（化学工程与技术专业论文）有机磷农药残留的生物降解和oph法检测研究.pdf

浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 摘要 有机磷农药是农业生产中使用最为广泛的大类农药，它的大量应用引发 了环境污染，进而影响人类健康等一系列问题。当前，解决有机磷农药的环境 残留问题，采用有机磷降解菌和水解酶来检测与降解应该是一条较为合适、有 效的途径。本文一方面从微生物和酶两个不同的角度探求降解有机磷农药残留 的方法，以降低水体和土壤有机磷农药的污染；另一方面初步探索有机磷农药 残留的酶法快速检测，为水体环境和蔬菜、水果食品中有机磷农药残留的检测 提供有效的分析手段。具体研究内容如下： 为给降解三唑磷残留提供有效的微生物源，从三唑磷生产厂周围的土壤中 筛选出了一株能高效降解三唑磷的细菌。经鉴定，此细菌的种属为k l e b s i e l l as p ， 在p h = 7 0 8 0 ，温度3 2 3 7 0 c 的范围内生长良好；该菌在以三唑磷为唯一碳源或 唯一氮源生长的同时实现降解，三唑磷为唯一氮源时的生长和降解速率远高于 唯一碳源的情况，实验结果表明，甲醇为外加碳源，三唑磷为唯一氮源是最佳 的培养基设计；降解途径的研究表明：降解菌首先将三唑磷水解，然后将其水 解产物l _ 一苯基一3 一羟基一1 ，2 ，4 一三唑进一步降解。 除微生物降解之外，本论文从酶降解的角度研究了生物法降解有机磷农药 残留。首先，采用( n r 王4 ) 2 s 0 4 分级沉淀、脱盐处理、s e p h a d e x o - 1 0 0 凝胶层析的 分离纯化流程，从有机磷水解酶粗粉中分离纯化出了高纯度的有机磷水解酶。 然后，研究固定化酶降解甲基对硫磷，从不同材料的膜载体固定有机磷水解酶 的比较中，发现亲水膜比疏水膜适合作固定化酶载体；在此基础上，将有机磷 水解酶固定在聚醚砜微滤膜上，并制成酶膜生物反应器，用于降解甲基对硫磷； 戊二醛化学交联法固定时，酶液与1 0 牛血清白蛋白溶液的比例在3 ：1 2 ：1 ，与 交联荆的比例在7 ：2 7 ：4 范围内，固定化效果较好，并发现牛血清白蛋白和膜载 体有降低酶活损失的作用；将固定化的酶膜装于酶膜反应器降解甲基对硫磷， 实验结果表明：反应器的降解速率与固定化酶量呈正比，也随底物浓度的增加 而加快，当流速低时，降解速率随流速增大而加快，到7 m l m i n 以上时，降解 渐江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 速率不随流速的增加而变，降解的最低浓度为1 6 6 5 p p m 。 生物降解是解决有机磷农药残留的一条有效途径，其另一条途径是开发实 时监测技术，以规范有机磷农药的使用，因此本文进行了有机磷水解酶法检测 的初步研究。在游离酶检测中，考察了缓冲溶液浓度和p h 、酶量、温度、反应 时间等因素对检测的影响，确定操作条件为：体系中加入5 0 m m ，p h = 8 0 的磷 酸缓冲液3 m l ，原酶液2 0 u l ，室温反应时间5 m i n ，其对水中残留甲基对硫磷的 检测限为2 5 3 p p m 。在固定化酶检测方面，建立了以p h 电极为检测元件的有机 磷水解酶生物传感器的数学模型，以便为传感器的制备提供理论指导，数值法 求解了稳态过程的微分方程组，得出影响检测性能的主要因素为：表明过程控 制步骤的无因次常数a ，酶性质的常数k 。和底物浓度 s ，以及缓冲溶液浓度； 模型的预测结果与自制的o p h - p h 酶电极检测甲基对硫磷的实验结果吻合良 好。 关键词：有机磷农药残留；菌种筛选；微生物降解；有机磷水解酶；酶固定化 酶膜反应器；游离酶检测：酶生物传感器 浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 a b s t r a c t o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ( o p s ) a r eal a r g eg r o u po fp e s t i c i d ew i d e l yu s e di n a g r i c u l t u r e t h e i rw i d e s p r e a du s eh a sc a u s e ds e v e r ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n d t h r e a t e dh u m a nh e a l t h s oi ti si m p o r t a n tt of i n dn e ww a y st os o l v et h e s ep r o b l e m s s o l v i n gt h e s ep r o b l e m su s i n gb i o l o g i c a lt e c h n i q u ei st h o u g h ta sap r o m i s i n gw a y t h er e s e a r c hf o c u s e so nt w of i e l d s o n ef i e l di so nh o wt oe l i m a t et h ep e s t i c i d e p o l l u t i o nt h r o u g hb i o d e g r a d a t i o nb ym i c r o o r g a n i s m so re n z y m e t h eo t h e rf i e l di so n f i n d i n gan e wf a s ta n dc o s t e f f f e c t i v ea n a l y t i c a lt e c h n i q u et om o n i t o rt h eu s eo f o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s at r i a z o p h o s d e g r a d i n gs t r a i n ，k l e b s i e l l as p ，w a si s o l a t e db ye n r i c h m e n t t e c h n o l o g yf r o ms o i lt h a th a db e e ne x p o s e dl o n g t e r mt ot r i a z o p h o s t h en u t r i e n t r e q u i r e m e n to ft h ei s o l a t ew a sv e r ys i m p l ea n di tg r e ww e l la tp h7 0 8 0w i t ha b r o a dt e m p e r a t u r ep r o f i l er a n g i n gf r o m3 2 。ct o3 7 0 c t h ed i f f e r e n td e g r a d a t i o n r a t e so b s e r v e dw h e nt r i a z o p h o sw a su t i l i z e da st h ec a r b o ns o u r c e ，o rt h es o l e n i t r o g e ns o u r c es h o w e dt h a tt h ei s o l a t eu t i l i z e dt r i a z o p h o sa st h es o l en i t r o g e n s o u r c em o s te f f e c t i v e l y t h ei s o l a t ed e g r a d e dt r i a z o p h o st h r o u g hah y d r o l y s i s m e c h a n i s m f u r t h e r m o r e ， i tc a n d e g r a d e t h e i n t e r m e d i a t e ， 1 - p h e n y l 一3 - h y d r o x y l ，2 ，4 一t r i a z o l e ，i n t oi n o r g a n i cc o m p o u n d s t h i ss h o w e dt h eg r e a t p o t e n t i a lo f t h ei s o l a t ei nb i o d e g r a d a t i o no f t r i a z o p h o sp o l l u t i o n i t i sa l s oa l le f f e c t i v ew a yt o b i o d e g r a d eo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sb y e n z y m e f i r s t ，t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fo r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s ef r o m c r u d ee n z y m ew a sd o n e t h ep r o c e s si n c l u d e d ( n t 4 ) 2 s 0 4f r a c t i o n i z e dp r e c i p i t a t i o n ， d e s a l i n a t i o na n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h eo r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s ew a s p u r i f i e da c c o r d i n gt o t h er e s u l to fs d s - p a g e s e c o n d , t h eb i o d e g r a d a t i o no f m e t h y l p a r a t h i o nb yi m m o b i l i z e do r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s ew a si n v e s t i g a t e d o r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s ew a si m m o b i l i z e do nm i c r o f i l t r a t i o nm e m b r a n e sa n d t h e nt h ee n z y m em e m b r a n ew a si n s t a l l e di n t ot h ef i l t r a t i o nd e v i c et of o r ma l le n z y m e m e m b r a n eb i o r e a c t o nt h er e s u l to fi m m o b i l i z a t i o ns h o w e dt h a t h y d r o p h i l e m e m b r a n e sw e r em o r ea d v a n t a g e o u st h a nh y d r o p h o b eo n e st oa c ta si m m o b i l i z a t i o n 浙江大学博士学位论文 有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 c a r r i e r c r o s s l i n k i n go r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o ! a s eb yg l u t a r a l d e h y d e o n p o l y e t h e r s u l f o n em e m b r a n ei s as i m p l ea n dp r a c t i c a li m m o b i l i z a t i o nm e t h o d a n a p p r o p r i a t ea m o u n to fb o v i n es e r u ma l b u m i na n dc r o s s l i n k e ri sn e c e s s a r yt og e ta g o o dr e s u l to fi m m o b i l i z a t i o n i nt h eb i o d e g r a d a t i o no fm e t h y l p a r a t h i o nt h r o u g h e n z y m em e m b r a n er e a c t o r ，t h ee f f e c to fi m m o b i l i z e de n z y m ea m o u n t ，f l o wr a t eo f p e r i s t a l t i cp u m p ，p ho ft h ef e e d ，a n dt h em e t h y l p a r a t h i o nc o n c e n t r a t i o no n b i o d e g r a d a t i o nr a t ew a ss t u d i e d i tw a ss h o w nt h a tt h eb i o d e g r a d a t i o nr a t ei n c r e a s e d w i li n m a o b i l i z e de n z y m ea m o u n ta n ds u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n b i o d e g r a d a t i o nr a t e d i d n ti n c r e a s ew h e nt h ef o l wr a t eo ft h ep e r i s t a l t i cp u m pw a sl a r g e rt h a n7m l m i n t h ed e g r a d a t i o nl i m i to f m e t h y l - p a r a t h i o nc o n c e n t r a t i o nw a s1 6 6 5p p m t h eo t h e rw a yt or e s o l v eo p si st of i n dn e w a n a l y s i sm e t h o d sa sa l la l t e m a t i v e f o rt r a d i t i o n a lo n e s i ti sas i m p l ea n dq u i c kp r o c e s st oa n a l y s em e t h y l - p a r a t h i o n c o n c e n t r a t i o nu s i n gf r e e o r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s e t h e e f f e c to fb u f f e r c o n c e n t r a t i o na n dp h ，e n z y m ea m o u n t ，t e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m eo nd e t e c t i o n w a si n v e s t i g a t e d a c c o r d i n gt ot h ee f f e c to f t h ea b o v ef a c t o r s ，t h ed e t e c t i o nc o n d i t i o n w a sd e c i d e da sf o l l o w s ：t h eb u f f e rv o l u m ew a s3 m l ，b u f f e rc o n c e n t r a t i o n5 0 m m ，p h w a s8 0 ，e n z y m ea m o u n tw a s2 0 u l ，r e a c t i o nt i m e5 m i n ，a tr o o mt e m p e r a t u r e b i o s e n s o r si m m o b i l i z i n go r g a n o p h o s p h o r r i sh y d r o l a s ea r eas u i t a b l ea l t e r n a t i v e f o rt r a d i t i o n a lo r g a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d e sa n a l y t i c a lt e c h n o l o g y i nt h i sp a p e r , a m a t h e m a t i cm o d e lo fb i o s e n s o r si m m o b i l i z i n go r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s ea n dp h e l e c t r o d ea st h et r a n s d u c e r sw a ss e tu p t h es o l u t i o no ft h ed i f f e r e n t i a le q u a t i o n s d e s c r i b i n gt h ed e t e c t i o np r o c e s so ft h eb i o s e n s o r ss u m m a r i z e dt h em a i nf a c t o r s i n f l u e n c i n gt h er e s p o n s ec h a r a c t e r i s t i c so f t h eb i o s e n s o r s k e y w o r d s ：o r g a n o p h o s p h o r sp e s t i c i d e s ；i s o l a t i o n ；d e g r a d a t i o nb ym i c r o o r g a n i s m ； o r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s e ；e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n ； m e m b r a n er e a c t o rw i t h i m m o b i l i z e de n z y m e ；d e t e c t i o nb yf r e ee n z y m e ；e n z y m a t i cb i o s e n s o r 浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 第一章绪论 近年来，有机磷农药( o p s ，o r g a n o p h o s p h a t eo ro r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ) 因种类多、毒性高、环境中持久性低等特点替代了有机氯而成为农业生产中使 用最为广泛的一类农药，不仅使用量成倍增长，使用范围也逐渐扩大，从控制 农作物病虫害的杀虫剂扩展到杀菌剂、杀软体动物剂、杀鼠剂、除草剂、脱叶 剂和植物生长调节剂等用途。除作为农药使用外，o p s 还广泛用作石油添加剂。 随着o p s 的大量使用，o p s 引发了一系列的世界性问题。o p s 对环境中地 下水、地表水等水资源和土壤的污染 1 2 1 ，对非靶向生物体的毒性，在食物中的 残留以及对人类健康的威胁【3 州等问题成了全球普遍关注的焦点，因此，这些问 题的解决也成为了近期的研究热点。 1 1 o p s 的结构 有机磷农药属于有机磷化合物( o p s ) 的范畴，通常是指磷( 膦) 酸酯、硫代 磷酸酯、磷酰胺酯类有机磷化合物，其结构可用通式( f i g u r e l 1 a ) 来表示，其 中r l 、r 2 、z 为各种侧基，直接或间接通过0 或s 与p 原子结合，r l 、r 2 通常 为烷基，z 为卤素、脂肪族、芳香族或杂环类基团，因为z 比烷基更容易被水 解解离，所以z 常被称为解离基团，几种常见的o p s 结构参见f i g u r e1 - l b 。 o ( s ) r 1 9 一z r 6 m m 。e 。o ，- i h 、。n 。：e e t 。o 。，- - i p i 、。：一n 。：e e t 。o - - r i 盟s0 、。：一n 。： s m e t h y lp a r a t h i o n p a r a t h i o n p a r a o x o n 浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 i n 广一烈 t a b u n ( 0 o n 广o o 1 f s a r i n ( 0 0 1 、 ，s 一。n - - n - - ，s 一。d c l c t 器 义s 。n c 2 h 5 0 、 p - v c 2 h 5 0 i p ，、te t o 、! j 掣，o 叫，o 一o a 磊强。q f i g u r e1 - 1 t h es t r u c t u r eo fo r g a n p h o p h o r u sp e s t i c i d e s ( o p s ) a t h eg e n e r a ls t r u c t u r eo fo p sb t h es t r u c t u r eo fs e v e r a lc o m m o no p s 1 2 o p s 的发展史 有机磷化合物是磷酸的衍生物，最初作为化学武器而生产使用，因为它们 是人类合成的最毒物质之一，通过竞争性抑制与神经传递有关的胆碱酯酶产生 毒性，所以有机磷化合物也被称为“神经毒剂”。 有机磷化合物作为化学战剂是二战期间德国纳粹首先发展起来的，位叫 g e r h a r ds c h r a d e r 的化学家最初试图合成有机磷化合物用作农药，德国的军事组 织很快意识到有机磷化合物作为战争武器的潜力，于是s c h r a d e r 小组把他们的 精力就转移到发展有机磷化学战剂上，到二战末期，s c h r a d e r 研究小组已经研 制了2 0 0 0 多种有机磷化合物，其中包括三种“经典”的战剂( 被美国分类为“g 类) ：塔崩( t a b u n ，1 9 3 6 ) ，沙林( s a r i n ，1 9 3 8 ) 和梭曼( s o m a n 1 9 4 4 ) 。“g ”类 战剂的特点是不稳定，易挥发，致毒途径主要是吸入。1 9 4 2 1 9 4 5 年间，德国 纳粹生产了1 2 ，0 0 0 吨的塔崩。 战后，盟国抓获了大量的有机磷神经毒剂，并且建立了研究项目来研究这 些物质的作用机制，以图发展更有效的化学武器和更有效地防御这些化学武器 的进攻。二十世纪五十年代，研制出了所谓的“v ”类神经毒剂，包括v x ，“v ” 类神经毒剂被美国选作化学武器而生产，虽然这些物质的作用机理与g 类物质 相同，但v 类物质的毒性更大、蒸汽压更低、而且持久性更长，致毒途径主要 触小 吣垤 浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 是皮肤吸收。直至1 9 9 3 年，世界上1 7 4 个国家签署了销毁化学战剂、发散战 剂的装各和设各的化学武器协议( 1 9 9 3 年签署，1 9 9 7 年批准) ，有机磷化学战 剂的研究和使用才告一段落。 二次世界大战之后，美国和欧洲国家开始生产作为农药的有机磷化合物， 这些化合物的毒性要比作为化学战剂的有机磷化合物低上千倍，作用机理与之 相同。有机磷农药大多是良好的杀虫剂，t e p p ( t e t r a e t h y lp y r o p h o s p h a t e ) 是最早 发现的有机磷杀虫剂，它是德国在二战期间研究神经毒剂过程中作为副产物被 发现的”j 。二十世纪七十年代末期以来，o p s 因种类多( 迄今经过杀虫特性测试 的有机磷化合物共有1 0 0 0 ，0 0 0 种，其中1 0 0 多种发展成为了商业农药) 、毒性高、 环境中持久性低等特点替代了环境中持久性强、难降解的有机氯而成为农业生 产中使用最为广泛的一大类农药，除用于农业生产外，o p s 还广泛用于家庭和 娱乐场所的虫害控制，家禽和家畜身上寄生虫控制等。 许多国际上知名的大化学公司都生产经营o p s ，7 主要产品有h o s t a t h i o n ( t r i a z o p h o s ) ，m e t a s y s t o x - r( o x y d e m e t o n m e t h y l ) ，d u r s b a n a n dl o r s b a n ( c h l o r p y r i f o s ) ，s u m i t h i o n ( f e n i t r o t h i o n ) a n da c t e l l i c ( p i r i m i p h o s m e t h y l ) 等。1 9 9 2 年，全球杀虫剂的销售额u s $ 7 ，4 0 0m i l l i o n 中o p s 有u s $ 2 ，8 8 0m i l l i o n ，占据了 将近4 0 的杀虫剂市场 6 】，整个9 0 年代o p s 的销售一直占据统治地位，不仅使 用量成倍增长，使用范围也逐渐扩大，从控制农作物病虫害的杀虫剂扩展到杀 菌剂、杀软体动物剂、杀鼠剂、除草剂、脱叶剂和植物生长调节剂等用途。美 国9 0 年代初每年对硫磷和甲基对硫磷两种o p s 的使用量就在7 ，0 0 0 ，0 0 0 磅：在 英国，1 9 9 4 年用于农业生产的o p s3 9 5 吨，按有效成分重量计算，o p s 占英国 杀虫剂市场的6 0 ，1 9 9 2 到1 9 9 4 年间，乐果的使用量增加了8 9 ，毒死蜱的 使用量增加了近8 倍；9 0 年代，中国的农药产量接近3 0 0 ，0 0 0 t y ，以杀虫剂为 主，杀虫剂的使用量占农药总产量的7 5 左右，其中有机磷杀虫剂占杀虫剂总产 量的7 7 ，在年产量万吨以上的6 个杀虫剂品种中，有5 个是有机磷杀虫剂。 1 3 o p s 引发的问题 o p s 的大量使用造成它对环境的危害越来越大，因为所施用的农药只有不到 1 能到达靶向生物，其余的渗入到土壤和水体中。美国7 0 的河流污染由农业 浙江大学搏士学位论文 有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 造成，最近的地质调查结果显示，在地表水和地下水体中都已经检测到了o p s 刀。 o p s 对水环境的毒害已经引起了官方的重视，所有的o p s 都被列入了e u 为保护水 环境列出的有害化学物质的黑名单中，1 9 8 9 年英国环境部把敌百虫、杀螟松和 马拉硫磷列为警戒物质，要求减少这些物质的使用以保护环境。1 9 9 3 年， c a l i f o r n i a 南部的o r a n g e 县水质控制局完成的n e w p o r tb a yw a t e r s h e d 水体有毒物 质研究发现，n e w p o r tb a y 和s a l ld i e g oc r e e k 水体中毒物浓度严重超标，其中主 要毒物为二嗪农和毒死蜱，约占5 0 ，在n e w p o r tb a yw a t e r s h e d 周围区域每年大 约1 0 0 ，0 0 0 磅的二嗪农和毒死蜱用于商业或公共场所的虫害控s j j 8 1 ，所排放的农 药污水是水体污染的主要来源，农业上使用的二嗪农和毒死蜱也是造成水体污 染的一个原因。n e w p o r t b a y 的农药污染威胁了当地居民的身体健康和自然环 境，出现的鸟和鱼的死亡以及儿童中毒现象均与水体的二嗪农和毒死蜱污染有 关口l 。 有机磷化学战剂对人类和环境造成的污染也是一件非常棘手的问题。目前 美国和其他有化学战剂库存的国家虽然正在销毁化学战剂，但由于缺乏销毁化 学战剂的良好技术和多种因素的影响，化学战剂的彻底销毁并不是一个简单的 过程，因此专家估计化学战剂的销毁预计成本要5 0 0 的超预算和时间要延迟 1 0 年左右。另外，几十年前俄国就地销毁的战剂已经渗透并污染了周围区域。 由此可见，如何彻底销毁战剂以及战剂焚烧带来的二次污染仍是当今世界性的 严峻课题。 o p s 的高毒性引发了很多人类和动物的健康问题，大量的研究已经证明了 当人类或动物接触o p s 后行为、心理都会受到不同程度的影响。s a v a g e 1 田在心 理和运动反射测试的过程中发现o p s 能引起不良的后果；b i r m i n g h a n 职业医学 院的一项研究【l l j 显示神经系统的微小变化可能与接触o p s 有关；g o r a nj a m a l 博士指出，接触小剂量的o p s 开始可能只产生亚临床的后果，但是能使人将来 更容易受毒性作用的侵害，从而危害神经系统；另外的一些研究结果表明，接 触o p s 能导致精神沮丧，这可能也是o p s 使用量大的地区自杀率较高的一个原 因；o p s 还能导致心脏方面的疾病、胎儿畸形、癌症、视力降低等症状。世界 卫生组织估计每年大概有3 ，0 0 0 ，0 0 0 起的急性农药中毒事件，2 0 ，0 0 0 起的意外死 亡，这些事件大多发生在农药使用较多的发展中国家 ”】。1 9 9 5 年，中国发生 4 浙江大学博士学位论文 有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 1 5 ，3 0 0 起农药中毒事件，9 1 是o p s 引起，这其中6 7 是对硫磷、m e t h a m i d o p h o s 和o m e t h o m e 三类农药引起 1 3 。美国国家职业安全和卫生学院的k y l e s t e e n l a l l d 【1 4 认为即使在发达国家农药中毒仍然是不能忽视的问题，据环境保护 局( e p a ) 的统计美国每年发生3 ，0 0 0 5 ，0 0 0 起的o p s 意外中毒事件；i n d o n e s i a 的f a o 研究发现在每年的喷洒农药季节，接触农药引起的疾病明显高于其它季 节 ”1 。 农药的职业危害更是不容忽视，有机磷农药代替有机氯农药以来，农民的 职业危害问题更加突出，因为o p s 虽然在环境中的残留少，但是它的毒性远远 高于有机氯，据世界资源组织的估计，美国每年有3 1 3 ，0 0 0 的农民遭受农药引起 的疾病的困扰；另一资料显示，每年估计有8 0 0 到1 , 0 0 0 的农民死于长期接触农 药。1 9 8 6 年，e p a 发现对硫磷引发了职业中毒，e p a 认为对硫磷对农民的威胁 非常大，即使在职业保护的前提下也能引起中毒。 另外，果蔬食品中农药残留问题现也成为了世界性的热点问题，很多食品 中都已检测到o p s 的残留，英国农业部1 9 9 5 年的数据显示l - 2 的胡萝b 中o p s 残留是允许值的2 5 倍，涉及到的o p s 有毒虫畏、q u i n a l o p h o s 、三唑磷i l “。对我 国来讲，农药残留问题更是紧迫，它不仅直接关系国民的生活质量和健康水平， 而且直接关系出口贸易。农药残留问题遍及我国各地各类农产品和果蔬中，在 2 0 0 0 - - 2 0 0 4 年期间全国进行的3 次针对蔬菜农药残留的国家监督抽查中，共抽 查了6 3 个大型蔬菜批发市场的4 3 6 种产品，合格2 6 7 种，平均抽样合格率只有 6 1 2 。全国因食用残留农药的蔬菜中毒事件屡屡发生，尤以广东为甚，据广 东有关部门统计，仅蔬菜残留农药食物中毒每年超过1 0 0 起。我国的果蔬农产 品出口在对外贸易中占据重要份额，近年来面临的以农药残留限量标准为中心 的各种“绿色壁垒”，严重影响了我国农产品的出口量，每年因此被退货价值 达上亿甚至数十亿美元，日本从2 0 0 1 年开始就不断对我国蔬菜、禽肉等农产品 设置技术壁垒，致使整个行业损失惨重；欧盟和美国多次指出向其输出的花生 中农残严重“超标”，并有多次退货事件发生；2 0 0 4 年1 0 月1 3 日，日本厚生劳 动省突然宣布对我输日保鲜豌豆及其加工产品实施残留农药命令检查，这是因 为1 0 月以来我出1 ：3 保鲜豌豆农残超标严重，日方称“已经达到发动禁止进口的 条件”，企业遭受了严重的损失。 浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 o p s 引发的这些问题涉及两方面的研究内容，一方面，寻找消除有机磷农 药污染的有效方法；另一方面，研究快速、准确、灵敏、方便、适合现场操作 的o p s 浓度分析方法，以有效地管理o p s 的使用，减少o p s 的污染。下文即介 绍了国内外这两方面的研究进展情况，目前国内外倾向于用生物的方法解决 o p s 引发的问题，在消除o p s 的污染方面普遍看好生物修复法；在o p s 的分析 技术方面普遍看好酶法检测和生物传感器检测技术。 1 - 4 生物修复法消除有机磷农药污染 对于土壤和地下水的污染，传统的处理方法有抽出处理和土壤焚烧两种， 抽出处理技术是把污染的地下水抽出，然后处理，处理好后再回注到地下；土 壤焚烧是先把污染的土挖出，焚烧，然后埋入坑中。虽然这两种方法很有效， 但是处理成本太高，大多数情况下需要几十年的不断处理才能彻底修复一个地 区。 代替这些传统处理方法的一个极具吸引力的方法是生物修复，生物修复 ( b i o r e m e d i a t i o n ) 是近年来发展起来的用于治理环境污染的一门新技术，它主要 是通过微生物的作用，将环境中的有机污染物转化为c 0 2 和h 2 0 等无毒无害 或毒性较小的物质。大量研究证实，在自然界的生态系统中微生物对土壤和水 环境中的农药降解起着重要的作用，微生物具有种类多、变异快和易于操纵的 特点，是生物修复的重要生物资源。生物修复的方法不仅成本低而且处理速度 快，另外传统处理方法不能比拟的是，生物修复可以彻底降解农药为二氧化碳 和水，而不是暂时抑制污染。用微生物或无细胞酶制品来消减农药污染的生物 修复技术具有广阔的应用前景，是治理农药污染的有效途径。 生物修复也可以采取不同的方法( f i g u r e l 一2 ) ，一种是自身修复，保持污染 地区不动，让污染地固有的微生物降解污染物，用取样井来监测污染的程度； 一种是生物刺激的方法，向污染地注入微生物生长的所需营养，如氮源或氧， 从而加速微生物的生长和污染降解速度：另一种生物扩展的方法是向污染地释 放能够降解污染物的微生物。 生物修复法治理污染的关键步骤是获得对污染物高降解能力的菌株。至今， 降解o p s 的多种微生物已从环境中分离，降解性能被表征，并分离纯化了降解 浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检测研究 酶，鉴定了降解基因，有关方面的研究不断深入和扩展，正在为微生物或微生 物源酶制剂生物修复o p s 污染问题铺平道路。 f i g u r e1 - 2s c h e m a t i c so fc o m m o nt y p e so fb i o r e m e d i a t i o ns t r a t e g i e s i i n t r i n s i eb i o r e m e d i a t i o n ( 1 e f t ) ，b i o s t i m u l a t i o n ( m i d d l e ) a n db i o a u g m e n t a t i o n ( r i g h o 1 4 1 微生物法降解o p s 微生物降解农药的研究从上世纪4 0 年代末开始以来一直是国内外的研究热 点，至今已取得了很大进展，单从有机磷农药方面来说，目前已分离出许多有 机磷农药的降解菌，其中一些微生物的有机磷降解酶的生化性质已经得至u 鉴定， 少数有机磷农药降解基因已得到分离、鉴定和改造，降解机理研究日趋深入， 降解效果稳定提高。 已报道的降解o p s 的微生物有细菌、真菌、放线菌、藻类等，大多数来自土 壤微生物类群。细菌由于其生化上的多种适用能力阻及容易诱发突变菌株从而 。 占了主要的位置。其中假单胞菌属是最活跃的菌群。 1 9 7 3 年，s e t h u n a t h a nu t 报道了能降解对硫磷，以对硫磷为唯一碳源生长 的黄杆菌属f l a v o b a c t e r i “ms p a t c c 2 7 5 5 1 ；s i d d a r a m a p p a 掣1 8 1 报道了假单胞菌 p s e u d o m o n a ss p a t c c 2 9 3 5 3 ；m u l b r y 等； 挣】报道了此种菌体携带编码有机磷水解 酶( o p h ) 的质粒；1 9 8 2 年，s e r d a r 2 0 1 等人从混合细菌培养液中分离纯化出对对硫 磷有降解能力的p s e u d o m o n a sd i m i n u t a 菌株，并指出p s e u d o m o n a s 硪m f - n u t a 中携 带有编码o p h 的质粒：这两种菌体在8 0 年代得到了广泛和深入的研究【2 1 。2 4 1 ，纯 化出了完成降解作用的酶，编码基因o p d 测序并克隆，结果发现两种基因序列具 有很高的同源性。同一时段，c h a u d h r y 等筛选出了降解甲基对硫磷的 p s e u d o m o g l a ss p 【2 5 】：之后，r a n ia n d l a l i t h a k u m a r i l 2 6 - 2 7 报道了降解甲基对硫磷 的p s e u d o m o n a s p u t i d a ，以甲基对硫磷为唯一碳源生长的f l a v o b a c t e r i u mb a l u s t i 浙江大学博士学位论文有机磷农药残窝的生物降解和o p h 法检测研究 h u m 2 8 】菌株也有报道。 t a b l e1 - 1 m i c r o o r g a n i s m sd e g r a d i n gs e v e r a lo r g a n o p h o s p h a t e s 有机磷农药 微生物 参考 文献 甲基对硫磷大比目鱼黄杆菌fb a l u s t i ”“珊 m e t h y l p a r a t h i o n 微藻m i c r o a l g a e 产碱菌属a l c a l i g e n e ss p 芽孢杆菌b a c i l lu ss p 【3 0 【3 1 】 f 3 2 】 3 3 】 青霉p e n i e i l l i 啪w 口 ：”行以” 【3 4 1 对硫磷 芽孢杆菌b a c i l lu ss p 【3 5 芽孢杆菌 ” p a r 砒h l o n 不动杆菌属a e in e t o b a e t e rs p 3 6 】 不动杆菌属 ” c o u m a p h o sn - 旨n nn o c a r 砒s p b 一1 ，b 。2 ，b 3 【3 9 m o n o c r o t o p h o s 铜绿假单胞菌p 口e r u g in o s of 1 0 b 4 0 1 m e t h a m i d o p h o s芽孢杆菌b a c i l lu ss p n m j5 h 2 】 年里 铜绿假单胞菌p a e r u g in o s am c m b 4 2 7 l 4 3 1 - j 、m d i m e m o a t e 黄曲霉a s p e r g i l lu s f l a yu s m 1 聚多曲霉a s p e r g i l lu ss y d o w i i 4 5 1 马拉硫磷 微球菌m i c r o c o c c u ss p m - 3 6 君l a g - 4 3 网 m a l 抽i o n 绿色木霉t r i c h o d e r m av ir id e 。 米曲霉a s p e r g i l lu so r y z a e 4 8 】 在我国，王银善等从棉田中分离出一株降解对硫磷能力较强的黄杆菌 f l a v o b a c t e r i u ms pp 3 2 ，该菌还可降解甲基对硫磷，水胺硫磷等4 9 1 ；崔中利等 【5 0 1 从农药厂污泥中分离得到降解甲基对硫磷的混合菌群，混合菌群由两种 p s e u d m o n a s s p 菌组成；陈亚丽等【5 i 】报道了降解甲基对硫磷的假单胞菌 浙江大学博士学位论文有机磷农药残留的生物降解和o p h 法检钡4 研究 p s e u d o m o n a ss p w b c 一3 ；p s e u d o m o n a ss p 降解蝇毒磷【5 2 1 、甲胺磷、异硫磷 5 4 1 、丙线磷 5 5 1 也均有报道。 除降解对硫磷和甲基对硫磷的假单胞菌属以外，降