（食品科学专业论文）瑞士乳杆菌发酵乳蛋白肽与抗ACE功能的研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 。 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或 撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 歙轩 日期：弦秒x 年岁月z 日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技 大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：匀钐建铴 同期：汐珍辟 月之j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权天 津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密il ( 请在方框内打“”) ，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密il ( 请在方框内打“”) ： 作者签名： 导师签名： 日期：潲年岁月q 日 日期：加国年弓月7 日 奄，。 1 摘要 本文通过对瑞士乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ) 发酵乳及其乳清的血管紧张素 转化酶( a c e ) 抑制活性的体外检测和先天性高血压大鼠的体内检测，研究它的降血 压功能。 瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 发酵乳a c e 抑制活性大于瑞士乳杆菌b 0 2 发酵乳a c e 抑制 活性，因而对瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 发酵乳加工工艺进行优化。通过单因素实验和正交 实验确定了a c e 抑制活性最佳的生产工艺条件：脱脂复原乳浓度1 3 ；接种量3 ； 培养温度4 2 ；发酵时间6h 。超滤发酵乳的乳清，测定滤液的a c e 抑制活性。4 2 ， 6h 发酵乳样品a c e 抑制活性最高，为3 5 7 1 。4 下后发酵3d 的抑制活性最佳， 为4 5 9 1 。 以感官评价作为瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 发酵乳的最终评价，通过单因素实验和正交 实验确定了最佳的生产工艺条件。最佳工艺组合为脱脂复原乳浓度1 3 ；接种量3 ； 培养温度4 2 ；后发酵时间2d 。发酵乳组织状态均匀细腻，酸度适中。 利用8 周龄先天性高血压大鼠( s h r ) 研究两种瑞士乳杆菌发酵乳及乳清对尾部 动脉血压和心率产生的影响。每天使用瑞士乳杆菌发酵乳或乳清灌胃s h r 大鼠，每 一试验样品实验期为3d ，剂量逐渐升高，对照组饮用水。用z h h x z 鼠尾无创动脉 测量仪测定收缩压、舒张压和心率。当瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 发酵乳剂量1 5m l k g 体 重与乳清剂量为2 0m l k g 体重，血压的下降和上升速度相对缓慢，维持最低血压水 平时间较长为6h ，降压效果最好且与对照组相比降压值为2 0 2m m h g 。当瑞士乳杆 菌t u s t 0 0 5 发酵乳乳清剂量为1 0m l k g 体重，心率与对照组相比下降幅度为5 0 2b p m ， 因此降心率效果最好；当瑞士乳杆菌b 0 2 发酵乳剂量2 0m l k g 体重，心率与对照组 相比下降幅度为6 0 2b p m ，因此降低心率效果最好。用瑞士乳杆菌发酵乳喂养s h r 大鼠，能明显降低血压和心率。 瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 发酵乳对于s h r 大鼠具有降血压，降低心率的作用，这一 结果还需临床观察进一步验证。 关键词：瑞士乳杆菌；a c e 抑制活性；先天性高血压大鼠；血压；心率 a b s t r a c t t h ea n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t i n ga c t i v i t yo fl a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u sf e r m e n t e dm i l ka n di t sw h e yw a sd e t e r m i n e di nt h i sp a p e r , a n dt h e i re f f e c t so n b l o o dp r e s s u r ew e r ei n v e s t i g a t e du s i n gs p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s a sl a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u st u s t 0 0 5s h o w e dh i g h e ra c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yt h a nl a c t o b x v h 心h e l v e t i c u s b 0 2 ，t h e 幻出f l i c a lp 臼瞄m 阳so f 厶捌魂舭h e l v e t i c u st u s t 0 0 5f e r m e n t e dm i l k 嘁q 妯【i 】i 捌 t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o r i a la n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa c c o r d i n gt oi t sa c ei n h i b i t o r y a c t i v i t y r e c o n s t i t u t e ds k i mm i l k ( 13 ) w a si n o c u l a t e dw i t h3 ( v v ) s t a r t e r , a n d i n c u b a t e du n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dt i m e u s i n gu l t r a f i l t e rt r e a t e d t h ew h e yo f f e r m e n t e dm i l k t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h es a m p l ea t4 2 f o r6 hr e a c h e dt o3 5 7 1 ， a n dt h eh i g h e s ti n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h es a m p l es t o r e da t4 f o r3dr e a c h e dt o4 5 91 皿1 es e n s o r ye v a l u a t i o nr e s u l t sc o n f i r m e dt h ea b o v es a m p l ew i t l lg o o dc o a g u l a t i o n , m o d e r a t ea c i d i t ya n dh i g h e ra c c e p t a b i l i t y t h ee f f e c t so fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u sf e r m e n t e dm i l ka n di t sc e n t r i f u g a l u l t r a f i l t e r p r e p a r e dw h e yo nb l o o dp r e s s u r ea n dh e a nr a t e w a se v a l u a t e d 、7 l ，i m8w e e ko l d s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ( s h r ) w e i g h i n g18 0 2 0 0g e v e r ys a m p l ew a su s e dt o s h ro nc o n s e c u t i v e3d ，d u r i n gw h i c ht h e yr e c e i v e di n c r e a s i n gd o s e sb yg a s t r i ci n t u b a t i o n w a t e rw a su s e df o rc o n t r o la d m i n i s t r a t i o n t h es y s t o l i cb l o o dp r e s s u r e ，d i a s t o l i cb l o o d p r e s s u r ea n dh e a r t r a t ew e r em e a s u r e db yz h h x zt a i lc u f fw i t l lap r o g r a m m e d e l e c t r o - s p h y g m o m a n o m e t e r a t15m lp e rk gb o d yw e i g h td o s eo fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s t u s t 0 0 5f e r m e n t e dm i l ka n dt h e2 0m lp e rk gb o d yw e i g h td o s eo fl a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u st u s t 0 0 5f e r m e n t e dm i l kw h e y , w eo b s e r v e dam a r k e da n dl o n g l a s t i n g a n t i h y p e r t e n s i v ee f f e c tf o r6h c o m p a r e dt ot h a to fc o n t r o ls h r ，t h em a x i m u md e c r e a s ei n m e a na r t e r i a lb l o o dp r e s s u r e ( 2 0 2m m n g ) w a sa c h i e v e d c o m p a r e dt ot h a to ft h ec o n t r o l s h r ，t h e2 0m lp e rk gb o d yw e i g h td o s eo fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u sb 0 2f e r m e n t e dm i l k a n dt h e10m lp e rk gb o d yw e i g h td o s eo fl a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st u s t 0 0 5f e r m e n t e d m i l kw h e y , w h i c he l i c i t e das i g n i f i c a n td e c r e a s ei nh e a r tr a t e ( m a x i m u mo f6 0 2b p ma n d 5 0 2b p m ，r e s p e c t i v e l y lw e r eo b s e r v e d t h e r e f o r e ，s i g n i f i c a n tr e d u c t i o n si nm e a ns y s t o l i c b l o o dp r e s s u r e ，a n dh e a r tr a t ew e r eo b s e r v e df o l l o w i n gi n t r a - g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o no f l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st u s t 0 0 5f e r m e n t e dm i l k i nc o n c l u s i o n l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u st u s t 0 0 5f e r m e n t e dm i l ke x h i b i t s a n t i h y p e r t e n s i o na n dh e a r tr a t er e d u c i n ga c t i v i t i e s i no r d e rt od e m o n s t r a t et h em e c h a n i s m ， t h el a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c 螂t u s t 0 0 5f e r m e n t e dm i l ks h o u l db ef u r t h e rs t u d i e di nc l i n i c k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u sf e r m e n t e dm i l k , i n h i b i t o r ya c t i v i t y t oa c e ， s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ，b l o o dp r e s s u r e ，h e a r tr a t e 目录 1 。前言1日u 舌1 1 1 发酵乳的定义l 1 2 发酵乳的发展状况1 1 3 发酵乳的营养保健作用l 1 3 1 营养作用1 1 3 2 缓解乳糖不耐症作用一2 1 3 3 整肠作用2 1 3 4 控制肠道微生物菌群的生长2 1 3 5 降低胆固醇和血氨作用2 1 3 6 预防某些类型的癌症。2 1 3 7 降血压作用2 1 4 酸奶发酵剂的概况2 1 4 1 生产发酵乳的主要乳酸菌种类3 1 4 2 乳酸菌的生理功能4 1 4 3 乳酸菌的生产繁殖5 1 4 4 瑞士乳杆菌的简介6 1 5 乳源生物活性肽6 1 5 1 血管紧张素转化酶抑制肽作用机理7 1 5 2 血管紧张素转化酶抑制肽分离与纯化一8 1 5 3 血管紧张素转化酶抑制肽的测定与评价9 1 6 本课题研究的目的和意义。1 0 1 6 1 背景和必要性1 0 1 6 2 研究目的1o 1 6 3 研究意义l l 1 7 研究的主要内容1 2 2 材料与方法1 3 2 1 实验材料、仪器与主要试剂一1 3 2 1 1 菌种13 2 1 2 主要原材料1 3 2 1 3 计数培养基l3 2 1 4 主要仪器1 3 2 1 5 主要试剂1 4 2 2 实验方法1 5 2 2 1 原料乳的预处理l5 2 2 2 发酵剂的制备：一1 5 2 2 3 酸度的测定15 2 2 4 瑞士乳杆菌与丁二酮链球菌的拮抗实验1 5 2 2 5 瑞士乳杆菌与丁二酮链球菌的添加比例1 6 2 2 6 主要工艺参数的确定1 6 2 2 7 感官评价1 6 2 2 8 乳清肽的分离提取1 7 2 2 9 瑞士乳杆菌发酵乳产生a n t i a c e 的研究18 2 2 1 0 瑞士乳杆菌发酵乳p h 的变化2 0 2 2 1 1 发酵乳总蛋白质f i n ) 含量的测定。2 0 2 2 1 2 游离氨基酸的测定2 1 2 2 13 动物实验：2 2 3 结果与讨论2 6 3 1 瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 、瑞士乳杆菌b 0 2 和丁二酮链球菌2 6 3 1 1 纯种鉴定2 6 3 1 2 瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 生长特性2 6 3 1 3 瑞士乳杆菌b 0 2 的生长特性2 7 3 1 4 丁二酮链球菌的生长特性。2 9 3 1 5 瑞士乳杆菌与丁二酮链球菌的拮抗实验3 0 3 1 6 瑞士乳杆菌与丁二酮链球菌的添加比例一3 0 3 2 四种发酵剂的发酵乳的生长特性和a c e 抑制活性的比较3 0 3 2 1 生长特性实验3 0 3 2 2 四种发酵乳a c e 抑制活性的比较3 2 3 3 瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 发酵乳工艺条件的优化3 3 3 3 i 单因素实验3 3 3 3 2 正交实验。3 6 3 a 瑞士乳杆菌t u s t 0 0 5 发酵乳感官评价3 7 3 4 1 单因素实验3 7 3 4 2 正交试验3 9 3 4 3 验证实验。4 0 3 4 4 放人实验。4 0 3 5 a c e 抑制的活性4 0 3 5 1 后发酵时间对a c e 抑制活性的影响4 0 3 5 2 半抑制浓度的测定。4 1 3 5 3 不同分子量蛋白肽对a c e 的抑制活性4 2 3 6 动物实验4 3 3 6 1 大鼠的体重变化曲线4 3 3 6 2 收缩压测定4 3 3 6 3 瑞士乳杆菌发酵乳及乳清对血压的影响4 4 3 6 4 瑞士乳杆菌发酵乳及乳清对心率的影响4 8 3 7 瑞士乳杆菌发酵乳理化指标的测定5 0 3 7 1 瑞士乳杆菌发酵乳蛋白质含量5 0 3 7 2 游离氨基酸的测定5 l 3 7 3 p h 的测定5 l 3 7 4 a c e 抑制活性的测定：5 l 4 结论5 2 5 展望5 3 6 参考文献5 4 7 论文发表情况5 9 8 致谢6 0 天津科技大学硕士学位论文 1前言 1 1 发酵乳的定义 发酵乳是指以牛乳为原料，添加适量的砂糖，经巴氏杀菌后，加入乳酸菌发酵剂 经保温发酵而制成的产品。从形态上看，包括凝固型酸奶和搅拌型酸奶，每一类又可 以添加水果、香精等作成各种风味的酸奶。搅拌型酸奶可进一步加工，制成冷冻酸奶、 浓缩酸奶或酸奶粉等产品【1 1 。 国际乳品协会专家组在1 9 6 7 年i d f 年会上对发酵乳下了如下定义：所谓发酵乳 是指以乳( 全脂乳、部分脱脂乳、完全脱脂乳、浓缩乳、部分脱脂乳或全脱脂乳粉还 原乳) 经均质、杀菌后，加特定微生物发酵剂制成的一类产品【2 1 。 1 2 发酵乳的发展状况 酸奶作为一种乳酸菌发酵制品，历史非常悠久。早在公元前2 0 0 年就出现了手工 制作酸奶。1 0 0 8 年德国开始建厂生产酸奶；诺贝尔奖金获得者俄国著名科学家梅 奇尼科夫在2 0 世纪初到欧洲旅游时注意到，经常饮用酸奶的巴尔干国家居民寿命较 长。因此，他提出了经常饮用酸奶可以长寿的“酸奶长寿说”，指出了发酵乳的医疗效 果。此后酸奶的名声大振，世界产量和消费量大增，很多国家都制作出了有本国特色 的酸奶和其他类型的发酵乳，生产工艺实现了机械化、自动化、连续化、产品种类繁 多，深受消费者欢迎。 我国做酸奶的历史也很悠久，后魏贾思勰著齐民要术记载了发酵乳的制作方 法嘲：牛羊乳皆得作，煎乳四五沸便止，以绢袋滤入瓦罐中。其卧酪暖入人体，熟乳 一升用香酪半勺，痛搅令敖泻，明旦乳出。这表明我国人民已经熟练的掌握了发酵乳 的基本制作过程。2 0 世纪初，我国已经开始了使用菌种的发酵乳的生产。我国在8 0 年代引进了数十条现代化的发酵乳的生产线，开始了大规模的工业化生产。特别是近 2 0 年来，发酵乳的消费在全国已经非常普及，据统计【4 】，我国的发酵乳消费量达每人 每年7k g ，全世界的发酵乳消费量也逐步提高，发酵乳消费量最高的是芬兰，每人每 年3 7 5k g ，其次是瑞典，每人每年2 7 5k g 。最常使用的发酵菌种是保加利亚乳杆菌 和嗜热链球菌。另外，具有保健功能的嗜酸菌和双歧杆菌的发酵乳亦有广泛生产。 目前，发酵乳以其制作工艺、原料的组成可分为全脂酸奶、半脱脂酸奶和脱脂酸； 据发酵生物学特性可分为普通酸奶和特殊酸奶；根据产品组织状态可分为凝固型酸奶 和搅拌型酸奶等【5 j 。 1 3 发酵乳的营养保健作用 近年来，由于酸奶的营养、保健功效不断被现代医学所揭示，致使酸奶发展迅速， 其营养保健功效主要表现在以下几个方面【2 吲： 1 3 1 营养作用 牛乳经过乳菌发酵，内含的乳糖有2 0 3 0 分解成了葡萄糖和半乳糖，进而转化 1 前言 为乳酸或其他有机酸。饮用酸奶可提高机体对磷、钙、铁的吸收，防止婴儿佝偻病， 防止老人骨质疏松病。发酵作用可使乳蛋白变成微细的凝胶乳，易于消化吸收。发酵 过程中乳酸菌还可产生b 族维生素、烟酸、叶酸等，这些都是机体营养所必需的。因 此，牛乳经过发酵之后，其营养作用有了很大的提高。 1 3 2 缓解乳糖不耐症作用 有些人体内缺少乳糖分解酶，不能对牛乳中乳糖加以分解作用，导致他们在饮用 牛乳后，出现腹胀、腹痛等不适。牛乳经发酵后，近3 3 的乳糖转化为乳酸和其他物 质，降低了乳中的乳糖含量，有效地缓解了乳糖不耐症。 1 3 3 整肠作用 t 人自母体降生后不久，肠道内就进入了许多细菌，总称为肠道菌群，包括对机体 有害的和有益的两种菌，在机体正常情况下有益菌占优势，这称为肠道菌群的平衡。 肠道菌群与机体保持共生关系，并将伴随人的一生，当平衡遭到破坏，也就是有害菌 占优势时，机体就呈现病态。而经常饮用酸奶是维持这种平衡的重要途径。酸奶的这 种功能称为整肠作用。 1 3 4 控制肠道微生物菌群的生长 乳中的主要化学物质乳酸和少量的乙酸、甲酸、苯甲酸具有抑菌作用，在某些情 况下对微生物有杀菌效果，尤其对革兰氏阴性致病菌。乳酸菌的抗菌作用还要归于它 能产生具有杀菌作用的特殊蛋白质化合物，即细菌素。 1 3 5 降低胆固醇和血氨作用 乳中的抗胆固醇因子是乳清酸、乳糖和钙，酸奶中的抗胆固醇因子增加了烃甲基 戊二酸。据h a p n e r g 报告 9 1 ，每人每餐饮用2 0 0m l 酸奶，一周后血清中的胆固醇含 量降低5 1 0 。 1 3 6 预防某些类型的癌症 人们对与癌症病原学有关的乳酸菌代谢活动有很大的兴趣，解释乳酸菌抗癌机理 主要是：减少将致癌前体物转化成致癌物有关的粪酶的含量，直接转化或消除致癌物 或前致癌物，增强宿主的免疫体系，降低血液中胆固醇的含量。 1 3 7 降血压作用 日本某大学老年病研究室，将4 0 名高血压患者分为甲、乙两组进行实验观察：甲 组每天喝1 0 0m l 酸奶，乙组每天喝1 0 0m l 普通牛奶，1 2 周后再测血压，甲组收缩 压平均下降0 6 7 0 9 3 千帕，而乙组血压几乎无变化【l 引。 1 4 酸奶发酵剂的概况 酸奶发酵剂系指为制作酸奶和乳酸菌饮料而调制的特定微生物培养物。在制作酸 奶前，必须先调制发酵剂，而酸奶发酵剂的优劣与产品质量的好坏有极为密切的关系 【4 】。因此，调制发酵剂的技术是制作酸奶的关键技术之一。以下就是酸奶发酵剂的乳 天津科技大学硕士学位论文 酸菌种类及其生理功能作详细介绍【l l 一2 1 。 1 4 1 生产发酵乳的主要乳酸菌种类 应用于发酵乳生产的微生物主要有乳酸菌、霉菌、酵母等。乳酸菌主要有乳杆菌 属、链球菌属、双歧杆菌属、乳球菌属、命串株菌属、片球菌属的种及其亚种。目前 工业化生产的菌种大约有几十种，常用的一些菌种及其主要作用见表1 1 【1 3 1 4 】。 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i u m ，l a b ) 是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大 量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸杆菌有4 4 个种，连同亚种共5 1 个种，是革兰 氏阳性、无芽孢、细长、有弯曲的杆菌。有9 个属：其中5 个属呈球状，如乳酸球菌 ( 1 a c t o c o c c u s ) 、迷走球菌( v a g o c o c c u s ) 、链球菌( s t r e p t o c o c c u s ) 、明串珠菌( 1 e u c o n o s t o c ) 和片球菌( p e d i c o c c u s ) ：4 个属呈杆状，如肉食杆菌( c a r o n o b a c t e r i u m ) 、乳酸杆菌 ( 1 a c t o b a c i l l u s ) 、双歧杆菌( b i f i d o b a c t r i u m ) 和孢子乳酸菌( s p o r o l a c t o b a c i l l u s ) 。这 些菌都和乳酸发酵有密切关系，其中人们对嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的研究比较岁”】。 表1 - 1 生产发酵乳的乳酸菌种类 t a b l el - ls t r a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i u mu s e df o ry o g u r t 乳酸菌在动物体内能发挥许多的生理功能。大量研究资料表明，乳酸菌能调节胃 肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价； 降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长；提高机体免疫力等【1 7 1 羽。 乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、细菌表面成分等物质具有生理功能【1 9 1 ， 可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、 l 前言 免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等产生作用。总之，乳酸菌的生理功能与 机体的生命活动息息相判2 0 1 。 1 4 2 乳酸菌的生理功能 1 4 2 1 改善胃肠道功能 乳酸菌是肠道常在菌。畜禽服用乳酸菌后，可以改变肠道内环境，抑制有害菌繁 殖，调整胃肠道菌群平衡。乳酸菌通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合，在肠粘膜表面 定植占位，成为生理屏障的主要组成部分，从而达到恢复宿主抵抗力，修复肠道菌群 屏障、治愈肠道疾病的作用。如果这个屏障遭到抗生素或其它因素的破坏，宿主丧失 了对外来菌的抵抗力，会使具有耐药性的肠内菌异常增殖而取代优势菌的位置，造成 肠道内微生态平衡的失调。 1 4 2 2 改善免疫能力 乳酸杆菌和双歧杆菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用，另一方面由于它能 在肠道定植，相当于天然自动免疫。它们还能刺激腹膜巨噬细胞、诱导产生干扰素、 促进细胞分裂、产生抗体及促进细胞免疫等，所以能增强机体的非特异性和特异性免 疫反应，提高机体的抗病能力。p e r g i d o n 等( 1 9 8 8 ) 报道【2 l 】，口服乳酸菌后，对巨噬 细胞的b 半乳糖甙酶活性、巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活和促进作用。当异 物侵入机体时，免疫细胞被乳酸菌激活，增强了机体对异物产生抗体的作用。c h a n d r a ( 1 9 8 4 ) 认为【2 ，乳酸菌之所以具有刺激机体产生抗体的作用，是由于菌体通过淋巴 结、粘膜和m 细胞刺激淋巴细胞，接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结( m l n ) 循环到血流中，并分布全身，从而调节机体的免疫应答1 2 l 】。 1 4 2 3 抗菌作用 研究资料表明【2 2 1 ，乳酸菌对一些腐败菌和低温细菌有较好的抑制作用。可用于防 治腹泻、下痢、肠炎、便秘和由于肠道功能紊乱引起的多种疾病以及皮肤炎症。其抗 菌机制主要表现在以下几个方面：( 1 ) 产生的乳酸等有机酸能显著降低环境p h 值和 e h ( 氧化还原电位) 值，使肠内处于酸性环境，对于致病菌如痢疾杆菌、伤寒杆菌、 副伤寒杆菌、弯曲杆菌、葡萄球菌等有拮抗作用；( 2 ) 产生的过氧化氢能够激活牛乳 中的过氧化氢酶硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌如假单 孢菌属、大肠杆菌类和沙门氏菌属等；( 3 ) 产生类似细菌素的细小蛋白质或肽类，如 各种乳酸杆菌素和双歧菌素，对葡萄球菌、梭状芽孢杆菌以及沙门氏菌和志贺氏菌有 拮抗作用【2 3 乏6 1 。 另外，双歧杆菌等还可将结合的胆酸分解为游离的胆酸，后者对细菌的抑制作用 比前者更强。 1 4 2 4 改善营养健康状况 ( 1 ) 降低胆固醇 人们对乳酸菌降低胆固醇的作用及其机理做了广泛的研究，认为乳酸菌菌体成分 或菌体外代谢物中有抗胆固醇因子。在乳酸菌产生的特殊酶系中，有降低胆固醇的酶 天津科技大学硕士学位论文 系，它们在体内可能抑制羟甲基戊二酰辅酶a ( h m g c o a ) 还原酶( 胆固醇合成的限 速酶) ，从而抑制胆固醇的合成。由于乳酸菌能在肠黏膜上黏附并定植，故能显著减 少肠道对胆固醇的吸收。乳酸菌可吸收部分胆固醇并将其转变为胆酸盐从体内排出。 g i l l i l a n d 等( 1 9 8 5 ) 实验证明鲫，嗜酸乳杆菌对胆固醇具有同化作用：r a s i e l 2 8 1 ( 1 9 9 3 ) 的研究也有同样结果：k l a v e r 等【2 8 】( 1 9 9 3 ) 研究表明乳酸菌对胆固醇具有共 沉淀作用，当p h 值低于6 0 时，由于乳酸菌的胆盐共轭活性增加，使胆固醇与胆盐 形成了沉淀，从而降低了培养基中的胆固醇含量。包惠燕 2 6 j 等研究显示，嗜热链球菌 和保加利亚乳杆菌单独和混合发酵均可以使蛋奶中胆固醇量下降1 0 左右，嗜热链球 菌比保加利亚乳杆菌的降胆固醇能力稍强。 ( 2 ) 改善血脂 乳酸菌在降低机体胆固醇的同时，可降低甘油- - f l 旨，使h d l 升高，从而达到改 善血脂的目的【l o j 。目前对乳酸菌对血脂影响的研究还不很成熟，但大量的动物试验已 表明，乳酸菌制剂发酵产生的有机酸、特殊酶系、细菌表面的成分以及乳酸在体内的 代谢能改善血脂。那淑敏等 2 9 1 认为，有机酸中的醋酸盐、丙酸盐和乳酸盐可对脂肪的 代谢进行调节，对降低血浆t c ( 总胆固醇) 和l d l ，升高h d l 起着一定的作用。 ( 3 ) 抗肿瘤作用 在肠道内的部分细菌分泌的一些酶类，如p 葡糖酶、d 葡糖苷酸酶、硝基还原酶、 偶氮还原酶、7 a 脱羟基酶等，在肠内可使前致癌物转化为致癌物。肠道菌中的乳酸 菌( 包括补充到肠道中的乳酸菌) 可通过调整肠道菌群抑制这些细菌酶的活性，达到 降低肿瘤发生的危险。乳酸菌抗癌的机理可能是乳酸菌的某些代谢产物可促进肠胃蠕 动，缩短致癌物质在肠内滞留的时间，减少致癌物质与上皮细胞的接触或者是乳酸菌 的代谢产物在肠道内膜内附植，形成不利于这些细菌酶作用的环境，抑制其活性，阻 断肠内的前致癌物向致癌物的转化。肠道内具有抗肿瘤作用的乳酸菌列于表1 - 2 2 1 。 l 前言 表l - 2 具有抗肿瘤特性的乳酸菌种类 t a b l e1 - 2s t r a i n so f l a c t ea c i db a c t e r i u mw i t ha n t i t u m o ra c t i v i t y 1 4 3 乳酸菌的生产繁殖 乳酸菌属于裂殖菌，以细胞分裂的形式繁殖w 。它在生长过程中经历四个不同的 阶段，即：缓慢期、对数生长期、稳定期和衰亡期。缓慢期时，乳酸菌的数目并不会 增加甚至可能减少，但此时细胞的代谢很旺盛，细胞体积增大也很快。经过缓慢期后， 细胞分裂急剧加速，菌数以几何级数的速度上升，进入对数生长期，此时乳酸菌的生 长繁殖特别旺盛，乳糖大量分解，产生大量的乳糖。对数期是乳酸菌发酵的黄金时期， 在实际生产中常将此时的菌种进行扩大生产，使其迅速越过缓慢期而直接进入对数生 长期，以提高生产力。对数期结束后，乳酸含量大大增加，p h 下降，部分乳酸菌开 始死亡，死亡数与繁殖数几乎相当，即进入稳定期。之后进入衰亡期，菌数明显减少 3 0 l 1 4 4 瑞士乳杆菌的简介 本研究主要研究对象为瑞士乳杆菌，乳酸杆菌属，0 6 1 0 2 0 0 6g r n ，单个核成 链，用次甲基蓝染色无异染粒l 引j 。 在众多乳酸菌中，瑞士乳杆菌具有较强的蛋白水解活性，可缩短制造时间，被广 泛用于发酵乳制品的发酵剂中，它所发酵的乳制品所含肽的浓度较高。瑞士乳杆菌不 仅是人体肠道的益生菌，而且能水解乳蛋白产生包括血管紧张素转化酶抑制肽 ( a c e i p ， a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ) 在内的多种生物活性 肽。y a m a m o t o n 等人就曾从l h e l v e t i c u sc p n 4 发酵酸奶产品中分离得到短肽【3 2 】。据 n a k a m u r ae ta 1 报道从瑞士乳杆菌和酿酒酵母发酵的酸奶中分离出带有氨基酸残基的 v p p 和i p p 两种二肽，具有a c e 抑制活性并能降低血压【3 3 4 1 。这两种肽的i c 5 0 分别 是9 洲和51 t m l 3 5 1 。日本c a l p i s 食品工业公司的山本直之队1 6 株乳酸菌所制的发酵 乳进行了将血压方面的研究，发现乳杆菌的将血压活性一般高于乳球菌和乳链球菌， 而且瑞士乳杆菌具有最强的a c e 抑制活性，在体外试验中具有最强的降血压活性【3 6 1 。 瑞士乳杆菌是一种乳酸菌，因而被广泛的应用于乳制品中，尤其是应用在瑞士干 天津科技大学硕士学位论文 酪中。瑞士乳杆菌其细胞酶能够将肽类降解为氨基酸，因而能够加速干酪的成熟和减 少干酪中苦味肽的产生。而且有研究表明，经瑞士乳杆菌发酵的酸乳及乳清，能产生 l i e - p r o p r o 和v a l p m ，m 短肽，可以缓解高血压，缓解紧张，改善脑功能，提高记 忆和学习能力【3 7 4 4 。日本研究人员以小鼠喂食瑞士乳杆菌发酵物，较对照组，血管紧 张素转化酶被抑制，提高脑苷的水平，从而证明了瑞士乳杆菌的益生作用【4 5 - 4 7 1 。 1 5 乳源生物活性肽 生物活性肽是指具有生物活性的多肽，这些多肽小到只有2 个氨基酸的双肽，也 可以达到复杂的长链或环状多肽，而其常经过糖苷化、磷酸化或酰化衍生，在细胞生 理及代谢功能的调节上具有重要的作用。经研究发现，乳酸菌经发酵的乳及孚l s j j 品不 仅能提供丰富的营养，而且还是许多生物活性肽的重要来源。主要的乳蛋白源生物活 性肽有鸦片肽、降血压肽、免疫活性肽、抗血栓和酪蛋白磷酸肽【4 列。许多肽还具有原 蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能。这些生物活性肽都以非活性状态存在于蛋白 质的长链之中，当用适当的蛋白酶水解时，它们的活性就被释放出来。研究发现人类 摄取的蛋白质大多以短肽形式消化吸收，特别是小肽( 2 7 个氨基酸，主要包括二肽 和三肽) 可被直接吸收进入循环，它和游离的氨基酸在体内有不同的输送体系。小肽 在肠道中的吸收优于游离氨基酸，转运系统具有速度快、耗能低，不易饱和，各种肽 之间转运无竞争性与抑制性等优点【4 9 l 。h a r e 等人曾研究过氨基酸的吸收强度( 含氨基 酸的吸收率和吸收速度) ，并比较了大鼠对鸡蛋蛋白酶解产物和对应的氨基酸混合物 的吸收，比氨基酸要高7 0 8 0 。另有一些报道也阐述肽链的长度对肽链的吸收有很 大的影响，肠道中只有运输二肽和三肽的运输系统，降解蛋白质为二肽和三肽后，能 被更快、更大量的吸收【5 0 1 。g r i m b l e 等试验观察n - 、三肽蛋白水解物吸收快于4 1 0 肽的水解物。 研究还发现，由于小肽被人体吸收能力大于游离氨基酸，而渗透压却小于相应的 氨基酸，作为肠道营养液可起到降血压，降胆固醇、降血糖、抗疲劳和抗氧化等生理 功效【5 l 】。 乳源生物活性肽的优势已得到国际公认，特别是短肽的发现已经成为多肽类药物 和功能性食品添加剂的丌发热点。人们已经从乳中发现并提取了具有鸦片肽、抗高血 压、抗血栓、抗菌、促进会属离子( c a 2 + ) 生物转移和免疫调节等活性的肽，其中降 血压肽是研究的一个重要方向。我国生物活性肽系列产品逐渐成为社会关注焦点【5 2 1 。 1 5 1 血管紧张素转化酶抑制肽作用机理 血管紧张素转化酶抑制肽是一些具有抑制血管紧张素转化酶( a c e ) 活性的多肽 物质，这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各有不同，但都具有类似的功能，即有降血 压的功能，所以又称为降血压肽。 血压是否正常与肾素血管紧张素系统和激肽激肽生成酶系统密切相关。肾素血 管紧张素系统是一个内在的负反馈控制系统。血管紧张素i ( a 孓i ) 本身没有升高 血压的作用，但在a c e 的作用下生成的血管紧张素i i ( a 工i i ) 是至今已知的最强的 1 前言 升血压活性肽【5 3 】。另外，生成的血管紧张素( a t m ) 对血压的作用非常微弱。原 发性高血压病人的血浆中因含有足够多的a ti i 以致使血压持久性地增高【5 4 1 。 激肽激肽生成酶系统是人体内的一种降血压系统。激肽( k i n i n s ) 是一簇具有促 血管舒张与降血压作用的活性肽，在血液中的产物为舒缓激肽( b k ) 。b k i j i 起血管舒 张与降血压的原因可能是： ( 1 ) 拮抗或抵消神经的使血管收缩因子( 苯酚胺、a ti i 、加压素等) ； ( 2 ) 干扰钙离子的释放( c a 2 + 是平滑肌收缩反应中所必需的激活剂之一) ； ( 3 ) 促发前列腺素的合成和释放，继而引发对血管的活性。 可见，肾素血管紧张素系统和激肽激肽生成酶系统是维持正常血压的一对拮抗 体系，这两个系统的平衡失调被认为是引发高血压的重要原因。a c e 在其中起了极其 重要的作用例。 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n