m u n es e r u mm e t h o d s 1 1 l ea i mi st oe s t a b l i s hm o r er e l i a b l er e s e a r c hf i a t f o rs t e mc e l li s o l a t i o na c c o r d i n gt oe x i s t i n gr e s e a r c h ，w h i c hi no r d e rt oe s t a b l i s hb a s i s f o rp a n h e n o g e n e t i cs t e mc e l li s o l a t i o n i nt h i se x p e r i m e n t ，w ec o l l e c tb l a s t u l aa f t e r p r e g n a n c yf o r3 5d a y s ，t h e ni s o l a t ei c m w i t ht h ew h o l ee m b r y oa n di m m u n es e r u m m e t h o d st oi n o c u l a t eo nf e e dl a y e rt oi s o l a t ee s c sc o l o n y r e s u l t s ：( 1 ) w ec o l l e c t8 0 b l a s t u l a ，a f t e ri n o c u l a t i n go nf e e dl a y e rf o r4 8h o u r s ，7 2o fw h i c hh a t c ho u tt os t i c ko n f e e dl a y e r a n da f t e r9 6h o u r s ，i c ms t a r tt op r o l i f e r a t ea n ds e e ko u tt od i s p e r s et o2 3 v 两南人学硕十学佗论文 c e l l sa f t e r5d a y s a tl a s t ，w eo b t a i n e d2 0e s c sc o l o n i e s ( 2 ) w ec o l l e c t7 8b l a s t u l a a n dg e tr i do fz o n ap e l l u c i d a i c ma r eo b t a i n e dw i t hi m m u n es e r u mm e t h o da n dw e g o t2 2e s c sc o l o n i e s 0 ) o b t a i n e de sc l o n yh a st y p i c a le s c ss h a p ea n da k pc h e c k p o s i t i v e l y e x p e r i m e n t3 ：t h ep r i m a r yr e s e a r c ho ni s o l a t i o nr a t eo fp a r t h e n o g e n e t i cs t e m c e l lf r o mp a r t h e n o - b l a s t u l aw i t hu n i f o r mh a p l o i da n dh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e a c c o r d i n ft ot h ec o n c l u s i o no fe x p e r i m e n t1 ，w eo b t a i n e dh e t e r o z y g o u sd i p l o i da n d u n i f o r mh a p l o i dp a r t h e n o b l a s t u l a c o n s i d e r i n gi t sn o t e a s yf o rp a r t h e n o g e n e t i c b l a s t u l at oh a t c ho u tf r o mz o n ap e l l u c i d ab e c a u s eo fl o n gt i m eo p e r a t i o ni nv i t r o ，w e c h o o s ei m m u n es e r u mm e t h o dt oi s o l a t et h es t e mc e l l w ec o m p a r ei s o l a t i o nr a t eo f p a r t h e n o g e n e t i cs t e mc e l lf r o mt w ok i n d so fp a r t h e n o - b l a s t u l ai no r d e rt oc h o o s et h e t y p eo fp a r t h e n o b l a s t u l aw i t hh i g h e rs t e mc e l li s o l a t i o nr a t e r e s u l t s ：( 1 ) 3 1 6o o c y t e s w e r ea c t i v a t e dt oo b t a i n6 8p a r t h e n o - b l a s t u l aw i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e o n l y 2e sc l o n i e sw e r eo b t a i n e d b y i m m u n es e r u mm e t h o d ( i s o l a t i o nr a t e 3 ( 2 6 8 ) ) ( 2 ) 3 9 8o o c y t e sw e r ea c t i v a t e dt oo b t a i n6 8p a r t h e n o - b l a s t u l aw i t hu n i f o r m h a p l o i dk a r y o t y p e o n l y1e sc l o n yw a so b t a i n e db yi m m u n es e r u mm e t h o d ( i s o l a t i o n r a t e l 7 ( 1 5 8 ) ( 3 ) o b t a i n e de sc l o n yh a st y p i c a le s c ss h a p ea n da k pc h e c k p o s i t i v e l y t h ec o n c l u s i o n ：h e t e r o z y g o u sd i p l o i db l a s t u l ah a v eh i g h e re s cc o l o n y i s o l a t i o nr a t et h a nu n i f o r mh a p l o i db l a s t u l a c o n c l u s i o n s ：1 0 m ms r c l 2a n d5 u g m l c bt r e a t e d4 hi st h eb e s tm e t h o dt oo b t a i n t h eh i g h e rr a t eo fh e t e r o z y g o u sd i p l o i db l a s t u l aa n dh i g h e ri s o l a t i o nr a t eo fs t e mc e l l k e yw o r d s ：m o u s eo o c y t e ，p a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ，a c t i v a t e do o c y t ek a r y o t y p e ， p a r t h e n o - b l a s t u l ad e v e l o p m e n t v i 独创性声明 学位论文题目：提高昆白小鼠二倍体孤雌胚生成效率的激活方式 研究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了标注。 学位论文慨斗d 虫 签字日期左7 年石月o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：耳o j 谴 签字日期： 3 矽年占月p 日 导师签名： 天毛 文献综述 第一部分文献综述 第一章卯母细胞孤雌激活的研究进展 孤雌生殖( p a n h e n o g e n e s i s ) 是指在没有精子参与的情况下，卵细胞能发育为 一个胚胎的过程【3 】。诱导哺乳动物孤雌发育的研究始于2 0 世纪3 0 年代，p i n c u s 等采 用改变温度和渗透压的方法激活兔卵，获得卵裂，并报道移植至受体后产生家兔 后代，为后来的研究奠定了基础。随后在2 0 世纪4 0 - - - 5 0 年代，研究者们采用温度、 渗透压和麻醉剂激活小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、雪貂和绵羊的卵母细胞，进行孤 雌激活和孤雌胚发育的研究。2 0 世纪7 0 - - 8 0 年代许多学者开始研究提高孤雌激活率 和发育率方法的研究。2 0 世纪9 0 年代以来，随着哺乳动物细胞核移植研究的开展， 卵母细胞孤雌激活得以较为深入的研究，在实验动物、家畜及人卵母细胞激活方 面取得了较大进展。 研究哺乳动物卵母细胞的激活及之后的孤雌发育有利于探索卵母细胞的生理 反应，分析理化激活与精子激活的特征，检测孤雌胚与正常胚胎的蛋白质合成， 观察孤雌胚与受精胚的嵌合和发育能力，分析雄性和雌性基因组在个体发育中的 作用等，对阐明哺乳动物卵的激活受精和发育的机理，解答这些重要的生命现象 及技术的应用具有重要意义。 1 卯母细胞的激活机制 1 1 细胞内c a 2 + 多次持续波动引起成熟促进因子( m p f ) 的失活 自然条件下，多数哺乳动物排出的卵母细胞是次级卵母细胞，并停留在第二 次减数分裂中期，目前人们所接受的观点是卵母细胞中存在细胞静止因子 ( c y t o s t a t i c f a c t o r ，c s f ) ，即高活性的c s f 维持m p f ( 成熟促进因子) 处于高活性状 态，从而使卵母细胞保持在中期【4 1 ，在受精时，卵子的激活与成熟促进因子( m p f ) 。， 的失活是由一系列的细胞内c a 2 + 多次持续波动引起的。卵母细胞被精子激活后，内 源性c a “上升，激活蛋白激酶c ( p k c ) ，引起成熟促进因子( m p f ) 和细胞静止 因子水平下降，使减数分裂复始，并发生皮质反应。卵母细胞分裂中期的维持与 高水平的成熟促进因子( m p f ) 活性有关【5 1 。m p f 的活性是由对c a 2 + 非常敏感的c s f 来维持的，抑制卵内游离c a 2 + 浓度的升高则抑制了卵母细胞激活的一系列反应， c a 2 + 浓度的升高是卵母细胞激活的重要诱导信号，但并非诱导卵母细胞激活一定需 c a 2 + 浓度的脉冲升高【6 1 。当分裂中期卵母细胞受精或被人工激活时，立即激发了卵 内c a 2 + 浓度升高，升高的c a 2 + 一方面破坏了已存在的c s f ，从而使m p f 活性下降， 另一方面也可引起对c a 2 + 敏感的周期蛋白的降解，使m p f 水平下降或消失，引起卵 子活化，促使卵母细胞离开m 期，完成减数分裂进行胚胎发育。因此，c a 2 + 信号的 两南大学硕i ：学化论文 传播在卵母细胞激活过程中起着十分重要的作用。m 期卵母细胞的激活涉及的因素 较多，特别是不同动物上采用不同的人工激活方法引起卵激活的途径可能不同， 无论是受精引起卵母细胞激活还是人工激活，都引起卵母细胞发生一系列的反应， 这些反应是胚胎发育所必需的。在绝大多数动物上，这些反应的发生都具有时间 的先后顺序，并可依次分为早期和晚期反应。早期反应包括细胞内c a 2 + 浓度的顺时 性升高和皮质颗粒( c g ) 的释放，晚期反应包括减数分裂的恢复、细胞质内p h 值 的改变、母源m r n a 的补充、原核的形成、d n a 合成的起始和卵裂等。与卵母细 胞激活中信号传导和卵母细胞减数分裂恢复有关的大、小分子较多，较多研究认为 在卵母细胞激活中起第二信使作用的物质主要有3 种：c a 2 + ，1 ，4 ，5 三磷酸肌醇( i p 3 ) 和1 ，2 二酰基甘油( d a g ) 。细胞膜上的4 ，5 二磷酸脂酞肌醇( p i p 2 ) 被磷酸二 酯酶( p d e ) 水解产生i p 3 和d a g ，使细胞外信号转变为细胞内信号。这两个第二 信使分别调节两条不同通路，i p 3 动员细胞内源c a 2 + 释放到细胞质，提高了胞内的 c a z + 浓度；d a g 刺激蛋白激酶c ( p k c ) 活性，p k c 可以磷酸化底物蛋白，引起与 激活和减数分裂有关蛋白质和酶的磷酸化，导致卵母细胞激活和减数分裂恢复【7 1 。 1 2 蛋白质合成抑制剂，通过抑制蛋白质的合成从而使m p f 处于低水 平 放线菌酮( c h x ) 是一种蛋白质合成抑制剂，通过作用8 0 s 的核糖体抑制肽链 的转移，从而抑制蛋白质的合成。己经证明，c h x 可以使小鼠和牛卵母细胞发生 孤雌激活【8 9 1 。c h x 与其他因素协同促进卵母细胞活化的作用机制，一般认为，乙 醇、电脉冲和氯化锶的刺激已经导致卵母细胞的活化，而随后的c h x 作用又进一 步抑制了卵内新的相关蛋白质女n c y c l i n b 、c s f 的合成，使之不能产生新的c s f 和 m p f ，使m p f 一直处于低水平，由此又进一步促进了卵母细胞的活化。单独的c h x 不能使猪卵母细胞活化，说明猪卵母细胞对c h x 不敏感，只有与其他刺激因素联 合使用时，才能起到协同促进的作用。这也说明，c h x 引起的卵母细胞活化不是 通过c a 2 + 波动起作用的，而是通过抑制有关蛋白质新的合成起作用的。 1 3 蛋白磷酸化抑制剂，通过抑制c y c l i n b 的磷酸化使m p f 活性下降 6 - - - 甲氨基嘌呤( 6 d i m e t h y l a m i n o p u r i n e ，6 - d m a p ) 是一种蛋白磷酸化抑制剂。 卵母细胞成熟和受精均涉及到多种蛋白质磷酸化状态的改变。6 - d m a p 对卵母细胞 的激活作用主要是维持p 3 4 c d c 2 的磷酸化和抑制c v c l i n b 的磷酸化使m p f 活性下降， 同时还可以抑制纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化进一步抑制极体的排出。但 6 - d m a p 单独使用对卵母细胞的激活作用较弱，一般要与适度的可以引起c a 2 + 波动 的其他激活因子协同作用才能使卵母细胞达到充分激活。 2 文献综述 2 卯母细胞激活的方法 卵母细胞激活的方法可归纳为物理刺激、化学刺激和物化联合刺激3 类。物理 刺激包括机械、温度以及电激活；化学刺激包括酶、渗透压、离子载体以及蛋白磷 酸化抑制剂等；物化联合刺激包括电激活联合a 2 3 1 8 7 、乙醇( e h ) 联合放射菌酮 ( c h x ) 、离子酶素( i o n ) 联合6 d m a p 等。 2 1 乙醇对卯母细胞的激活 乙醇是发现较早的一种化学激活剂，对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞 膜上4 ，5 二磷酸磷酯酰肌醇产生1 ，4 ，5 三磷酸肌醇，从而诱发细胞内源钙释放到细 胞质，提高了胞内的钙离子浓度。谭景和掣加】发现，哺乳动物m i i 期卵母细胞在含 有7 - - 8 乙醇的培养液中，处理5 7m i n 可激活卵母细胞使其形成原核，甚至可 以发育到囊胚。 2 2 氯化锶对卵母细胞的激活 用氯化锶( s r c l 2 ) 处理卵母细胞，s p 可以进入钙库置换c a “，释放, w , c a 2 + 使 胞质c a 2 + 升高，从而引发一系列依赖c a ：+ 的生物反应，对卵起激活作用。李光鹏等 【9 l ，用s r c l 2 对小鼠卵母细胞进行化学激活，激活率为8 2 o ，杨红等【1 1 1 用1 0 m ms r c l 2 处理卵母细胞9 h 获得9 1 o 得激活率，而囊胚的发育率高达5 3 2 2 。 2 3 钙离子载体a 2 3 1 8 7 对卯母细胞的激活 钙离子载体a 2 3 1 8 7 可以有效的促进小鼠激活，如果预先用钙离子螯合剂处理， 就不能引起卵母细胞激活，说明卵母细胞的激活是由钙离子介导的。研究还表明 直接注射c a 2 + 或应用钙离子载体a 2 3 1 8 7 刺激均能诱发哺乳动物卵母细胞孤雌激活 和原核形成。 2 46 d m a p 和c h x 对卯母细胞的激活 6 - d m a p 是蛋白质磷酸化抑制剂，它能阻止蛋白质磷酸化，抑制m p f 和c s f 的活性，同时抑制第二极体排放，保证孤雌激活偶数目细胞的染色体为二倍体。 c h x 是蛋白质合成抑制剂，它主要抑制卵母细胞维持在m i i 期所需要的m p f 和c s f 的合成，进而使卵母细胞内m p f 活性迅速下降，卵母细胞脱离m i i 期，完成第二次 减数分裂导致卵母细胞激活，但c h x 不抑制蛋白质磷酸化，故不影响构成纺锤体 的微管蛋白的活性，也就不影响第二极体的排出。研究表明，卵母细胞用c h x 处 理后才观察到原核的形成，且c h x 只有与细胞松弛素b ( c b ) 协同作用才能抑制 第二极体的排放。就孤雌激活胚胎的囊胚发育率而言，6 - d m a p 的激活效果比c h x 要好，且一般与钙离子载体联合使用效果较佳。徐清华等用6 d m a p 激活人卵母细 3 两南人学硕f j 学位论文 胞时，激活率只有1 1 5 ，当与钙离子载体联合使用时，激活率明显升高至5 8 7 1 2 1 。 3 卯母细胞孤雌激活存在的问题 目前多数情况下虽然小鼠孤雌生殖可获得较高的激活率，但孤雌囊胚形成数 少，囊胚通常形态很差，很多无继续发育的能力。卵母细胞孤雌激活条件、激活 后培养及其继续发育潜能的改善均是目前亟待解决的问题。虽然多数学者认为孤 雌生物生长发育困难的最主要原因是基因的印迹异常，但其确切机制尚未阐明， 仍有待于进一步研究。尽管已有孤雌生殖的胚胎干细胞建系的报道，但除发育方 向无法控制和增生能力不稳定外，因起源与卵巢“畸胎瘤”相似，其试验和治疗应用 前景的合理性在伦理上仍有争议。但是孤雌生殖技术在受精过程的基础研究、人 类自体胚胎干细胞系的建立和应用等方面有广阔发展前景，有待进一步研究探讨。 4 卵母细胞孤雌激活的意义 孤雌生殖卵母细胞激活是研究哺乳动物受精机制及发育机理的有效方法。哺 乳动物卵母细胞的人工激活是细胞核移植和微注射受精技术的重要步骤，同时也 是研究卵激活启动以及受精和发育机理的重要手段。人们期待着立足于坚实的基 础理论研究，不断地提高诱导孤雌发育的效率，随着这些研究的不断深入和拓展， 人们能更广泛地利用孤雌卵母细