（微生物学专业论文）香菇子实体发育相关基因的克隆及分析.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及在用授权书燃y 1 黝7 燃9 9 8 9 8 纺 学位论文 奄 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究z - 作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究蝴：力 毪噜咿卅。年月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 黼张磅2 鲁孙签巧之娼 柳轧巾年6 月7 日 柳期：讪年6 月7 日 香菇予实体发育相关基闪的克降及分析 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 前言1 1 1 香菇概述1 1 2 香菇子实体形成机理相关研究2 1 2 1 香菇的生活史2 1 2 2 香菇子实体形成的环境因素2 1 2 3 香菇子实体形成的遗传因素4 1 3m r n a 差异显示技术及其研究概况5 1 3 1m r n a 差异显示技术的原理及步骤5 1 3 2m r n a 差异显示技术的优缺点6 1 3 3m r n a 差异显示技术的改进方法7 1 3 4m r n a 差异显示技术的衍生技术。7 1 3 5m r n a 差异显示技术在食用菌领域的运用。8 i 4 研究的目的与意义9 2 材料和方法。二1 0 2 1 试验材料1 0 2 1 1 供试菌株10 2 1 2 供试培养基1o 2 1 3 供试试剂1o 2 1 4 主要仪器与设备1 4 2 2 试验方法。1 4 2 2 1 香菇球形子实体菌株第一次出菇试验1 4 2 2 2 香菇球形子实体菌株组织分离及第二次出菇试验1 4 2 2 3 香菇球形子实体菌株的菌丝培养及取样保存1 5 2 2 4 总r n a 的提取及检测1 5 2 2 5c d n a 第一链的合成1 7 2 2 6 差异显示p c r 反应l7 2 2 7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 18 2 2 8 差异片段的回收及二次扩增19 2 2 9p c r 产物的凝胶回收19 华中农业大学2 0 1 0 届硕十学位论文 2 2 1 0 反向n o r t h e r n 点杂交2 0 2 2 1 1 阳性差异片段的克隆2 1 2 2 1 2 序列分析比较2 3 3 结果与分析2 4 3 1 香菇球形子实体菌株出菇结果2 4 3 2 总r n a 的提取及检测结果2 5 3 2 1 总r n a 的提取2 5 3 2 2e d n a 的合成2 6 3 3d d r t - p c r 及差异条带的获得2 7 3 3 1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果2 7 3 3 2 差异条带的回收及二次扩增2 8 3 4 反向n o r t h e r n 点杂交2 9 3 5 克隆阳性差异片段3 0 3 6 差异片段的测序与分析3 2 4 讨 仑3 5 4 1 试验材料的选择3 5 4 2d d r t - p c r 过程中些问题的探讨3 5 4 2 1 总r n a 的提取及反转录3 5 4 2 2 引物组合的筛选3 6 4 2 3 差异片段的克隆及检测3 6 4 2 4 关于差异片段真假阳性的鉴定3 6 4 3 差异片段与香菇球形子实体子实体发育的关系3 7 4 3 1 蓝光受体基因3 7 4 3 2 蛋白质加工相关基因3 8 4 3 3 代谢相关基因3 9 4 3 4 抗逆相关蛋白3 9 4 3 5 未知功能序列4 0 4 4 展望4 0 参考文献4 2 致谢4 8 附录测序结果4 9 香菇子实体发育相关基因的克降及分析 摘要 香菇( l e n t i n u l ae d o d e s ) 子实体的形成是香菇整个生活史中最复杂也是最重要 的发育过程，需要环境、遗传、生理等多个因素相互作用。研究子实体发育相关基 因一直是食用菌领域中个重要的研究内容。正常的香菇子实体分化形成菌盖、菌褶 和菌柄。 香菇球形子实体是在湖北省随县三里岗镇发现的香菇正常子实体中的变异类 型，整个子实体成球形，菌盖不开伞，菌柄不伸长，菌褶未见分化。经过组织分离 获得纯培养菌种，进行再次栽培试验，仍然长出球形子实体。本试验以子实体为球 形的香菇菌株为材料，利用d d r t - p c r 技术克隆及分析了该菌株在菌丝、原基、子 实体三个阶段基因。试验采用3 条锚定引物和2 6 条随机引物进行p c r 扩增，其中 只有1 4 条随机引物可以扩增出重复性好、数量多且清晰地条带，扩增结果以p a 和 p c 为锚定引物反转录获得的c d n a 模板最好。得到稳定的差异条带4 1 条，经过反 向n o r t h e r n 点杂交验证出阳性差异片段1 7 条，假阳性率为5 8 5 4 。克隆测序后在 g e n b a n k 数据库中进行b l a s t 同源分析，1 7 条差异片段中有7 条片段与已知的基 因序列和蛋白序列具有较高的相似性。 差异片段g p 2 0 - 5 4 0 与香菇l e p h r a 基因a b 2 7 9 6 3 0 1 具有9 8 的相似性，推测其 可能是编码蓝光受体a 的基因，参与类胡萝卜素的生成、生物钟的重设等功能；差 异片段a p l o 3 0 2 编码的蛋白与泉古菌( u n c u l t u r e d c r e n a r c h a e o t e ) 4 5 一h 1 2 归位内切酶 i - a p e l i 具有3 8 的相似性，推测其可能和蛋白质剪接相关；差异片段c p l 6 - 3 2 4 编 码的蛋白与土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 天冬氨酸激酶具有4 3 的相似性，推测其可 能编码天冬氨酸激酶，参与赖氨酸的生物合成；差异片段c p l 8 3 9 4 编码的蛋白与烟 曲霉( a s p e r g i l l u sf u m i g a t u s ) 的热激蛋白9 0 辅助分子伴侣序列具有4 1 的相似性， 推测其具有抗逆以及作为分子伴侣维持蛋白稳定和激酶活性；差异片段g p 7 5 0 2 编 码的蛋白与双色蜡蘑( l a c c a r i ab i c o l o r ) 的糖苷水解酶家族2 蛋白具有5 0 的相似性， 推测其可能和糖代谢有关；差异片段c p 2 0 3 2 1 编码的蛋白与灵芝( g a n o d e r m al u c i d u m ) 的金属硫蛋白具有5 4 的相似性，推测其可能在重金属解毒、金属离子运输及动态 平衡的维持、离子代谢以及活性氧的清除等方面起作用；差异片段a p 2 1 4 7 9 编码的 蛋白与灰盖鬼伞( c o p r i n o p s i s c i n e r e a ) 的假定蛋白c c l g0 1 8 4 8 具有6 0 的相似性， 但该蛋白的具体功能有待研究。进一步比较香菇正常子实体和球形子实体发育相关 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 基因的差异，对克隆和分析香菇子实体发育相关基因具有重要意义。 关键词：m r n a 差异显示；球形；香菇；发育基因 本课题由“十一五”国家科技支撑计划子课题“食用菌新品种选育与新技术研 究 支持。 香菇了实体发育相关摹l 矧的克隆及分析 a b s t r a ct t h ef o r m i n go ff r u i t i n gb o d yo fl e n t i n u l ae d o d e si st h em o s tc o m p l i c a t e da n dt h e m o s ti m p o r t a n td e v e l o p m e n t a lp r o c e s si nt h ew h o l el i f eh i s t o r yo fl e n t i n u l ae d o d e s ，m u s t i n t e r a c tw i t he n v i r o n m e n t ，h e r e d i t y , p h y s i o l o g ya n ds e v e r a lo t h e rf a c t o r s s t u d y i n gt h e d e v e l o p m e n t a l l yr e l a t e dg e n e so ff r u i t i n gb o d yi sa l w a y so n eo ft h em o s ti m p o r t a n t q u e s t i o n si nm u s h r o o mf i l e d n a t u r a lf r u i t i n gb o d yo f l e n t i n u l ae d o d e sd i f f e r e n t i a t e di n t o p i l e u s ，g i l la n ds t i p e s p h e r i c a lf r u i t i n gb o d yo fl e n t i n u l ae d o d e si sak i n do fm u t a t e ds t r a i nt h a tw a s f o u n di ns a n l i g a n gt o w n ，s u ic o u n t y , h u b e ip r o v i n c e ，t h ew h o l ef r u i t i n gb o d yo ft h i s s t r a i ni ss p h e r i c a l ，j u s tl i k eab a l l ，t h ef r u i t b o d yi sn o to p e n i n g ，t h es t i p ei sn o te l o n g a t i n g a n dh a sn od i f f e r e n t i a t i o no fg i l l s w ei s o l a t e dt h i ss t r a i na n dc u l t i v a t e di t a g a i n ，t h e f r u i t i n gb o d yi s s t i l l s p h e r i c a l t h i se x p e r i m e n tu s e dd i f f e r e n t i a l d i s p l a y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - p c rt oi n v e s t i g a t et h ed i f f e r e n c eo fg e n ee x p r e s s i o nb e t w e e nm y c e l i u m ， p r i m o r d i u ma n df r u i t i n gb o d yo fs p h e r i c a lf r u i t i n gb o d yo fl e n t i n u l ae d o d e s t h e e x p e r i m e n tu s e d3a n c h o rp r i m e r sb y2 6r a n d o mp r i m e r st oa m p l i f i c a t i o n o n l y 1 4 r a n d o mp r i m e r sc o u l dg e tt h es t a b l e da n dc l e a nb a n d s t h ee d n aw h i c hi st r a n s c r i b e d b ya n c h o rp r i m e rp aa n dp ca r eb e t t e rt h a na n c h o rp r i m e rp c f i n a l l y , w eo b t a i n e d4 1 s t a b l e df r a g m e n t s ，17f r a g m e n t so ft h e ma r ep o s i t i v ef r a g m e n t st e s t i f i e db yr e v e r s e n o r t h e r nb l o t t i n g , t h ef a l s ep o s i t i v ei s5 8 5 4 c l o n i n ga n ds e q u e n c i n gt h e17f r a g m e n t s ， c o m p a r e dw i t hg e n b a n kd a t a sb yb ，7f r a g m e n t sh a dh i g hh o m o l o g yw i t hs o m ek n o w n f u n c t i o n a lg e n ea n dp r o t e i ns e q u e n c e d i f f e r e n t i a lf r a g m e n tg p 2 0 5 4 0h a d9 8 h o m o l o g yw i t hl e n t i n u l ae d o d e sl e p h r a g e n ef o rp h o t o r e c e p t o ra ，i tm i g h t e n c o d eab l u e l i g h t r e c e p t o r , p a r t i c i p a t i n g i n b i o s y n t h e s i s i n go fc a r o t e n o i d si nm y c e l i aa n dr e s e t t i n go fc i r c a d i a nc l o c k ；d i f f e r e n t i a l f r a g m e n ta p l 0 - 3 0 2h a d38 h o m o l o g yw i t hh o m i n ge n d o n u c l e a s ei - a p e l io fu n c u l t u r e d c r e n a r c h a e o t e4 5 - h - 1 2 ，i tm i g h tb er e l a t e dt o p r o t e i ns p l i c i n g ；d i f f e r e n t i a lf r a g m e n t c p l 6 - 3 2 4h a d4 3 h o m o l o g yw i t ha s p a r t o k i n a s eo f a s p e r g i l l u st e r r e u s ，i tm i g h te n c o d e a s p a r t o k i n a s e ，p a r t i c i p a t i n gi nb i o s y n t h e s i z i n go fl y s i n e ；d if f e r e n t i a lf r a g m e n tc p is 一39 4 h a d4 1 h o m o l o g yw i t hh s p 9 0c 0 一c h a p e r o n ec d c 3 7o f a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i tm i g h tb e 华中农业大学2 0 1 0 届硕七学位论文 r e l a t e dt os t r e s st o l e r a n c ea n dk e e p i n gt h es t a b i l i t yo fp r o t e i n sa n da c t i v i t yo fk i n a s ea s c h a p e r o n e ；d i f f e r e n t i a lf r a g m e n tg p 7 - 5 0 2h a d5 0 h o m o l o g yw i t hg l y c o s i d eh y d r o l a s e f a m i l y2p r o t e i no fl a c c a r i ab i c o l o r , i tm i g h tb er e l a t e dt og l y c o m e t a b o l i s m ；d i f f e r e n t i a l f r a g m e n ta p e l 一4 7 9h a d6 0 h o m o l o g yw i t hm e t a l l o t h i o n e i no fg a n o d e r m al u c i d u m ，i t m i g h tb er e l a t e dt o d e t o x i f i c a t i o no fh e a v ym e t a l s ，t r a n s p o r t a t i o no fm e t a li o n sa n d k e e p i n gt h e mb a l a n c e ，i o n i cm e t a b o l i z a t i o na n dc l e a n i n ga c t i v eo x y g e n ；d i f f e r e n t i a l f r a g m e n ta p e l - 4 7 9h a d6 0 h o m o l o g yw i t hh y p o t h e t i c a lp r o t e i nc c l g 一0 1 8 4 8o f c o p r i n o p s i sc i n e r e a ，h o w e v e r , t h ef u n c t i o no f t h i sp r o t e i ni su n k n o w n a n a l y s i n gt h ed i f f e r e n c eo fg e n ee x p r e s s i o nb e t w e e nn a t u r a lf r u i t i n gb o d ya n d s p h e r i c a lf r u i t i n gb o d yo fl e n t i n u l ae d o d e si st h en e x tp h a s eo fw o r k ，i tw i l lb em u c h t o o m e a n i n g f u lf o rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fd e v e l o p m e n t a l l yr e l a t e dg e n e sf r o m f r u i t i n gb o d yo fl e n t i n u l ae d o d e s k e y w o r d s ：d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r ；s p h e r i c a l ；l e n t i n u l ae d o d e s ； d e v e l o p m e n t a l l y r e l a t e dg e n e s 香菇子实体发育相关基闪的克隆及分析 1 前言 1 1 香菇概述 香菇 l e n t i n u l ae d o d e s ( b e r k ) p e g l 刎又名香蕈、香信、香菰、椎茸，是一种 低脂肪、高蛋白的著名食用菌。香菇在s i n g e r 分类系统中隶属于侧耳科p l e u r o t a c e a e ， 香菇属l e n t i n u s ，学名为l e n t i n u l ae d o d e s ( b e r k ) s i n g ( 19 4 1 年) ，但目前国际上普遍 采用的香菇学名为l e n t i n u l ae d o d e s ( b e r k ) p e g l e r ( 1 9 7 5 年) 。根据真菌辞典( a i n s w o r t h b i s b y sd i c t i o n a r yo f t h ef u n g i ) 第十版的分类体系，香菇隶属于真菌界( m y c o t a ) ，真 核真菌亚界( e u k a r y o m y c o t a ) ，真菌f - j ( e u m y c o t a ) ，担子菌亚f - ( b a s i d i o m y c o t i n a ) ，真 担子菌纲( e u b a s i d i o m y c e t e s ) ，层菌亚纲( h y m e n o m y c e t i a e ) ，伞菌目( a g a r i e a l e s ) ，白 蘑科( 1 7 c h o l o m a t a c e a e ) ，小香菇属( l e n t i n u l a ) ( b u l l e r a h r ，1 9 3 1 ；卯晓岚，2 0 0 0 ；p e g l e r d n ，1 9 7 1 ；王健，李玉等，2 0 0 1 ) 。 野生的香菇资源主要分布于中国( 浙江、福建、台湾、安徽、江西、湖南、湖 北、广东、广西、四川、云南、贵州等) 、日本、朝鲜、菲律宾、新西兰、尼泊尔、 巴布亚新几内亚、俄国、泰国、马来西亚以及美洲大部部分国家和地区。 香菇是典型的木腐真菌，其营养主要依靠分解木材中的木质素、纤维素、半纤 维素和有机氮等化合物质。在香菇菌丝生长阶段，碳源来自木质素、纤维素的水解 产物，氮源和无机盐则来自菇木形成层或者是木屑培养基中的麸皮或米糠等。此外， 香菇菌丝也能利用牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米粉、马铃薯、尿素等多种有机氮 化物或无机氮化物。矿质元素对于香菇生长发育也是必不可少的，包括钾钠钙镁硫 磷锰铁铜锌等。因此在香菇袋料栽培的过程中，必须添加石膏、石灰、过磷酸钙、 磷酸二氢钾、硫酸镁以及麸皮、米糠等，以满足对上述元素的需求。 香菇是传统的食药用菌，不仅营养丰富，味道鲜美，而且具有重要的药用价值。 据分析，每1 0 0 9 香菇含水分1 3 9 ，脂肪1 8 9 ，碳水化合物5 4 9 ，粗纤维7 8 9 ，灰分 4 9 9 ，钙1 2 4 m g ，磷4 1 5 m g ，铁2 5 3 m g ，以及丰富的维生素b l 、b 2 等。香菇中的 氨基酸异常丰富，构成蛋白质的2 0 种氨基酸，香菇就有1 8 种，其中8 种必需氨基 酸都含有( 于淑池等，2 0 0 3 ) 。香菇中含腺嘌呤、胆碱、酪氨酸、氧化酶以及某些 核酸物质，酶以及某些核酸物质，能起到降压、降胆固醇、降血脂的作用( 刘春如等， 2 0 0 2 ) ，还可预防动脉硬化、肝硬化等多种心肝血管疾病，香菇还含有多种维生素、 华中农业人学2 0 1 0 届硕士学位论文 矿物质，对促进人体新陈代谢，提高机体适应能力具有很大作用；香菇还对糖尿病、 肺结核、传染性肝炎、神经炎等起治疗作用，又可用于消化不良、便秘、减肥等。 另外，香菇酸分解生成的香菇精可以作为香料进行调味，目前也具有很大开发前景。 1 2 香菇子实体形成机理相关研究 1 2 1 香菇的生活史 香菇是典型的四极性异宗结合真菌。生活史可以分为无性阶段和有性阶段，无 论是无性阶段还是有性阶段都能独立生长。我们通常说的香菇的生活史是指香菇的 有性生活史，从有性孢子即担孢子开始到产生新一代担孢子的全部过程。香菇的子 实体成熟后，菌褶处形成担子，在担子顶端形成担孢子。每一个担孢子在条件适宜 的情况下可以萌发生成菌丝，称为单核菌丝，且每个细胞内只有一个细胞核，因此 是单核、单倍体菌丝。这种由担孢子萌发生成的菌丝体称为初生菌丝体，在条件适 宜的情况下，可以无限生长下去。两个可亲和的单核菌丝可以融合，融合之后，形 成每个细胞内都含有2 个细胞核的次生菌丝，该阶段是香菇生活史的主要阶段。双 核菌丝在生长过程中通过锁状联合( c l a m pc o n n e c t i o n ) 的方式使来源不同的两个核 平均分布到每一个细胞中。双核体阶段和单核体一样，在条件适宜的情况下，可以 无限生长下去。香菇的单核体和双核体阶段，没有发生细胞核的融合，为无性生长 阶段。这两种形式的菌丝体都可以通过试管转接而扩大培养，为香菇的遗传育种和 菌种制备提供便利。双核菌丝体进一步分化，可以形成组织化的菌丝体，即三次菌 丝体，从而发育成为子实体。在子实体形成过程中，双核体中两个交配型不同的细 胞核发生核配，形成双倍体合子，随即迅速发生减数分裂，形成4 个单倍体的单核 担孢子，从而完成香菇整个生活史。减数分裂的过程是香菇生活史的有性阶段，但 这个阶段非常短暂。 1 2 2 香菇子实体形成的环境因素 1 2 2 1 温度 香菇是典型的变温结实型食用菌，温度也是影响香菇生长最为关键的因子，原 基的形成与分化必须要通过一定温差的温差刺激。香菇菌丝生长的最适温度为2 5 左右，而子实体分化的最适温度为1 5 。c 左右，超过2 l 时就停止分化。t r i r a t a n a 2 香菇子实体发育相关基斟的克降及分析 等进行了4 个不同特性的香菇菌株的温差试验，结果表明，当菌丝发生转色同时形 成革质的褐色菌皮之后，香菇可以形成子实体。当菌丝长满整个培养袋之后，一般 经过2 - - - 3 个月的时间，可以形成子实体。( t r i r a t a n a s & t a n t i k a n j a n at ，1 9 8 9 ) 代料 栽培香菇就是为了适应香菇这一生理特性进行生产季节的安排。有的时候在菌丝长 满菌袋之前，也可以通过低温处理菌袋，也可以形成原基。 香菇菌株可以分为高温型、中温型和低温型等不同温型，香菇产量与不同时期 不同温度也有一定的相关性，因此在生产中的对于菌株温型的选择及栽培季节选择 仍然是极其重要的。但s o n g 等对两个香菇菌株在两个不同的温度范围内的子实体 的发育情况进行比较，发现在一定的不同的温度范围内香菇均能形成原基，同时可 以发育成为成熟的子实体，得出结论，认为温度的变化对香菇产量没有显著的影响， 但这也可能是由于该两个香菇菌株是对温度敏感性比较弱的基础上。 1 2 2 2 水分 香菇子实体中水分含量非常高，通常可以占到细胞总重量的9 0 左右。而且在 香菇生长的各个时期，水分也是必不可少的。在香菇菌丝体生长阶段，培养料的含 水量约为4 0 5 5 ，随着香菇进入生长后期，则需要通过泡水等方法不断补充生长 。过程中散失的水分并且提高空气湿度。香菇原基形成和发育需要较高的空气湿度， 另一方面，较低的湿度和干湿交替则可促进花菇的形成。此外，当空气湿度比较大 的时候，菌盖的生长受到抑制，菌柄的生长受到促进。 经过浸水可以诱导香菇子实体的发生，在这个过程中香菇的呼吸作用明显增强。 m a ts u m o t o 等人2 4 的条件下，用1 8 的水浸泡培养了4 0 d 的香菇菌丝，结果发 现呼吸作用增强到原来的2 5 倍，2 d 之后形成原基，形成原基后呼吸作用降到原来 水平。用水浸泡9 0 d 的香菇菌丝也得到了相同的结果。但是用同样的方法处理菌龄 只有2 0 d 的香菇菌丝，发现处理后呼吸作用没有显著增强，同时，也没有形成原基。 得出结论，只有生理成熟的菌丝通过泡水处理才能诱导形成原基。 1 2 2 3 光照 光照既可抑制真菌的发育，也可刺激真菌的发育，其中的作用机理相当复杂， 而且受到其他环境因子或营养因子等其他因子的影响。有研究发现，香菇的生长受 到蓝光、红光以及远红光的影响。在一般情况上，光照强度越强，不但可以提高香 菇子实体结实率，而且还可以增加子实体色素的浓度。关于受体吸收光照后如何激 活香菇原基形成，以及为什么光反应受到某种化合物或营养物能改变的具体原因目 前还没有完全清晰。i s h i k a w a ( 1 9 6 7 ) 指出蓝光对于香菇子实体的发生具有最强的刺激 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 作用。a n d o ( a n d o m ，19 7 4 ) 贝1 j 认为，蓝光和粉红色光对于香菇菌丝生长阶段也是必 须的，诱导生成子实体。h i r o a k is a n o 等( 2 0 0 7 ) 分离并命名了l e p h r a 基因，该基 因的产物认为有9 2 4 个氨基酸残基组成，其中包含1 个l o v 结构域和2 个p a s 结 构域。说明l e p h r a 是一个蓝光接受器。对于香菇而言，l e p h r a 基因在未成熟的 子实体菌褶和菌盖处大量表达。 1 2 2 4 空气 香菇的生长也受到c 0 2 浓度的影响，其中，子实体受到的影响大于对原基的影 响，而且c 0 2 浓度越高，对于对子实体形成的影响也越大。也有研究表明，c 0 2 浓 度对于菌丝生长的影响也要小于对于子实体生长的影响。当然不同的c 0 2 浓度对于 香菇的影响也因不同香菇菌株而异。 l e a t h a m 等( 1 9 8 7 ) 通过利用薄膜覆盖培养袋的试验表明，c 0 2 会抑制子实体 的生长，于是我们在生产中也经常通过刺孔的方式增加空气的流通，增加氧气的含 量，同时也排除其他一些抑制香菇生长的代谢物质。 在很多食用菌中，c 0 2 浓度对于菌盖和菌柄的生长影响比较大，一般c 0 2 浓度 浓度越高菌柄生长地越长而菌盖的生长受到抑制，在香菇中也有类似的发现，不同 香菇菌株对于c 0 2 浓度的敏感度也不同。 1 2 3 香菇子实体形成的遗传因素 香菇子实体的形成除了需要适宜的环境条件外，本身具有参与一系列调控过程 的基因也是不可缺少的条件，研究子实体形成的调节机制将为研究香菇的发育提供 重要的信息。 1 2 3 1 交配型基因 一般来讲，在异宗结合的食用菌中，子实体的形成有赖于一个稳定的异核体的 形成，这正是交配型基因对结实起主要调控作用的关键所在。因为一个稳定的异核 体的形成受同质不亲和性所控制，携带相同步亲和性因子的同核菌丝体之间的交配 不能形成稳定的异核体，因而自交不孕的。这就是说，在香菇中，a 、b 两个不亲 和性因子任何一个相同或完全相同的配对，都不能形成稳定的异核体，也不能结实。 四极性食用菌在形成异核体的过程中，需要经历一系列步骤。其中核的配对、 菌丝细胞融合及锁状联合细胞的形成由a 因子控制，核的迁移及锁状联合细胞与次 顶端细胞的融合由b 因子控制。在a = b 异核体中，有核迁移发生，但菌丝细胞不 4 香菇子实体发育相关摹因的克降及分析 能融合，钩状细胞也不能形成。在a b = 异核体中，隔膜的融合及核的迁移不能进 行，但在融合细胞中核经历了与钩状细胞的形成同步的核分裂，由于钩状细胞不能 与次顶端细胞融合，所以只能形成所谓的假锁状联合。在完全可亲和及a b 异核 体中，有核迁移的发生，但一旦一个外来的核进入顶端细胞，核迁移随机停止。该 外来核即与原来的核相结合。此后，这两个配对核伴随着锁状联合细胞的形成进行 同步分裂，同时钩状细胞亦能与次顶端细胞顺利融合，从而形成稳定的异核体。 1 2 3 2 其他一系列与发育相关的基因 在香菇原基形成之前，转色后的菌丝扭结成团的过程中涉及到l e c t i n 基因的作 用( t s i v i l e v ae ta 1 2 0 0 1 ) 。朋b 基因在香菇原基阶段大量表达( e n d oe ta 1 1 9 9 4 ) ，而 且通过对随机结合位点的分析表明p r i b 表达产物p r i b 特异地结合到一个1 6 b p 的 d n a 序y l j ( m i y a z a k ie ta 1 1 9 9 7 ) 。m f b c 基因是由p r i b 基因表达产物调控的靶基因， 该基因几乎只在香菇成熟子实体的阶段中专一转录( m i y a z a k ie ta 1 2 0 0 4 b ) 。l e c d c 5 基因是一个和裂殖酵母同源的基因，该基因在原基以及未成熟的小的子实体中表 达，该基因编码的多肽结合在一个7 b p 的d n a 序列5 g c a a t g t 3 ( m i y a z a k ie ta l 2 0 0 4 a ) 。最近的免疫组织化分析证明l e c d c 5 在香菇成熟的子实体层中专有的表 达( n a k a z a w ae ta 1 2 0 0 6 ) 。m j b a 基因在香菇的菌盖组织中大量转录，而在茵柄和菌 褶组织中没有发现( k o n d o he t a l 1 9 9 5 ) 。l e 朋，2 基因是在香菇中编码核糖核苷酸还 原酶，该基因在香菇成熟子实体层中转录最为活跃( k a n e k oa n ds h i s h i d o2 0 0 1 ) 。 两 种香菇不同种类表达疏水蛋白在子实体形成过程中可能起不同的作用叫ge t a 1 2 0 0 0 ) ，通过r n a 原位杂交显示l e h y d l 基因在子实层周围大量检测到( n i s h i z a w ae t a 1 2 0 0 2 ) 1 3m r n a 差异显示技术及其研究概况 1 3 1m r n a 差异显示技术的原理及步骤 d d r t - p c r 技术通过m r n a 反转录形成e d n a ，不包含有内含子，直接研究编 码蛋白质的基因，这样的方法更加直接，更加具有意义。m r n a 差异显示技术是研 究两个或者多个组织或细胞之间基因表达的差异，寻找差异表达e d n a 片段。m r n a 差异显示技术根据真核生物m r n a 3 端带有p o l y a 的结构，设计两组引物，锚定引 物和随机引物，进行m r n a 的反转录。将不同锚定引物反转录得到的e d n a 用一 定数量的随机引物进行p c r 扩增，可以得到所有的m r n a 的特异片段，然后将这 华中农业人学2 0 1 0 届硕士学位论文 个特异性的片段进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从中可以筛选出差异表达的e d n a 片段，然后将这些差异片段进行回收纯化，克隆测序，研究差异片段在该物种生命 活动中所具有的意义。 1 3 2m r n a 差异显示技术的优缺点 1 3 2 1m r n a 差异显示技术的优点 ( 1 ) 该技术操作比较简便、快速、高效，p c r 技术和电泳技术都是实验室常规技术， 降低了分离差异基因的难度。而且可以同时比较、分析多个来源不同或者不同时期 的样品，可用于研究特定时期或者特定部位的差异表达基因。 ( 2 ) d d r t - p c r 技术所需要的起始r n a 的量极少，一般只需要0 2 0 0 2 9 左右，这对 于一些难于提取r n a 的物种是一种极大的便利。利用r n a 或者m r n a 为起始模板对 于试验没有显著的影响，这就减少了纯化m r n a 的步骤，也提高了实验效率。 ( 3 ) 该方法在理论上可以使每一条m r n a 均有扩增的机会，也就可以研究每一条特 异的片段和基因，得出特定细胞系的全部基因。 1 3 2 2m r n a 差异显示技术的缺点 ( 1 ) 所得的差异c d n a 片段较短，由于反转录的过程是通过锚定引物反转录3 端具 有p o l y ( a ) 结构的m r n a 序列，这样就很少可以扩增到开放读码框架内。而且受 p a g e 胶分辨率的限制，只能分辨小于5 0 0 b p 左右的e d n a 片段，并且而且多数是位于 m r n a 3 端的非编码区，这样往往很难检测到m r n a 上游的表达基因的信息，得到 的差异片段就很难进行下一步的分析，对于该片段的功能很难进行进一步的研究。 ( 2 ) 由于p c r 技术的敏感性较高，这样就对丰度较高的m r n a 起到了放大的作用， 有研究表明，无论使用多少条1 0 m e r 弓i 物，细胞中的所有的m r n a 并不能被标准的差 异显示技术所完全检测到，会遗漏掉一些低转录水平的e d n a 片段。 ( 3 ) 假阳性高一直是d d r t - p c r 技术最大的缺陷。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨 力的局限性，并且由于某些差异条带本身的特殊性，在变性p a g e 上认为只是单一条 带的差异片段，在实际上有可能是由碱基数量大小相同、但是却是个别碱基有差异 而形成的不同的e d n a 片段在电泳时共迁移而形成单一条带，这就给后续分析带来 了假阳性。 6 香菇子实体发育相关基因的克隆及分析 1 3 3m r n a 差异显示技术的改进方法 基于d d r t - p c r 技术存在着的缺陷，国内外研究者对该方法进行了不断探索和 改进。 ( 1 ) 高纯度r n a 的制备 从样品组织中提取r n a 是进行m r n a 差异显示的必要前提。目前提取r n a 的 方法很多，如t r i z o l 法、c t a b 法、异硫氰酸胍法等，当然无论使用什么方法提 取r n a 都需要用不包含有r n a s e 活性的d n a s e 去除所得样品中的基因组d n a 。 ( 2 ) 改进引物 l i a n g 等( 1 9 9 2 ) 一开始设计了第1 代引物，3 端的锚定引物有1 2 种， 而5 端 l o 个碱基的随机引物有2 0 种，这样就一共有2 4 0 种引物组合。后来l i a n g 又设计 了第2 代引物，将3 锚定引物中的两个碱基改为一个碱基，这样就只剩下3 种锚定 引物，即t 1 2 a 、t 1 2 g 和t 1 2 c ，在5 端的随机引物方面引入了h i n d l i i 酶切位点，这 样就一共有6 0 种组合，h i n d l i i 酶切位点加入到引物中，是为了方便后续差异片段 的克隆。g e n h u n t e r 公司于1 9 9 6 年设计了第3