（发酵工程专业论文）降胆固醇菌株发酵条件的优化及降解产物的初步研究.pdf

天津商学院硕- ：学位论文摘要 降解胆固醇菌株发酵条件的优化和降解产物的初步分析 摘要 根据生长量秽簿活力蒋项指称，对嵇筛获得静1 7 株蔺化降解鞭浏醇鹣缡菌 进行比较，发现f ，1 菌株生长快，生物量大，酶活性高，因此将其作为出发菌 株谶行进步的研究。 从通气量，培游湿度，p h ，酵母膏，腿圜醇秘表蕊活性刹等方露进行举因 素的优化，随后采用响应面法对培养基的成分进一步优化，首先尉部分莺复因 子渡验对墙莠基鳃分n h 4 n 0 3 ，k 珏2 p 0 4 ，m g s 0 4 7 珏2 0 ，酵母黉，t w e e n - 8 0 和胆固醇对产酶量的影响进行了评价，并找出主要的影响因予为酵母膏和 t w e e n - 8 0 ，彝苕者为菠效应，爱者为负彩稳，箕链缀分辩酶活力麓影璃不鬟萋。 第二步用最陡爬坡路径逼j 曛最大响廊区域。最后用中心组合设计及响应面分析 确定主要彩晌因子的最佳浓度。预测菌株在伍纯培养蘩的酶活力为1 , 9 8 2 1 0 3 u m l 。 通过研究发现f 1 菌株产胆固醇降解酶最佳培莽基配方的组戚为；n h 4 n 0 3 1 0 9 1 ：k h 2 p 0 4o 2 5 9 1 ；m g s 0 4 7 h 2 0 疆2 5 9 1 ；f e s 0 4 ，7 h 2 0 l m g l ；酵堪膏 5 6 9 4 9 1 ；t w e e n 8 0o 9 0 5 m l 1 ，胆圃醇1 o g 1 。在含有6 5 m l 发酵培养液的三角瓶 ( 2 5 0 m l ) 中懿最睡发酵条箨为；p h 7 ，2 8 y ? ，发黪3 0 h 。 采用毛细管气相色谱滋比较优化前后胆固醇的降解情况，优化前将粗酶液 拥入到隧阑醇反盛体系中，糙溜静靛浓凄觚鹁6 2 5 8 变为9 6 。3 8 3 0 。毯纯震热 入酶，胆围醇的浓度变为9 2 。可以看出麓株在优化后的培养条件下，产酶量 有了很大掇高，促进了对艟固醇的降解。 关键词；耱霾醇酶解酶，优纯，晌应蘧法，气鞠题谱 型塑兰堕婴生鲎堡笙兰一一 垫茎 o p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nf o ra c h o l e s t e r o l - d e g r a d i n g b a c t e r i aa n dt h er e s e a r c ho f t h e c h o l e s t e r o l - b i o d e g r a d i n gp r o d u c t s a b s t r a c t 1 7c h o l e s t e r o l d e g r a d i n gs t r a i n ss c r e e n e d p r e l i m i n a r i l yw e r ec o m p a r e da c c o r d i n g t o h i 曲g r o w t hs p e e da n dh i g ha c t i v i t y o fc h o l e s t e r o l d e g r a d i n g e n z y m e i tw a s f o u n dt h a tf * ls t r a i ng r e wf a s t e ra n dh a d l a r g e rb i o l o g yq u a l i t ya n dh i g h e ra c t i v i t yo f c h o l e s t e r o l d e g r a d i n ge n z y m e t h a na n yo t h e r s ，s oi tw a su s e da si n i t i a ls t r a i nt ob e s t u d i e df u r t h e r e 恐c to f c h o l e s t e r o l ，y e a s te x t r a c t ，t e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp h v a l u ba n dv e n t i l a t i o n w e r ec o n d u c t e do ng r o w t hs p e e d 棚1 da c t i v i t yo fc h o l e s t e r o l d e g r a d i n g e n z y m e t h r o u g hs i n g l e 如c t o re x p e r i m e n t s r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e d t o o p t i m i z eam e d i u mf o re n z y m e s o f d e g r a d i n gc h o l e s t e r 0 1 i nt h ef i r s to p t i m i z a t i o n s t e p bi n f l u e n c eo fn h 4 n 0 3 ，t w e e n 一8 0 ，k h 2 p 0 4 ，y e a s te x t r a c t ，m g s 0 47 h 2 0 ， c h o l e s t e r o lo ne n z y m e so fd e g r a d i n gc h o l e s t e r o lw a se v a l u a t e du s i n gaf r a c t i o n a l f a c t o r i a l d e s i g n ，y e a s t e x t r a c ti n f l u e n c e d e n z y m e sp r o d u c t i o np o s i t i v e l y w h i l e t w e e n 一8 0a f f e c t e dp r o d u c t i o nn e g a t i v e l y s e c o n d l y , t h ep a t ho fs t e e p e s ta s c e n tw a s u s e dt oa p p r o a c ht h eo p t i m a lr e g i o no ft h em e d i u mc o m p o s i t ed e s i g na n dr e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i s i nt h el a s t ，t h e o p t i m i z e dm e d i u ma l l o w e dp r o d u c t i o n t ob e i n c r e a s e d t o1 9 8 2 1 0 3 u m l t h eo p t i m i z e dm e d i u mc o n s t i t u t i o n s i n c l u d i n g1 o g 1c h o l e s t e r o l ，o 。2 5 9 1 k h 2 p 0 4 o 2 5 9 1m g s 0 47 h 2 0 ，5 6 9 4 朗，y e a s te x t r a c ta n do 9 0 5 m l 1t w e e n m 8 0 ， 、酗e r ea d d e dt o6 5 m io fs t e r i l ec u l t u r em e d i u mi n2 5 0 m le r l e n m e y e rf l a s k sa n d i n c u b a t e da t2 8 i n i t i a lp h 7f o r3 0h t h ed e g r a d a t i o no fc h o l e s t e r o lw a ss t u d i e dt h r o u g hc a p i l l a r yc o l u m ng a s c h r o m a t o g r a p h y b e f o r eo p t i m i z a t i o nt h ec o n c e n t r a t i o no f c h o l e s t e r o lw a sc h a n g e d ， 天津商学院硕士学位论文摘要 f r o m9 9 6 2 5 8 t o9 6 3 8 3 0 a f t e rt h ee n z y m e sf r o mb a c t e r i a ls t m i nw e r ea d d e di n l t h es y s t e mo fc h o l e s t e r 0 1 i td e c r e a s e dt o9 2 a f t e r o p t i m i z a t i o n w ec o u l dm a k ea c o n c l u s i o nt h a tt h e p r o d u c t i o n s o f e n z y m e w e r e m a r k e d l y i n c r e a s e da f t e r o p t i m i z a t i o n ，w h i c hi nr u m f a c i l i t a t e dt h ed e g r a d a t i o no f c h o l e s t e r 0 1 k e yw o r d s ：o p t i m i z e ，c h o l e s t e r o l d e g r a d i n ge n z y m e ，r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ，g a sc h r o m a t o g r a p h y 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 1 选题背景 1 1 胆固醇与人体健康 第一章前言 胆固醇是种具有环戊烷多氢菲的2 7 碳化合物，其分子结构如图所示。在 分子结构中有a 、b 、c 和d 四个环。在a 环的c - 3 上有一个羟基，在b 环的 c 5 和c 6 之间有个双键，在d 环的c 1 7 上连有8 个碳原子的侧链，因含有羟 基故命名为固醇。胆固醇在动物脂肪和胆汁含量最多。 图1 1 胆固醇分子结构 胆固醇是人类生存所必需的，具有重要的生理功能，但在体内过量时也会造 成危害。现在与胆固醇过量有关的动脉粥状硬化、冠心病、脑中风等心脑血管疾 病，已严重威胁着人类健康。英国政府1 9 9 2 年的国家健康报告i l 】和美国国家研 究会议的建议【2 】中都提到限制饮食中的脂肪和胆固醇的摄入量的必要性。但是随 着人们生活水平的提高和膳食营养的增加，人们往往因不合理膳食。过多摄入高 脂肪、高胆固醇食品，导致血液胆固醇含量超标。为了防止心脑血管疾病的发生， 许多人不得不限制饮食，这与人们追求生活质量的提高是很不相称的。所以研究 不限制饮食、不干扰人体正常代谢、不影响食品风味、经济实用的减少胆固醇吸 收的食品及其加工方法，己成为当前重要的研究课题。 天津商学院硕士学位论文 第一一带前言 1 1 1 胆固醇在人体内的生理功能、代谢及分布 疆冠簿是人类霸动物生存联必瀑懿营莽成分，在，久髂务器官，缀绞中广泛存 在。如细胞膜、内质网、线粒体、商尔基体等膜状结构上都有胆固醇，特别是在 藏誊挚经疆织释鹭上豫中豹含薰更为丰富，邋滋胡它与藏享枣经细戆豹缀成有一定翡 关舔。胆固醇也是体内重要激素的合成原料和前体物质，它在体内经代谢可转化 为肇醇酮，进一步合成为蔽质激素、孕酮、雄性激索、雅性激素等多静类弼醇激 素。这些激索在调节糖、蛋白质、脂肪、水和电解顾的代谢，以及对应激反应和 免疫功能等多种生命活动均有重要的影响。胆固醇也是生物合成维生素d ( v d 3 ) 斡髓体憋质，两又在人体锱磷代谢救调节、维持神疑系统黪正常机能等方藤发挥 重要作用f 3 , 4 1 。 在入钵蠹存在一个复杂豹糖露簿合成弋滋调节撬裁。入长麓不食瑶艟瓣醇， 检测其器官组织和血液，胆固醇的宙量并不低，且粪便中仍不断排除胆固醐的代 谢产物( 粪凝醇、粪甾酮、躯酸羹簿) ，这整都说鞫箨围醇词菇在俸内合袋。逶 过同位素示踪实验融确定乙酰辅酶a 是合成胆固醇的原料，且3 一羟基一3 甲基戊 二酰c o a 鼹箕合域的限遮酶，人体对胆圈醇的合成速度也主要受此酶的调节。 一个健康成年人的斑液中约含有t 0 0 1 2 0 9 胆固醇，其中约2 岛是由肝脏、小肠壁 等器官自身合成，遗部分称为内源性胆周酶 另外约l 3 则由食品中获取，称为 癸源性疆潮释。疆矮醇不仅在体痰转化为类国酵物质，旦墩不凝有少量转健甥接 出体外。胆固从肝脏随胆汁或通过肠粘膜进入肠道后，大部分被重新吸收，j 、部分 爵逡接或被耪缨蘩逐嚣藏粪甾酵、粪甾藜等蘧粪馁瓣爨。 1 1 2 盘液勰圈醇过量的危害 正常成年人血中的腮固酵含曩变化较大，一般在 2 8 2 ，5 9 5 r e t o o l l ( 1 t 0 2 3 0 m g ) ，根据数年i n 内调查和参考阐外资料，研究人员已 经援迄我瞪离盎l 器痰的绞标准1 3 】：血渍腮固醇( 鞭) 6 ，5 m n o t l ( 2 5 0 m g ) ；甘 油三脂( t g ) 7 2 ，2 n m o l l ( 2 0 0r a g ) ；低街度胎蛋白( l d l c ) 4 1 6 n m o l l ( i 6 0 0 m g ) ：骞蜜震鼹蛋盎( f t d l e 步0 。9 i n m o l l ( 3 5 m g ) ，符合以主任蠢一 项糟即可诊断为高脂血症蕻中当_ l 衄清胆固醇( t c ) 6 5 n m o l l ( 2 5 0 m g ) g 1 称为 离麓图醇巍症。流行病学蕊察结慕澄肯定，商疆霞簿是弓| 怒动繇粥释硬纯帮冠心 天津商学院硕士学位论文第一章前言 病最主要的危险因素之一，而发生动脉粥样硬化最主要的危险因素是l d l 一胆固 醇复合物的含量增加。 尽管血清胆固醇含量的增高受体内胆固醇合成、代谢、疾病、遗传等多种因 素的影响，但是实验和统计资料 4 , 5 1 也表明：饮食中胆固醇与心脑j 血管疾病的发 生有一定的联系。动物实验和流行病实验研究也证明减少膳食胆固醇、总脂肪和 饱和脂肪酸的摄入量是降低血胆固醇水平的一种有效方法。但是许多高营养的动 物性食品( 肉类、牛奶、蛋黄、动物的脑心肝肾等脏器) 都含有较高的n - n 醇1 6 ”。 如肥猪肉、猪心、猪肝、猪脑、肥牛肉、牛乳、鸡肉、鸡蛋、鱿鱼和鲤鱼的胆固 醇分别为1 0 7 、2 1 0 、3 6 8 、3 1 0 0 、1 9 4 、1 3 、1 4 9 、7 7 3 、2 6 5 和1 3 2 m g 1 0 0 9 。因 此，研究减少食品胆固醇吸收，降低血液中l d l 一胆固醇浓度的方法也愈显重要。 1 1 3 调节人体血清胆固醇含量，减少食品胆固醇吸收的技术研究进展 在调节人体血清胆周醇含量，肪止高胆固醇l n l 症的防治对策上，也进行了大 量的研究，概括起来主要有五种方法：( 1 ) 通过药物阻断自体合成：( 2 ) 抑制小 肠对胆盐的再吸收；( 3 ) 限制食用胆固醇含量高的食物，或是食用豆圃醇、谷固 醇、菜固醇含量高的食物，以竞争性抑制人体对食物胆固醇的吸收；( 4 ) 用物理、 化学方法去除食品原料中的胆固醇；( 5 ) 用微生物或微生物酶转化食品中的胆固 醇，即利用生物转化法处理食品。 利用物理、化学方法处理食品，降低其胆固醇的含量已有一些报道【8 4 6 。如 6 环状糊精吸附包合、食用油和溶剂提取、分子蒸馏、真空蒸馏、电渗析、c 0 2 超临界萃取、琥珀酸酐或皂角苷化学处理等等。但这些方法都存在一定的缺点， 例如，环糊精在许多国家不是合法的食品添加剂，必须要用酶分解残余的环糊精， 且该法成本较高；有机溶剂法所用溶剂会残留在油中；蒸汽法对设备的要求太高； c 0 2 超临界萃耿法的投资太大；分子蒸馏很难实现工业化等等。并且这些方法在 转移胆固醇的同时也影响食品风味或营养成分。所以利用可降解胆固醇的微生物 或其酶处理食品，近年来受到广泛的重视。 1 2 微生物降解胆固醇机制的探讨 天津商学院硕士学位论文第一章前言 能够降解胆固醇的微生物种类很多，目前报道【1 7 - 3 1 】的主要有：诺卡氏菌属 ( n o c a r d i a e y t h r o p o l 括，n r h o d o c h r o u s ) 、 链霉菌属( s t r p t o n m y c e s l 加i d a n s ；x h y g r o s c o p i c u s ) 、红球菌属( r h o d o c o c c u se q u # r e r y t h r o p o l i s ) 、短杆菌属 ( b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m ) 、棒状杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u ms p p ) 、节杆菌属 叫r t h r o b a c t e rs i m p l e x ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 、芽孢杆菌( b a c i l l u s s p p ) 等。这些菌株都可以产生较高活性的胆固醇氧化酶， 能将胆固醇( 2 7 。c ) 完全分解成c 0 2 和h 2 0 ，分解途径中的多种中间产物已被分离鉴定，某些反应 机制也基本清楚。其中胆固醇氧化酶( 3 1 3 一羟基类固醇脱氢酶) 氧化生成的胆甾 4 烯3 酮可能是关键的前期中间产物，而产生的2 2 c 羧酸可能是侧链降解的关 键步骤，进而转化为1 7 一类固醇酮、雄甾4 一烯- 3 ，1 7 一二酮( a d ) 、雄甾1 ，4 - 二 烯3 ，1 7 二酮( a d d ) 等。但目前微生物降解胆固醇的具体途径并不足十分清 楚。 胆固醇+ 0 2胆固醇氧化酶胆甾一4 一烯3 酮十h 2 0 2 胆固醇是v d 的前体，已发现某些固氮菌0 2 ( a z o t o b a c t e rs p p ) 和啤酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的类固醇营养缺陷型突变株可产生7 脱氢胆固醇氧 化酶，将胆固醇转化为7 一脱氢胆固醇，进而经一步光反应直接转化为维生索 d ( v d 3 ) 。微生物将食品中多余的胆固醇转化为人体需要的v d 3 这条代谢途径有 重要的应用前景。 胆固醇7 脱氢胆固醇氧化酶7 脱氢胆固醇 紫外光、日光v d 3 o w e n 3 3 研究了假单胞菌n c i b l 0 5 9 0 在有氧条件下胆固醇的降解，分离出十 多种中间产物并在此基础上提出胆固醇侧链降解的假设途径。实验证明 p s e u d o m o n 6 1 ss p n c i b l 0 5 9 0 降解胆固醇的第一步反应即3 b - 羟基类固醇脱氢酶 氧化亦是限速步骤，并要求f a d + 作氢受体，这与n o c a r h ，s p p 和a r t h o b a c t e r m 3 5 1 等由胆固醇氧化酶催化，要求n a d ( p ) + 作氢受体不同，尽管它们的产物都为胆甾一4 一 烯3 酮。 4 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 n a d ( p )n a d ( p ) h + h + 02差2g睦 胆嘲醇! l 兰薹于胆鼯5 烯，3 酮3 b 羟基类固醇脱氯酶胆甾4 一烯，3 酮 f a d + f a d h 2 1 0 2h 2 0 2 胆嘲醇翼k 么 腮甾一5 一烯3 酿 蝗里矍墨些箩腮箔- 4 - 烯- 3 酮 以上几神反应是好氧微生物以0 2l 乍为电子受体，在线粒体单娥氧化酶系统 进行，包括细胞色素cp - 4 5 0 和n a d p 一细胞色素cp - 4 5 0 还原酶的参与。t t y l e m o n p b 3 6 1 等发凌拣严接获氧缨蘧一7 2 c 幻l ，戆以疆辫藜麓瞧一碳潺鞠毫孑拱薅生 长繁殖，肠道中降解胆固醇的厌氧微生物可能属于此类，其机制不详。这些都说 鞠徽生物辩疆霾醇豹簿解途径孬施有多静。 1 3 胆固醇氧化酶的研究现状与迸展 胆固醇氧化酶( c h o l e s t e r o lo x i d a s ee c i 1 3 6 ，简写为c o d ) 可氧化降解胆 固醇及其同系物，被广泛用于检测赢清、食品和其他临床样品中胆阉醇含擞；在 化举合成中催化类豳醇激豢蘸体物质的生成；用予缨菌鉴定| 3 ”；还可以通过转基 因技术，用来培育抗棉铃虫植物【38 1 ，是一种具有很大商业价值的酶。 瑟蔻襄晶纯黪c o d 主簧有亵耱主要戆形式。一秘为擎体形式，分子_ 鬟终为 6 5 k d a ，通过电泳和凝胶过滤两种方式检测，这种类型约占3 0 。弼一种为多聚 体形式，采羯凝胶遥滤方式检溺，约占4 5 f 3 9 。尽管藤舞兢魏雨鹃c o d 酌分离 提取都存在一定的困难，但是目前检测胆潮醇含量的商业化试齐u 盒中的c o d 仍 来源于微生物，c o d 的价格相对较高，主袋由于来源于徽激物的c o d 的产量较 低和商业化的培养蒸中需要加入胆固醇去诱导或增加产量【4 ”。 1 3 。1 不月泉源c o d 戆物爨拣矮 胡军磐人采用枯红诺卡氏菌( n o c a r d i ar h o d o c h r o u s ) 发酵生产c o d ，酶活 天津商学院颀= _ ：学位论文 第章葡荫 力最褰露达4 8 7 。5 u l 。拐步簿氆猿红褒卡氏蓥( n c i b1 0 5 4 4 ) 蕊拣较有潜力懿 c o d 生产菌【4 2 】。c h e e t h a m 等4 3 , 4 4 】发现改变p h 成离子强度并不能提纯c o d ，而 髑t r i o n - 1 0 0 、蘸蛋自酶绒低浓痰弱磷酸缓冲液麓撵纯该酶，摄纯后的c o d 常戳 混合胶柬的形式存在，对这三种不同提纯方式得到的酶进行研究后发现，在酶的 一般性质和功能方面都蕊本相似，僵在水相介质中的可溶性存在差异。 r h o d o c o c c u ss p + g k i 墓拣嬲c o d 分为胞外和膜结合弼静形式，被归为“栖 状内在膜蛋白”类，k r e i t 等对上述两种形式的酶做了研究，发现它们在底物 特异蛙方嚣是相似魏，键在下列三方西表瑗窭鼓著翡蓑潮1 4 5 1 ：两秘黪郯有合 适的p h 区域，但膜结合酶的范围更广膜结合酶具有更强的疏水性凝胶过滤 数据表鞘貘结合酶静分子量较大，撵鞭膜结台酶稻稳辨戆蕊分子量分弱是8 e k d a 和4 0k o a 。r h o d o c o c c u se q u in o 2 3 最初是由w a t a n a b a 和a d a c h i 4 6 】从黄油 中分离出来，由于萁较商的c o d 产夔被认为是一棘其有商业潜力的菌株。 w a t a n a b a 等人提纯了该菌株的c o d 并对其性质做了研究，发现其分子量为 5 6 k d a ，在5 04 c 高温时c o d 活力稳定，在含疏基的试踟中，酶活力受铷抑制。 j o h n s o n 等从r h o d o c o c c u se q u ia t c c3 3 7 0 6 分离出c o d ，发现该酶枣膜结会 和胞外分泌两种形式。当p h 6 0 - 8 0 ，4 0 时，两者均商较高的酶活力，其中膜 缝合c o d 麓最逶p h 蔻8 0 。 法幼华和苏起恒筛选到一株产c o d 活力较强的节杆菌( a r t h r o b a c t e r s p ) ， 该菌株不需疆露蒋诱导黼可产生大量豹稔步 c o d ，并发现魏酶及瘟静最逶p 为 8 5 ，最邂温度为5 5 。c 。对上述节杆菌8 2 ( a r t h r o b a c t e r8 2 ) 的产酶条件研究厨 发现，该菌株在含有丰富的有机氮培养基中生长三天，产酶活力可超避6 0 0 u l ， 獒中分泌至跑夕 的酶活力约占憨酶活力姻6 0 ，除去上溥液的细胞，经t r i t o n x 1 0 0 处理后可得到的胞内c o d 活力卤总酶活力的1 0 4 9 1 。 1 9 7 3 年u w a j i m a 等人p 0 】洋缀磅究了寒滚予b r e v i b a c t e r i u ms t e r o t i c u m 静 c o d ，发现该酶的分子蹙为3 2 5 k d a ，程p h7 5 ，酶活性最高，且在o 1 m 的磷 酸缓冲滚( p h 7 转) 中，袋大酶活力毒保持3 0 分锌，蓬一释稳定淫较裹豹c o d 。 u w a j i m a 等人【5 0 1 发现，该酶含谢黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 辅基，1 0 0 。c 高温 处理3 分铈后，辅基会被释放浅来。除了银和汞的他台秘井，金耩离子鞠螯台裁 ( 除银和汞化合物外) 一般无抑制性，但在谷胱甘肽存在的条件下，银和汞化合物 天津商学院硕士学位论文第。章前言 的影响可忽略不计。1 9 7 6 年t o m i o k a 等人【5 1j 首先对s t r e p t o m y c e s s p 做了全面的 研究，对来源于s t r e p t o m y c e sv i o l a s c e n s 的c o d 的性质总结如下：分子量为3 0 k d a ， 分子中无黄素或血红素基团：在不同反应体系中酶反应的k m 值范围为4 5 6 7 1 0 。4 m ，电子受体的添加对胆固醇的氧化速率没有影响；最适作用的p h 为7 0 ， 最适温度为5 0 ，8 0 时大部分酶活力损失。 n i s h i y a 等人已从s t r e p t o m y c e ss p 菌株得到热稳定性较高的c o d ，通过 对目的d n a 前面片段进行休外随机诱变，得到热稳定性较高突变株，3 7 时突 变株的酶活力( 最高为8 6 6u r a g ) 远高于野生型菌株( 6 7 7u m g ) ，在5 0 。c ， 5 5 和6 0 。c 时，突变株比野生型更稳定。四种突变株的半衰期( 分钟) 分别为： 1 1 3 ( s 1 0 3 t ) 、1 2 2 ( v 1 2 1 a ) 、1 1 0 ( r 1 3 5 h ) 、2 4 1 ( v 1 4 5 e ) ，而野生型仅为7 8 分钟， 5 0 。c 条件下保温1 6 h 后，四株突变株仍具有酶活力，而野生型没有。 b u r k h o l d e r i 口c e p a c i a s t r a i ns t - 2 0 0 5 3 1 能产生性质稳定的胞外酶，在含有缓冲 液和有机溶剂的两相反应体系中性质稳定，以溶解在有机溶剂中的胆固醇为底物 时，有较高的酶活力。该酶能将胆固醇氧化为6 1 3 ，过氧羟基胆甾4 烯一3 酮，同 时消耗2 摩尔0 2 ，生成l 摩尔h 2 0 2 ，而不是绝大多数c o d 氧化胆固醇时生成胆 甾4 稀3 酮。编码c o d 的结构基因已经被克隆和测序。翻译后的主要产物预测 为5 8 2 氨基酸残基。成熟产物由5 3 9 个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基之前是 由4 3 个氨基酸残基组成的信号序列。 来自p s e u d o m o h a ss p 5 4 l 的c o d 分子量约为5 6 k d a 。在1 0 0 m m 磷酸钾缓 冲液中测定酶活力，发现酶活力最大的反应条件为p h7 0 ，3 7 c 。当p h 为5 7 之间时，酶活力约减少到p h 为7 0 时的1 3 。f r a n kc h e i l l a n 等1 5 5 j 从p s e u d o m o n a s ( s i 肿ac h e m i c a lc o ，s t l o u i s ，m o ，u s a ) 中获得c o d 并对其分子性质进行 了研究。对该酶的氨基酸序列分析发现，酸性氨基酸的数目高于碱性氨基酸的数 目，谷氨酸和天冬氨酸的比例较高。该酶的等电点在5 5 5 之间，k 。值为2 5 l o 巧m 。反应体系中胆汁盐的存在对k 。值没有影响，胆汁盐并没有改变c o d 对 胆固醇的亲和性。动力学研究表明，酶促反应在含胆盐的体系中比在血清中更快 一牡。 1 3 2 重组酶的研究现状 哭津商攀靛硬圭学位论文 辩章翦鑫 g a d d a 等人对寒巍s t r e p t o m y c e s ，h y g r o s c o p i c u s 鹤c o d ( 麓霉为s c o ) 秘 最初来自b r e v i b a c t e r i u m s t e r o l i c u m 但在e c o l i 中表达的重组酶( 简写为b c o ) 鑫冬耱褒馁蒺骰了详缯懿毙较。发淡两者秘为擎毒零，分子餐约兔5 5 k d a ，静 壬 鲞在 4 4 5 1 之间，照酸性，两者的辅基鼠有相似的光谱性质( 在3 7 0 3 9 0 n m 和 4 4 0 4 7 0 n m 处有峰值) ，进行酶髓反瘟时鄱隧f a d 为辅基。由于s c o 与f a d 怒 非共价缕合，而b c o 则是黄素通过8 组氨酸f a d 残熬与蛋白质主链结合，所 以在许多方面又表现出较大的藏别。 2 0 0 t 年，d o u k y u 和a o n o 5 7 1 将b u r k h o l d e r i a c e p a c i as t r a i ns t - 2 0 0 产生的c o d 基因在e c o i l 中表达后，对在( 外) 周质部位产生的c o d 进行纯化，并对该爨 缝酶懿拣矮与强转亵鼗纯麴c o d ( b r e ：b r e v i b a c t e r i u m 带；p s e ：p s e u d o m o n a ss p n e r ：n o c a r d i ae r y t h r o p o l & ：s t r ：s t r e p t o m y c e ss p ) 做了比较。首先比较了不同溶剂 一fc o d 鹃稳定性，发褒在丙酮存在静祭俘下，3 7 y 3 壤莽1 2 h 纛，重组释没夺潘 性。然而在3 h 内测定酶活力时，重组酶仍然保持7 0 的活力。添加丙酮或异丙 阵后，所有商业化的c o d 都完全失活。加入异蕊醇或了醇后。遴组酶部分失活， 加入乙慕乙酸鼓，氯仿，苯，甲攀等，熬缀酶的酶活几乎不损失。添加乙基乙酸 盐和丁醇后，b r e 和s t r 的c o d 酶活力全部失活，p s e 和n e r 部分失活。当溶剂 豹l o g p o w ( p o w ：_ 正睾醇毒曩承之闽毒枫溶劐豹分配系数) 夔在4 。l 以l 耐，测 试的所肖c o d 均无明显的失活。由此可以推断：在有机溶剂存在的条件下，被 灞试瓣黪中，繁缠酶燕羧稳定韵。 1 3 3c 0 1 ) 结构靛研究璇狡 v r i e l i n k 等人详细的描述了来自且s t e r o l i c u m 的c o d 在未与底物结合【58 】和 结合 5 9 1 两种情况下的晶体结构。在自由状态下，利用同晶置换法测定晶体结构并 精确到1 。8 a 。分离度。该模型包捂4 9 2 个氮基酸残基，f a d 辕綦和4 5 3 个溶剂分 子。通过x 射线分析，麒有两个环，分别由7 8 ，8 7 残基和4 3 3 4 3 6 残基组成，这 嚣令琢链子活犍中心虽蠢零i 予酶与残物瓣结台，推测这烂强是开放熬，在貘及蛋 白的位点形成一条疏水通道，从而将胆嘲醇底物与水相分离开。该晶体结构有两 个结稳域：f a d 结合缭褥蠛和类闻醇络台结鞫竣。f a d 绥台缭褐城惫捂三个不 连续序列片段：n 末端，c 末端，以及夹在4 链b 折撼和3 链a 螺旋之间的6 天津商学院硕士学位论文第一章前言 链0 一折叠。这个结构域整个的拓扑结构与其他f a d 结合的蛋白质十分的相似。 类固醇结合结构域包括2 个不连续的序列片段和6 链反向平行b 一折叠。活性中 心位于两结构域的界面。活性位点的沟槽里充满了排列整齐的1 3 个溶剂分子的 晶格。f a d 的黄素环体系位于沟槽的底部，其中n 一5 露在外面。黄索环体系平 面构象发生约1 7 。的弯衄，使蛋白质和f a d 的嘧啶环有氢键的作用。黄素环体 系中靠近苯环的活性位点的氨基酸残基大部分是疏水的，而在靠近嘧啶环的相反 一边更多的为亲水性的。 虽然沟槽位于蛋白质分子的里面，但是在分子表面的三个疏水环显示出相对 较高的温度因子，这说明可弯曲区域可能形成一条底物进入沟槽内的通道。活性 位点的沟槽包括一个带电荷的残基g l u 3 6 1 ，侧链电子密度表明侧链有较高的迁 移率，这个残基可能在异构化步骤中作为质子受体。 y u e 和k a s s 等 6 0 】对来自s t r e p t o m y c e s 同源菌的c o d 的三维结构做了研究， 发现与b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m 结构相比，在环区域有明显的构象上的不同。在 7 8 8 7 残基组成的环区域可接纳两亲性螺旋转角，一个疏水残基指向活性中心的 沟槽，另一个疏水残基指向分子外表面。同时还对三个活性位点突变体做了研究， 其中h i s 4 4 7 a s n 和h i s 4 4 7 g l n 的氧化性有所减弱，g l u 3 6 1 g l n 的异构化作用减弱。 以上从c o d 的物理性质，结构和重组酶等几个方面综述了近年来国内外对 c o d 研究的重要进展，可以看出，国外对这种酶的研究较多，也比较深入，主 要集中在它的物理性质，结构等方面，但关于它的基因表达和调控方面的研究还 不多，由于常规的诱导处理很难大幅度提高酶的产量，要想实现工业化生产，采 用现代生物技术一基因克隆来高效表达酶基因从而获得高产菌株，是一个较好的 途径，因此需要进一步展开更广泛的研究，为将来的基因育种工作和使其应用于 医药、食品、环保等领域提供理论依据。 1 4 微生物转化食品中胆固醇的研究进展 胆固醇在体内主要以脂蛋白( l d l 一胆固醇等) 的形式存在。从胆固醇的分 子结构可以看出3 - o h 是分子的活性基团，去除此基团，即可避免胆固醇与衄液 9 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 中有机酸形成脂，而沉积于心血管壁造成各种危害。利用微生物及其产生的胆固 醇氧化酶( c o x ) 或n a d ( p ) 一c d h 处理，都可改变3 - o h 结构，容易达到此 目的。近年来用微生物发酵或c o x 等处理，降低牛奶和其他富含胆固醇食品的 胆固醇含量，以及c o x 基因和脂酶基因在食品工业常用菌株的克隆表达引起人 们的极大兴趣。这些酶类在食品和血清总胆固醇的快速检测中也得到广泛应用。 1 4 1 将微生物菌体直接培养在食品中，同化降解其中的胆固醇 乳、肉、蛋及其制品等是良好的蛋白质、维生素、磷脂、微量元素及其它活 性物质的食品加工原料或营养来源，但是由于其中的胆固醇含量高( 如蛋黄中约 含2 5 0 m g 个) ，也不得不限制其食用。若采用合理的发酵工艺方法既可以制造 出风味独特的发酵食品，也可以降低其中的胆固醇含量。 19 8 8 年日本a i h a r a 6 1 城把从黄油中分离的r h o d o c o c c u se q u i 菌株接种在鸡 蛋蛋黄中做降解胆固醇的实验，效果显著，并证明没有累积酶解中间产物。1 9 9 8 年g h a l e b 6 2 用两歧双歧杆菌按传统方法制作酸乳，5 贮藏6 天后胆固醇从 2 0 3 7 m g l o o g 降至1 6 8 3 m g 1 0 0 9 ，降低了1 7 3 1 。 张佳程 6 3 1 等报道他们筛选出3 株可同化食品基质( 奶油) 中胆固醇4 5 以上的 乳酸菌菌株，并且认为嗜酸乳杆菌同化胆固醇的能力较强，这些乳酸菌可用于酸 性奶油、酸奶、蛋黄奶以及发酵香肠等发酵食品。w a t a n a b e l 6 4 1 等从奶油、猪油、 鸡油和培根等动物性食品中分离出几株红球菌( r h o d o c o c c u s ) ，其中r e q u i n o 2 3 培养于加有蛋黄的培养基中，培养3 天后蛋黄中的胆固醇降低了7 0 ，经 薄层色谱扫描分析，认为产物中有少量的胆甾4 一烯一3 酮，并无其他产物的积累。 最近有关文献先后报道胆甾一4 烯一3 酮有预防治疗肝病和抗肥胖的作用【6 5 。江南 大学吕陈峰等6 6 1 用实验室保存的b r r e v i b a c t e r i u ms p 菌株转化蛋黄中胆固醇，发 现蛋黄中的一般成分在处理前后变化不大，但脂类降低了3 5 4 。经薄层层析测 定氧化产物，发现只有单一产物胆甾一4 一烯一3 酮。 中国农业大学牛天贵6 7 1 等从北京动物园食肉动物的肠道中，分离和筛选出一 株胞外胆固醇酶活力较高的细菌t 1 2 1 ，经鉴定为好气性芽孢杆菌。用发酵后离 心的上清液降低蛋黄中的胆固醇，作用显著，经动物实验，t 1 2 一l 菌株在食品中 的应用安全，无毒。 o 天津商学院硕士学位论文 第一章前言 另外，在直接利用微生物转化降低食品胆固醇时还应注意胆固醇转化产物的 复杂性和安全性，因为尽管许多微生物代谢胆固醇的最终产物为c o ：和h 2 0 ， 但是在其降解途径中也产生一些中间有机物质，这些产物对人体健康的作用还未 确定，甚至还有争议。例如，利用杆菌属细菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 在2 5 发酵蛋 黄，培养5 天和8 天后，蛋黄胆固醇分别降低了3 2 9 和4 9 6 。胆固醇氧化后 的产物经鉴定主要为：7 8 一羟基胆固醇、胆三醇、7a 一羟基胆固醇和2 5 一羟基胆 固醇( 6 8 】。可见，发酵过程中，蛋黄胆固醇被氧化的产物并不是单一的，而且这些 复杂的氧化物对人体健康的危害可能比胆固醇还耍大。因此微生物直接用于降低 食品胆固醇时，在菌种的选择上要慎重，同时要做动物实验，检测是否符合食品 安全的相关指标。 1 4 2 将微生物产生的胆固醇氧化酶、还原酶等分离纯化后再应用于食品 胆固醇氧化酶有一些是胞内酶，如诺卡氏菌( n o c a r d i ae r y t h r o p h 越n e ) ，而 有一些是胞外酶，如链霉菌( s t r p t o n m y c e sv i o l a s c e n s ) 、短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m s t e r o l i c u m ) 和轮枝链霉菌( s t r e p t o v e r t i c i l l i u mc h o l e s t e r o l i c u m ) 等。在分离纯化 时也采用不同的方法。 c h r i s t o d o u l o u 等报道了利用从诺卡氏菌( n o c a r d i ae r y t h r o p h 坦n e ) 、链霉菌 ( s t r e p t o m y c e ss p ，s s ) 、短杆菌( b e v i b a c t e r i u ms p b s ) 和假单菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ，p f ) 分离纯化的胆固醇氧化酶可以迅速降低蛋黄中的胆固醇。经研究 测定，这四种酶降低蛋黄胆固醇的能力为p f n e s s b s ；其中p f 酶在4 下4 8 h 后可使蛋黄胆固醇降低6 4 9 。在3 7 。c 小i 这四种酶降解胆固醇的反应开始阶段遵 循一级反应动力学：而且胆固醇降低主要发生在开始的1 2 h 。而转化产物只有胆 甾4 烯3 酮。 乳中胆固醇的含量约为1 4 0 m g k g ，其中7 5 在脂肪球内部，1 0 存在于脂肪 球膜，另外1 5 存在于乳浆中。s m i t h l 6 9 l 等比较了荧光假单孢菌但f u o r e s c e n 曲、 红球菌( r h o d o c o c c u s ) 和链霉菌( s t r p t o m y c o s ) 的胆固醇氧化酶处理牛奶的效 果，认为假单孢菌的氧化酶活性更好，且胆固醇降低主要发生在前1 2 h ，而转化 产物只有胆甾4 烯3 酮。江正强等用商品化的胆固醇氧化酶( c o x ) 脱除猪油 中胆固醇，在氧化酶的用量为0 0 1 u g 猪油，4 h 后猪油中总胆固醇脱除率约为 天津商学院硕十学位论文第一章前占 6 0 6 。 乳肉蛋等食品中的胆固醇大多以结合状态的脂蛋白颗粒存在，颗粒表面覆盖 _ 着磷脂、糖蛋白以及胆固醇。单独应用胆固醇氧化酶( 还原酶) ，可能不如将胆 固醇氧化酶( 还原酶) 和脂酶共同使用效果更佳。a i l h a r a 等检测了红球菌n o 2 3 发酵液，在发酵液中检测到较高的胆固醇氧化酶活性和脂酶活性，但未捡测到蛋 白酶活力。并用此粗酶液转化蛋黄中的低密脂蛋白中的胆固醇，结果表明胆固醇 氧化酶和脂酶共存可促进胆固醇的转化作用。j o h n s o n 等将红球菌n o 2 1 7 和 n o 3 3 7 0 6 的菌体发酵液，经超声波处理的上清液转化蛋黄，使其中的胆圃醇降