（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥类动蛋白atkp1的亚细胞定位研究.pdf

：型譬耋塞圭耋耋窒鎏圣，。，。，。，。 摘要 动蛋白( k i n e s i n ) 是由v a l e 等于1 9 8 5 年在研究枪乌贼巨大神经轴突中囊泡的快速定向运输时 首先发现井命名的一类微管马达蚩白。动蛋白利崩其水解a t p 所产生的能量沿着微管进行定向运 动，同时完成其在细胞内众多的生物学过程，包括囊泡和细胞器的运输、有丝分裂和减数分裂的 进行、染色体的分离以及微管动力学的调控等。 最近，本实验室王海庆博士从拟南芥中克隆到一个新的类动蛋白基因a t k p l ( g e n b a n k 序列 登录号为a f 3 9 8 1 4 9 ) ，并对其马达区的基本生化特性进行了研究，同时以a t k p i 的特异多肽 ( 8 8 6 1 0 8 6 a a ) 为抗原制各了抗血清。 为了对a t k p l 进行弧细胞定位本研究首先通过离子交换层析和亲和层析对a t k p l 抗体进 行了纯化，并鉴定了该抗体的特异性。分别用a t k p l 预血清、抗血清以及亲和纯化的a t k p l 抗 体对拟南芥根的蛋白抽提液进行了免疫印迹分析。结果表明，亲和纯化的a t k p l 抗体标记出预 血清未能识别的、分子量约为1 2 5 k d 的1 条印迹。为确证此蛋白是a t k p l ，我们进一步用h i s - t a g 抗体、抗动物动蛋白的单克隆抗体和亲和纯化的a t k p l 抗体分别对含有原核表达的a t k p l 抗原 和a t k p l 全长多肽的菌裂解液进行标记。结果证明，亲和纯化的a t k p l 抗体所识划的蛋向为类 动蛋白a t k p l 。 利用免疫印迹和免疫荧光方法对a t k p l 在拟南芥中的组织特异性分布进行了研究。进行免 疫印迹时，我们以1 3 - a c t i n 的含量为参照，确定电泳时各组织蛋白抽提液的上样量一致。免疫印 迹结果表明，a t k p l 在花器官中分布最多然后依次为茎、叶、根，而在果英中没有发现a t k p l 。 免疫荧光标记结果表明，类动蛋白a t k p l 在拟南芥主根分生区、侧根以及n t 中均有分布。 我们用a t k p l 抗体和微管抗体对拟南芥根尖单细胞进行了免疫荧光双标记。结果发现，在 细胞分裂间期，a t k p l 主要分布在细胞质中。从细胞有丝分裂期的早前期、经纺锤体时期，直 至成膜体时期，a t k p l 并未与通过微管蛋白显示的有丝分裂装置共定位，而是以颗粒状形式分布 在细胞质中。据此我们推测类动蛋白a t k p l 可能结合于细胞器或囊泡。 为确定a t k p l 存在于哪种细胞器上，我们利用蔗糖密度梯度超离心从拟南芥叶片中分离出 线粒体、微体、细胞质以及叶绿体，并利用a t k p l 抗体对其进行了免疫印迹分析。结果表明， a t k p l 特异定位于线粒体，而在其它亚细胞组分中没有发现，同时高盐溶液无法将其从线粒体上 释放下来，说明类动蛋白a t k p l 紧密结合于线粒体。 总之，本研究结果表明：与目前已发现的大多数植物类动蛋白不同，a t k p l 不参与细胞有 丝分裂，而是紧密地结合于拟南芥线粒体，其功能可能与线粒体的活动有关。 关键词：类动蛋白a t k p l ，亲和纯化a t k p l 抗体，分布与功能，线粒体 中国农业大学博士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h em i c r o t u b u l em o t o rp r o t e i nk i n e s i nw a si d e n t i f i e db yv a l ei n1 9 8 5a st h em o t i l ef o r c e u n d e r l y i n gm o v e m e n to fp a r t i c l e sa l o n gt h em i c r o t u b u l e so ft h eg i a n ta x o no ft h es q u i d k i n e s i n w a ss h o w nt ob ec a p a b l eo fb i n d i n gt om i c r o t u b u l e sa n d ，i nt h ep r e s e n c eo fa t p o fm o v i n g a l o n gm i c r o t u b u l e s 。w h i c he n a b l et h em o t o r st op e r f o r me s s e n t i a ir o l e sf nv e s i c l ea n do r g a n e l l e t r a n s p o r t ，s p i n d l ef u n o t i o na n dc h r o m o s o m em o t i l i t y a n dr e g u l a t i o no fm i c r o t u b u l ed y n a m i c s r e c e n t l y ，an e wk i n e s i ng e n ea t k p l ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o a f 3 9 8 1 4 9 ) ，w a sc l o n e d f r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n ab yh a i q i n gw a n gi no u rl a bs e q u e n c ea n a l y s i so fa t k p lc d n a r e v e a l e da no p e nr e a d i n gf r a m eo f3 2 6 4 b p e n c o d i n gap r o t e i no f1 0 8 7a m i n oa c i d s t h eb a s i c b i o c h e m i c a ic h a r a c t e r i s t i c so fa t k p lm o t o rd o m a i n ( 3 0 0 8 0 2 a a ) w e r ea n a l y z e d ，a n di t s a n t i - s e r u ma g a i n s ta t k p ls p e c i f i cp o l y p e t i d e s ( 8 8 6 1 0 8 7 a a ) w a sp r e p a r e d i nt h i sp a p e r ，w ep u r i f i e dt h ea t k p la n t i b o d yu s i n gi o n e x c h a g ec h r o m a t o g r a p hc o l u m n ( d e a e c e l l u l a s e 5 2 ) a n da f f i n i t yp u r i f i c a t i o ns l u r r y ( n i - n t a ) a n da n a l y z e di t ss p e c i f i c i t y t h e p r o t e i n e x t r a c to fw h o l ea r a b i d o p s i ss h o o t sw a sp r e p a r e d s e p e r a t e d b ys d s p a g ea n d i m m u n o b l o t t e dw i t hp r e s e r u m ，a n t i s e r u ma n da f f i n i l yp u r i f i e da n t i - a t k p la n t i b o d y r e s p e c t i v e l y o n l yo n ei m m u n o r e a c t i v es i g n a lw i t ha nm o f1 2 5 k dw a so b t a i n e dw i t hb o t ha n t i s e r u ma n d a f f i n i t y - p u r i f i e da n t i - a t k p l w h i c hw a sn o tr e c o g n i z e db yp r e s e r u m t ov e r i f yt h a tt h e p o l y p e p t i d er e c o g n i z e db yt h ea n t i b o d yw a sa t k p l w ep r e p a r e dt h ee c o i ll y a t e sc o n t a i n i n g t h eh i s t i d i n e t a g g e da t k p ls p e c i f i cp o l y p e p t i d e ( 8 8 6 10 8 7 a a ) o re n t i r ea t k p l w h e ns u b j e c t e d t o a f f i n i t yp u r i f i e da n t i b o d y ，m o n o c l o n a la n t i - h i s t i d i n et a ga n t i b o d ya n dm o n o c l o n a l a n t i a n i m a l - k i n e s i na n t i b o d y r e s p e c t i v e l y ，b o t hl y a t e sp r o d u c e das i n g l ei m m u n o r e a c t i v eb a n d w i t ha nm o f2 8 k do r1 2 5 k d ，i n d i c a t i n gt h a tt h e1 2 5k bp o l y p e p t i d er e c o g n i z e db ya f f i n 计y - p u r i f i e da n t i b o d yw a so u rt a r g e tp r o t e i n ，a t k p l t h ee x p r e s s i o np a t t e mo fa t k p lp r o t e i ni no r g a n so fa r a b i d o p s i sw a se x a m i n e db yb o t h i m m u n o b l o ta n di m m u n o f l u o r e s c e n c ea n a l y s i sw i t ha f f l n i t y - p u r i f i e da n t i - a t k p la n t i b o d y f o r w e s t e mb l o t t h er e l a t i v ea m o u n to ft o t a lp r o t e i nf r o me a c ho r g a nw a sd e t e r m i n e du s i n gt h e r e i a t i v ea m o u n to ft h eb a c t i na sar e f e r e n c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta t k p lw a st h eh i g h e s t e n r i c h e di nf l o w e r a n dt h e ni ns t e m s 1 e a v e sa n dr o o t si nt u r n i m m u n o f i u o r e s c e n c es i g n a l s c o u l db eo b t a i n e di nr o o tm e r i s t e m a t i cc o n e s ，l a t e r a lr o o t sa n dl e a v e s u s i n gt h ea f f i n i t y - p u r i f i e da n t i a t k p la n t i b o d ya n da n t i - t u b l i na n t i b o d y w ec o l o c a l i z e d a t k p la n dm i c r o t u b u l e s ( m t s ) i ni n t a c ta r a b i d o p s i sr o o tt i pc e l l sa td i f f e r e n ts t a g e so fc e l l d i v i s i o n i ni n t e r p h a s ec e l l s ，a t k p tw a sp r e s e n tt h r o u g h o u tt h ec y t o p l a s m i np r e p r o p h a s ec e l l s a t k p ls t i o c a l i z e dt op a r t i c l e l i k es t r u c t u r e s i nm e t a p h a s ec e i l s n oa t k p lw a sd e t e c t e do n s p i n d l em i c r o t u b u l e s w h e nm i c r o t u b u l e sc o n c e n t r a t e dt of o r mp h r a a n o p l a s t a t k p ls t k e p t i i 中国农业大学博士学位论文 a b s t r a c t s t a y i n gt h r o u g h o u tt h ec y t o p l a s m t h er e s u l t ss u g g e s t e d t h a ta t k p la s s o c i a t e dw i t ho r g a n e l l e s a n d o rv e s i c l e si na r a b i d o p s i sc e l l s i no r d e rt oa c q u i r et h ed e t a ij i o c a l i z a t i o no fa t k p l w es e p e r a t e ds u b c e l l u l a rf r a c t i o n sb y s u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n tu l t r a c e n t r i f u g a t i o nw eo b t a i n e dt h em i t o c h o n d r i a ，c y t o s o l ，m i c r o s o m e a n dc h l o r o p l a s tf r a c u o n sf r o ma r a b i d o p s i sl e a v e sa n dp r o b e dt h e mi ni m m u n o b l o w n gw i t h a n t i - a t k p la n t i b o d y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a to n l yt h em i t o c h o n d r i af r a c t i o n sc o n t a i n e da t k p l w h i c hc o u l dn o tb er e l e a s e db ye x p o s u r et oh i g h s a l ts o l u t i o n a sac o n c l u s i o n ，t h i ss t u d yd e m o n s t r a t e dt h a tt h ek i n e s i n l i k ep r o t e i n a t k p l ，d i f f e r e n u y f r o mm o s to fo t h e rh i g h e rp l a n tk i n e s i n sa n dk i n e s i n - l i k ep r o t e i n s w a sn o ti n v o l v e di n c e l l d i v i s i o n ，b u tt i g h t l yb o u n dt om i t o c h o n d r i ai na r a b i d o p s i sc e l l s a n dm i g h tb ei n v o l v e di nt h e a c i t i v i t yo fm i t o c h o n d d a k e yw o r d s ：a t k p i a f f i n i t y - p u r i f i e da n t i - a t k p la n t i b o d y d i s t r i b u t i o na n df u n c t i o n ，m i t o c h o n d n a 1 i i 中国农业大学博士学位论文 缩略词 英文缩写 英文名称 a a a m p a p a t p b c l p b s a c d n a d a p l o t t e g t a f i t c g f p h r h r p i g g i p t g k a n k b k d l b m l n m s n b t n i c o l u m n o d p b s p i p e s p m s f s d s s d s - p a g e s e c t r i s 缩略词 a m i n oa c i dr e s i d u e a m p i c i l l i n a i k a l i n ep h o s p h a t a s e a d e n o s i n 5 - t r i p h o s p h a t e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - p h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd n a 4 ，6 - d i a m i d i n o - 2 p h e n y l i n d o l ed i h y d r o c h l o d d e d i t h i o t h r e i t o i e t h y l e n eg l y c o l - b i s ( p ，a m i n o e t h y le s t e r ) - n n ，n ，n 1 i t e t r a c e t i ca c i d f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n h o u r h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i m m u n o g l o b u l i ng i s o p r o p y l t h i o - 1 3 ，d - g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y c i n k i l ob a s ep a i r k i l o d a l t o n l u r i a - b e r t a n im e d i a m i n u t e m u r a s h i g e - s k o o gm e d i a n i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e n i c h e l a t i n gs e p h a m s ef a s tf l o wr e s i n s 0 嘶c a id e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n p i p e r a z i n e - n n b i s2 e t h a n e s u l f o n i ca c i d p h e n y l - m e t h y l - s u l f o n y l f l u o d d e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s e c o n d t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e v 中文名称 氧基酸残基 氮苄青霉素 碱性磷酸酶 腺苷三磷酸 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚磷酸 牛血清白蛋向 互补d n a 联脒基苯吲哚酸盐 二硫苏糖醇 己二醇双( b 一氦乙基) 四乙酸 异硫氰酸荧光素 绿色荧光蛋白 小时 辣根过氧化物酶 免疫球蛋白g 异丙基b 一硫代半乳糖苷 卡那霉素 千碱基对 千道尔顿 l b 培养基 分钟 m s 培养基 氯化硝基四氮唑蓝 镍亲和层析介质 光密度 磷酸缓冲液 哌嗪n n 一双( 2 - 乙磺酸) 苯甲基磺酰氟 十二烷基磺酸钠 s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 秒 三羟甲基氨基甲烷 独创性，声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：2 0 0 4 年8 月1 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：倪成志 时间：2 0 0 4 年8 月lr 亿3 a 壤- 、 时间；2 0 0 4 年8 月1 日 中国农业大学博士学位论文 l 文献综述 1 文献综述一动蛋白研究进展 动蛋白是真核生物细胞内依赖于微管的一类马达蛋白。在微管的协调作用下，动蛋白参与了 细胞内众多的生物学过程，包括细胞形态建构、细胞内各种有膜细胞器的运输、有丝分裂和减数 分裂的进行、染色体的分离、m r n a 的定位以及信号转导等。在上述细胞内的生物学过程中，动 蛋白利用其水解a t p 所产生的能量沿着微管进行定向运动，同时将其结合的生物大分子或细胞 器、囊泡等( 如质膜、染色体、蛋白质复合物以及其它骨架纤维等) 运送到细胞内的特定部位( v a l e e t a i ，1 9 9 7 ) 。动蛋白最早是在研究动物神经细胞内囊泡的快速定向运输时发现的一类微管马达蚩 白( b r a d y ，1 9 8 5 ；v a l ee ta 1 。1 9 8 5 a ) ，随后人们相继从低等真核生物至高等动植物中都发现了 此类蛋白，表明动蛋白在真核生物中不仅普遍存在、构成了一个庞大的动蛋白超家族而且参与 了众多的生物学过程( k i me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 1 动蛋白的发现 动蛋白作为一类新的微管马达蛋白是由v a l e 等在1 9 8 5 年首先发现并命名( v a l ee ta 1 ， 1 9 8 5 a ) 。最初，在研究枪乌贼巨大神经轴突中轴突质( a x o p l a s m ) 运动时，人们发现轴突质可沿 着微管进行双向运动( v a l ee ta 1 1 9 8 5 b ；a i i l e ne ta 1 ，1 9 8 5 ，s c h n a p pe ta l ，1 9 8 5 ) ，v a l e ( 1 9 8 5 b ) 等推测这种运动可能是由一种与微管有关的蛋白因子来完成。通过体外运动系统进一 步研究发现，当a m p - p n p 存在时，微管能够与枪乌贼轴突浆上清液中的一种蛋白形成稳定的连 接，而当加入a t p 或k c i 后，该蛋白质又很快与微管分离。利用这一特性，并结合凝胶层析和 疏水层析等技术，v a l e 等在鱿鱼轴突胞浆和视神经叶中部分纯化了该蛋白。通过凝胶层析测定该 蛋白的分子量为6 0 0 k d ，由1 1 0 1 2 0 k d 和6 0 7 0 k d 的多肽组成。同时，在牛脑中也鉴定和纯化 出分子量大小和生化性质与之相类似的蛋白质。该蛋白质具有a t p a s e 活性，且其活性不受n e m ( n 乙基马来酰皿胺一力蛋白抑制剂) 影响。这类蛋白无论从分子量、酶活特性以及抑制剂的作 用来看均不同于先前发现的肌球蛋白( m y o s i n ) 和轴突力蛋白( d y n e i n ) ( g i b b o n se t a l ，1 9 6 5 ) ， 属于一类新的依赖于微管的细胞质马达蛋白分子。v a l e 将其命名为“k i n e s i n ”，其取义来自_ 丁希腊 文“k i n e i n ”，为运动的意思，中文译为“动蛋白”( v a l ee ta 1 ，1 9 8 5 a ) 。从此，人们相继从牛脑组 织( v a l e e t a l 1 9 8 5 a ；k u z n e t s o v e t a l ，1 9 8 6 ) 、未受精的海胆卵( s c h o l e y e t a l 1 9 8 5 ；p o r t e r e t a i 1 9 8 7 ；c o h n e ta 1 ，1 9 8 7 ) 、果蝇( s a x t o ne t a i ，1 9 8 8 ；y a n g e t a l ，1 9 8 8 ) 、培养哺乳动 物单细胞( n e i g h b o r se ta 1 ，1 9 8 8 ) 、烟草花粉管( m o s c a t e l l ie ta 1 ，1 9 8 8 ；t i e z z ie ta 1 ，1 9 9 2 ) 、 榛木花粉高尔基体囊泡( l i ue ta 1 。1 9 9 4 ) 和拟南芥 m i t s u ie ta 1 。1 9 9 3 ；1 9 9 4 ) 等物种中纯化或 鉴定出动蛋白的存在，同时对其结构特征和生物学功能进行了越来越深入的研究。 1 2 动蛋白的结构 1 2 1 传统动蛋白( o o n v e n t i o n a ik i n e s i n ) 的结构特点 传统动蛋白分子由两条重链和两条轻链组成，呈现异四聚体结构。其分子量因动蛋白来源的 不同而存在差异：重链分子量多为11 0 - 1 3 0 k d ，轻链多为5 5 7 5 k d ( b l o o me ta 1 ，1 9 8 8 ； k u z n e t s o ve ta 1 1 9 8 8 ) 。在电子显微镜下，传统动蛋白呈现为一长形分子结构，全长8 0 n m ( h i r o k w ae t a f 1 9 8 9 ) 。传统动蛋白一端为双球形的头部，另一端为扇形结构的尾部，中间通 过一杆状结构区相连( a m o s 1 9 8 7 ；v a l e 1 9 9 0 ) ( 图1 ) 。其球形头部由传统动蛋白重链保守 l 中唇农业大学博士学位论文 l 文献综述 性较强的约3 4 0 个的氨基酸组成，含有a t p 和微管结合位点，是负责机械化学运动的结构区： 扇形结构的尾部跃约2 0 n m ，由保守性相对较低的约9 0 个氨基酸组成，通常因富含碱性氨基酸 而带有正电荷，可与带负电荷的细胞器质膜相结台( s c h o l e y e t a l ，1 9 8 9 ；y a n ge t a l 1 9 9 0 ) ， 其功能是负责与轻链或动蛋白所运输的“货物”( c a r g o ) 结合。通过对果蝇中编码动蛋白轻链的基 因分析发现，不同的轻链异型体是由同一个基冈的转录产物经可变剪切产生，轻链可能通过双螺 旋结构与重链的尾区相结合( j a n e te ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 图1 传统动蛋白结构示意图( v a l e ，1 9 9 0 ) f i g ，1s t r u c t u r eo fc o n v e n t i o n a lk i n e s i n ( v a l e ，1 9 9 0 ) 1 2 2 动蛋白结构域( d o m a in ) 的划分及各自的作用 最初对动蛋白结构域的划分是基于保守序列的有关信息，后来有关动蛋白晶体结构的报道使 人们对动蛋白分子结构和功能区( f u n c t i o n a l d o m a i n ) 有更为清楚的了解( k o z i e l s k i e t a l ，1 9 9 7 ； s a b l i n e t a l ，1 9 9 8 ) 。目前认为，动蛋自由四个结构域组成：催化中心( c a t a l y t i cc o r e ) 、颈区 ( n e c k ) 、杆区( s t a l k ) 和尾区( t a i l ) 。 动蛋白的催化中心在晶体结构学上被看作是一个跃约9 n m 、紧凑的球形结构( k u l le ta 1 ， 1 9 9 6 ；s a b l i ne ta l ，。1 9 9 8 ) 。拥有约3 4 0 氨基酸组成的保守序列，具有a t p 和微管结合位点， 负责与微管结合且具有a t p a s e 活性。在动蛋白全部高级结构中，催化中心被看作是球形头部区 域内最保守的部分，该区域以b 折叠( n 一末端) 起始，以q 螺旋( c - 末端) 结束( v a l e e t a l 2 0 0 0 ； s a b l i ne ta l ，1 9 9 8 ) 。晶体结构学的研究证实。动蛋白的催化中心与基于微丝的马达蛋白肌球 蛋白( m y o s i n ) 的催化结构域具有结构上的相似性( k u l l e t a i 1 9 9 6 ) ：动蛋白的a t p 结合位点 与肌球蛋白的a t p 结合位点以及g 蛋白( gp r o t e i n ) 的核苷酸结合位点都具有结构上的相似性 ( s a b r i ne ta f 。，1 9 9 6 ；v a l ee ta l 。，1 9 9 6 ；k u he ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 紧临催化结构域的是一段伸展的氨基酸残基，称为颈区。与催化结构域相比，颈区序列的保 守性不及前者，但在某一动蛋白皿家族内则具有保守性( v a l ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在k i n c 型( 负向 动蛋白) 动蛋白中，其颈区靠近n 端有1 3 个氨基酸残基的保守序列：在k i n n 型( 传统正向动 蛋白) 动蛋白中，其颈区由两部分组成( v a l ee ta 1 ，1 9 9 7 ；v a l ee ta 1 2 0 0 0 ；k o z i e l s k ie ta i ， 1 9 9 7 ) ：一部分被称作颈- 催化结构域连接区( n e c kl i n k e r ) ，紧靠催化结构域。由1 0 个氨基酸 残基组成，在全部的k i n n 正向马达中高度保守：另一部分被称作颈螺旋的螺旋，由2 0 - 3 0 个氨 基酸残基组成，在k i n n 家族的不同家族之间具有选择性保守性。在k i n l 型( 中间型动蛋白) 动蛋白中，颈区位于催化中心靠近n 一末端一侧，由4 5 个特异的保守氨基酸残基组成( v a l e e t a l ， 1 9 9 7 ) 。晟近的晶体结构学研究证明。动蛋白的颈区能形成非常特异而又精细的三维结构。颈区 2 中国农业大学博士学位论文 1 文献综述 可与催化中心的一部分形成特异而义紧密的结合，这种结合又引起催化中心其它部分的激活从而 发挥其特定的功能这也是不同类型动蛋白具有不同特性的原因( k o z i e l s k i e t a l 1 9 9 7 ；s a b l i n e t a 1 1 9 9 8 ) 。对于k i n n 型和k i n c 型动蛋白而言，颁区对动蛋白产生运动以及运动的方向起着关 键作用( c a s ee ta 1 1 9 9 7 ；e n d o we ta l ，1 9 9 9 ) ，从这个意义上说，马达区( m o t o rd o m a i n ) 通常指相互协同作用( 1 q 功能单位，应包括催化中心和颈区两部分( v a l ee ta 1 2 0 0 0 ) 。最近人们 用嵌合体( c h i m e r a s ) 来研究颈区对动蛋白运动方向的影响，目前已取得较大进展。研究发现， 当嵌合体由n c d 蛋白的催化中心和传统动蛋白的颈区及杆区组成时，出现了令人惊奇的现象：尽 管该杂台蛋白的催化中心属于负端马达n c d 蛋白，但该蛋白却向微管正端移动( h e n n i n g s e n e ta 1 1 9 9 7 ；c a s ee ta 1 1 9 9 7 ) ；当嵌合体由n c d 蛋白的颈医及杆瓯和传统动蛋白的催化中心组成时， 尽管其拥有正向马达的头部，该杂合蛋白则向微管的负端移动( e n d o w e t a l ，1 9 9 8 ) 。由此可见， 动蛋白的运动方向性由其颈区决定。动蛋白沿微管运动方向除与自身结构有关外还受到微管解 聚一聚合状态的调控( l o m b i l l oe ta 1 1 9 9 5 ) 。 除了马达区，动蛋白还有一个a 螺旋的杆区和一个扇形的尾区，杆区的功能是负责同二聚体 或异二聚体的形成；尾部结构域( 9 1 1 9 7 5 a a ) 变化较大，可附着轻链，负责与膜的特异性结 合，是“货物”的装载部位。二者还有可能参与马达区的调节，但对于动蛋白的运动不是必需的 ( s h e e t z1 9 9 9 ；o r o z c oe ta 1 1 9 9 9 ；s t o c ke ta 1 1 9 9 9 ) 。 1 2 3 动蛋白结构的多样性 随着对动蛋白结构认识的不断深入，尤其是分子生物学的飞速发展，使得动蛋白的研究从早 期的生化水平进入到了分子水平。现在已从众多的真核生物中克隆到了大量的编码动蛋白的基因 序列，从而发现动蛋白是由多个亚家族组成的马达蛋白超家族。通过对由编码动蛋白的c d n a 序 列推导出的氨基酸序列的分析发现动蛋白马达区均禽有一段保守的、约3 0 0 3 4 0 个氨基酸残基 组成的催化活性区( h i r o k a w a ，1 9 9 8 ，v a l ee ta 1 ，1 9 9 7 ) ，除此之外，动蛋白的颈区和尾区的氨 基酸序列呈现出高度的变异性。马达区在动蛋白重链上的位置存在n - 末端、c 末端和中间之分， 同时在动蛋白的高级结构上也存在多样性，不仪存在如同传统动蛋白一样的异四聚体结构，还存 在同型四聚体、异三聚体以及二聚体和异三聚体形式的动蛋白。动蛋白马达区的保守性和其它区 域结构上的多样性赋予了动蛋白作为一种微管马达蛋白在细胞内功能上的多样性( v a l ee ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。 1 3 动蛋白生化特性 13 1 动蛋白依赖于核苷酸的微管结合特性 在a t p 非水解类似物a m p p n p 或无机三磷酸p p p i 存在时，动蛋白可以稳定结合到微管上； 肖加入m g a t p 后，动蛋白又可从微管上解离下来( v a l e e t a l ，1 9 8 5 a ；k u z e n t s o v e t a l ，1 9 8 6 ) 。 动蛋白的这种依赖于核苷酸的微管结合特性被广泛应用于通过微管。垂钓。的方法分离和纯化动蛋 自( c o h n 1 9 8 9 ) 。但同时存在一个特例；在a m p - p n p 存在时，从盘基网病菌( d i c t y o s t e l u m d i s c o i d e u m ) 中分离到的动蛋白却与微管的结合能力降低( m c c a f f r e y ，1 9 8 9 ) 。 动蛋白依赖于核苷酸的微管结合特性受到其它物质的调节。通过对枪乌贼和海胆卵细胞动蛋 白的研究，人们发现钒酸盐能显著地提高动蛋白与微管的结合能力( c o h n e t a l ， l 9 8 7 ；s c h o l e y e t 1 中国农业大学博士学位论文 i 殳献综述 a 1 ，1 9 8 9 ；v a l ee ta 1 ，1 9 8 6 a ) ：同时，另有一些物质如m g ”+ a t p 、m g ”+ a d p 和m g “+ a t p 则能促进动蛋白与微管的解离( c o h ne ta 1 1 9 8 7 ) 。 1 32 动蛋白具有被微管激活的a t p a s e 活性 a t p a s e 活性是动蛋白作为马达蛋白晟重要的特性之一，其催化a t p 水解产生的能量是动蛋 白进行基于微管运动的能量来源。动蛋白具有a t p a s e 活性的迁据首先来自于对鸡脑中含有动蛋 白成分的蛋白质粗提物的研究( b r a d y 1 9 8 5 ) 。后来研究发现，从牛脑( k u z e n t s o ve ta l ，1 9 8 6 ) 和 海胆f p ( c o h ne ta 1 1 9 8 7 ) 中纯化的动蛋白其a t p a s e 活性可被微管强烈激活。 动蛋白的a t p a s e 活性受到其它物质调控。在c a ”存在时动蛋白的a t p a s e 活性也能堰 烈地被激活，但此时其活性不再被微管激活( k u z e n t s o ve ta 1 ，1 9 8 6 ) ：动蛋白的a t p a s e 活性 也可被a m p - p n p 、e d t a 、无镁离子的a t p 以及钒酸盐( v i ) 等物质所抑制( c o h n ，1 9 9 0 ) 。 另外，研究发现，动蛋白头部4 5 k d 片段( 胰蛋白酶酶解产物) 其a t p a s e 活性比全长分子的活 性增加了4 5 倍，该片段与微管亲台性也大大提高，这表明动蛋白尾部区对其头部的a t p a s e 活性起负调解控作用( k u z n e t s o ve ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 动蛋白在水解a t p 时，a d p 从动蛋白上的解离和释放是其限速步骤( h a c k n e y ，1 9 8 8 ) 。 当加入微管后，a d p 从动蛋白上解离常数极大增加( c o h ne ta 1 ，1 9 8 9 ) ，动蛋白这种被微管激 活a t p a s e 机制与其它细胞质马达肌球蛋白和力蛋白不同：在肌球蛋白和力蛋白催化a t p 水解 过程中的限速步骤是水解产物a d p + p i 的解离，这一步可以通过与相应骨架纤维的结合而被加速， 但是在动蛋白催化的a t p 水解反应中，p i 的释放在a t p 水解后立即发生，而a d p 的释放极其 缓慢，微管和动蛋白的结合则加速了a d p 的释放( h a c k n e y ，1 9 8 8 ) 。 i 3 3 动蛋白在体外能产生沿着微管的定向运动 动蛋白能够驱动被其包被的乳胶小球沿着微管产生定向运动，同时微管亦能在涂有动蛋白的 玻片上进行定向移动( v a l ee ta 1 ，1 9 8 5 a ) 。定向移动的能量来源于a t p 水解所释放的化学能， a t p 的水解和水解产物的释放是在微管和动蛋白的高度协调相互作用下完成并通过动蛋白的构 象变化将化学能转化为机械能。 晟早发现的枪乌贼神经细胞和牛脑中的动蛋白因能向微管的正端一微管快速聚合的方向运 动而被称为正向马达( p o r t e re ta 1 ，1 9 8 7 ) ，而另一类微管马达一力蛋白则被称为负向马达 ( p a s c h a l e t a l ，1 9 8 7 b ；s c h r o e r e t a l ，1 9 8 9 ) 。后来研究发现，动蛋自家族中除了正向马达外， 还存在着一大类负向运动的动蛋白亚家族。动蛋白运动的方向由其结构所决定( e n d o we ta i ， 1 9 9 0 ：m e l u he ta 1 1 9 9 0 ) 。 4 图2 动蛋白超家族遗传发生树( e 1 i s ee ta a ，2 0 0 4 ) f i g 2ak i n e s i np h y l o g e n e t i ct r e e ( e l i s ee ta 1 2 0 0 4 ) 1 4 动蛋白的分类 依据催化中心在动蛋白重链中所在位置的不同，可将动蛋白分为三大类：k i n n ( n 一末端马 达域类) ，k i n c ( c 一末端马达域类) 和k i n l ( 中间马达域类) ( v a l ee ta 1 1 9 9 7