（制糖工程专业论文）基于免疫反应的高灵敏检测方法的建立.pdf

摘要 摘要 由于量子点及碳纳米管( ) 独特的纳米特性及生物兼容性，它们在免疫分析 领域被广泛应用。本论文分别构建了两种基于免疫反应的高灵敏检测方法。基于聚合量 子点的超灵敏免疫印迹方法( w e s t e r nb l o t ) 用以对复杂蛋白样品进行分析检测，碳纳米 管一纸免疫传感器对水中的微囊藻毒素进行检测。 一种免疫方法是：基于量子点的超灵敏蛋白检测免疫印迹方法。碲化镉( c d t e ) 量 子点由于它独特的光学及生物特性，被广泛应用于生物化学标记领域。本论文构建了一 种基于量子点的超灵敏蛋白检测免疫印迹方法。由于亲和素功能化的聚合量子点的高亲 和性及对检测步骤的简化，使得量化免疫印迹方法成为现实。为了制备聚合量子点，首 先需要用生物素化的变性牛血清白蛋白( d b s a ) 包裹量子点，然后通过生物素与亲和 素的相互作用，量子点相互偶联生成聚合量子点。经过一系列的修饰，碲化镉量子点的 荧光强度显著增强。把聚合量子点作为免疫印迹的标志物，其追踪微量蛋白比传统染料 更灵敏。以蛋白a 为例，对基于聚合量子点的免疫印迹方法进行验证，检测线性范围为 3 0 p g 到1 5 n g ，检测限达0 8 4 p g 。最终在聚偏二氟乙烯膜上的荧光信号至少可以保持 4 0 m i n 。进行实际样品检测时，回收率达9 9 9 到1 0 3 0 。 另一种方法是纸单壁碳纳米管复合物组成的，简单且高效的传感器。碳纳米管传 感器的电阻取决于碳纳米管网络之间的间隙宽度，该方法能很好的满足常规毒素的检测 要求。本论文对微囊藻毒素进行了检测并建立了标准曲线，线性范围为1 2 5 n m o l l 到 1 0 n m o l l 。检测限达0 6 n m o l l ( 0 6 n g m _ l ) ，满足了世界卫生组织关于饮用水中微囊藻毒 素含量不超过l n g m l 的检测要求。同时，论文还对该方法与e l i s a 检测方法进行了比 较。 关键词：量子点、碳纳米管、免疫印迹、电化学、微囊藻毒素、免疫分析 a b s t r a c t q u a n t u md o t sa n dc a r b o nn a n o t u b eh a v e b e e nw i d e l yu s e di nt h ef i e l do fi m m u n o a s s a y b e c a u s eo ft 1 1 e i rp a r t i c u l a rs p e c i a l i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t y i nt h ep a p e r , w er e s e a r c h e dt w o d e t e c t i o nm e t h o db a s e do ni m m u n o s a s s y u l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no fp r o t e i nb yw e s t e r nb l o t b a s e do np o l y - q u a n t u md o tp r o b e sw e r eu s e di nm i c r o - p r o t e i na n a l y z i n g ，a n ds i n g l ew a l l e d c a r b o n - n a n o t u b e s ( s w n t s ) - p a p e rs e n s o rw e r eu s e d t od e t e c tm c l ri nw a t e r o n eo ft h em e t h o di su l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no fp r o t e i nb yw e s t e r nb l o tb a s e do n p o l y - q u a n t u md o tp r o b e s w i t ht h eh i g ha f f i n i t yo fa v i d i n f u n c t i o n a l i z e dp o l y - q d sa n d s i m p l i f i c a t i o no ft h ed e t e c t i o np r o c e s s ，t h i se n a b l e dt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fp r o t e i nb y w e s t e r nb l o t t i n g t op r e p a r et h ep o l y - q d s ，c d t eq u a n t u md o t sw e r ef i r s tc o a t e dw i t h b i o t i n y l a t e dd e n a t u r e db o v i n es e r u ma l b u m i n ( d b s a ) ，a n d t h e nv i a t h ee f f e c to ft h e b i o t i n - a v i d i ns y s t e m , t h eb i o t i n y l a t e dd b s a c o a t e dq d sw h i c hh a ds t r o n gf l u o r e s c e n c ew e r e c o n j u g a t e d w i t ht h i ss e r i e so fm o d i f i c a t i o n s ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fc d t eq d sw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d u s i n gt h ep o l y - q d sa sl a b e l s ，t h es i g n a lo fw e s t e r nb l o t t i n gw a s m o r es e n s i t i v ei nt r a c i n gt h ep r o t e i nt h a nt r a d i t i o n a ld y e i n g i nt h ep r e s e n ts t u d y , p r o t e i na w a sa p p l i e dt op o l y - q d s - b a s e dw e s t e r nb l o t t i n ga sam o d e l t h el i n e a r i t yo ft h i sm e t h o d w a sf r o m3 0p gt o1 5n g a n dt h es e n s i t i v i t yw a su pt oo 8 4p i c t o g r a m t h ef i n a lf l u o r e s c e n c e s i g n a lo nt h ep v d fm e m b r a n ew a sr e t a i n e df o ra tl e a s t9 0r a i n t h er e c o v e r yo f r e a ls a m p l e s d e t e c t i o ni sf r o m9 9 9 t o1 0 3 o t h eo t h e ri sc o m p o s i t e so b t a i n e di m p r e g n a t i o no fp a p e r sb ys w n t st o w a r d sv e r ys i m p l e a n dh i g h - p e r f o r m a n c e b i o s e n s o r s t h e yu t i l i z e t h e s t r o n gd e p e n d e n c eo fe l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t yt h r o u g hn a n o t u b e sp e r c o l a t i o nn e t w o r ko nt h ew i d t ho fn a n o m b e s - n a n o m b e t u n n e l i n gg a pa n dc a np o t e n t i a l l ys a t i s f yt h er e q u i r e m e n t sf o rt h er o u t i n et o x i nm o n i t o r i n g i n t h i ss t u d y , w ed e t e c t e dm c - l ri nw a t e rw i t ht h es w n t s - p a p c rb i o s e n s o r t h em e t h o dh a st h e l i n e a rd e t e c t i o nr a n g ef r o m1 2 5n m o l lt o10n m o l l t h ed e t e c t i o nl i m i tw a sf o u n dt ob e0 6 n m o l l ( o 6n g m l ) ，w h i c hs a t i s f i e st h es t r e c t e dw o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o ns t a n d a r df o r m c - l rc o n t e n ti nd r i n k i n gw a t e r ( 1n g m l ) ，a n di sc o m p a r a b l et ot h ed e t e c t i o nl i m i to f t r a d i t i o n a le l i s am e t h o do fm c l rd e t e c t i o n k e y w o r d s ：q u a n t u md o t , c a r b o nn a n o t u b e ，w e s t e r nb l o t , e l e c t r o c h e m i s t r y , m c - l 凡 t m m u n o a s s a y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同5 - 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：许地 日 期翌! 皇：! 垒 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 三芏熊塾 导师签名： 日 期： 塑z ：! 三：堕 绪论 一、绪论 在纳米技术日益进步的今天，由于其独特的性质，纳米材料在生物、化工领域的应 用已日渐成熟0 - 6 1 。同时，随着纳米粒子的进一步发展及其各方面功能的日益完善，其 在食品、饮用水分析应用中的潜力也被逐步挖掘0 1 ，受到研究者们的广泛认可和关注。 这方面的研究也逐渐深入。 荧光量子点、碳纳米管是较为常见的纳米材料，我们将量子点与免疫印迹方法相结 合对复杂蛋白样品进行分析，一方面突破免疫印迹方法只能半定量分析的瓶颈，达到定 量检测要求，另一方面提高了免疫印迹检测的灵敏度，使其应用范围更广。将碳纳米管 与电化学相结合，制备出碳纳米管纸电极用以对日常饮用水中的藻毒素进行分析检测， 建立了一种快速、操作简便、经济的电化学检测方法。 免疫印迹方法是分析复杂蛋白样品中常用的手段之一，在毒理学分析、细胞蛋白分 析、食品及各种蛋白的分析中广泛应用。随着色素、防腐剂、乳化剂、调味剂、营养强 化剂等食品添加剂行业的快速发展，越来越多新型食品、饲料的出现。在给人们的生活 带来便利的同时，食品、饮料、饲料、医药用品的安全性也需要得到保证，而国内外多 次出现的安全事件更是为我们敲响了警钟。所以对各种添加剂、新型食品、饲料、医药 用品进行毒理学分析显得非常必要及迫切。各种检测分析方法，包括免疫印迹方法的改 进也十分迫切。 2 0 0 5 年，r i c h a r d t l l j 等公布了量子点公司的新产品，将量子点应用于免疫印迹中，降 低该检测方法的检测限，提高其灵敏度，检测限为2 0 p g ，但该产品采用直接偶联方式将 抗体与量子点偶联，一种产品检测一种物质，而且价格昂贵，使它的广泛应用受到很大 限制。 2 0 0 8 r u m i a n ab a k a l o v a t l 2 】等对量子点在w e s t e r nb l o t 中的应用做了研究，但其检测限 相对较高，达1 - 5 n g ，对微量蛋白样品的分析受到很大的限制，操作也较费时。 蓝藻对水造成的严重污染，使饮用水安全成为人们关注的焦点，微囊藻毒素为有害 的蓝藻水华释放的一类具有强烈毒素 1 孓1 6 】，它通过抑制传递细胞信息的蛋白磷酸酶的活 性，对人体及动物肝脏有强烈的毒害作用，当人们长期饮用含有藻毒素的水时，微囊藻 毒素会促发人体内早期的癌变【1 7 以9 1 。尽管目前有很多方法可以对水的安全性进行评估， 但发现一种简单、快速、通用、经济、的检测方法仍然是一项很大的挑战，许多研究者 都在积极的探究摸索中【2 0 - 2 2 1 。 已有文章【2 3 】对用单壁碳纳米管包裹的棉线检测溶液中的蛋白，比如血液中的蛋白有 报道。s w n t s 棉线的出现为高危检测、生物医药设计诊断各种疾病领域带来了新的跨 越。于是对于这种简易的检测方法是否能够得到开发并应用于环境及食品安全检测有重 要的现实意义。带着这种想法，我制备并表征了单壁碳纳米管包裹的滤纸，用以检测水 中的微囊藻毒素。 江南大学硕士学位论文 1 1 量子点概论 1 1 1 量子点的性质 量子点是由i i v m 或i v b 族元素组成的纳米颗粒，又称半导体材料。由于电 子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，量子点受激发后可 以发射很强的荧光【2 4 1 。量子点的激发光波长范围很宽，不同颜色的量子点可以由同波 长的光激发，而且量子点具有较大的荧光光谱较相应的吸收光谱红移和狭窄对称的荧光 谱峰，其半高峰宽常常只有4 0 n m 或更小，这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点， 发射光谱不出现交叠，使标记生物分子荧光谱的区分、识别变得很容易，荧光寿命长。 量子点可以通过调整粒子尺寸来得到不同颜色的荧光，而粒子的组成和表面性质不需改 变，因此可以使用一套通用的偶联方法实现多色标记1 2 5 1 。而其他不同颜色的荧光标记物 因分子结构不同，必须运用相应的很多不同的偶联方法，使操作过程变得复杂，也为残 留检测标记的发展提供了基础。1 9 9 8 年，a l i v i s a t o s 2 6 】和n i e 等人【2 7 】分别攻克了以量子 点作为生物探针与生物之间相容性问题的难关，使量子点成为最有前途的荧光标记物之 一【2 8 - 3 0 j 。 量子点在生命科学、分析科学、材料科学、免疫医学、检验检疫科学等口传统及新 兴的领域中都得到了广泛的应用，并取得了一定的研究进展，尤其是在生命科学的各个 领域中，它的作用更是日益突出。同时，量子点在食品检测及分析中的应用也越来越多。 1 1 2 量子点的应用 1 1 2 1 量子点标记d n a 利用量子点的多重性和多强度性质对生物分子群进行大量编码标记，在基因组学和 蛋白质组学研究中具有重要的现实意义。 d u b e r t r e t 等【3 l 】将一段特定序列的d n a 片段连接到聚乙烯二醇( p e g ) 胶束包覆的 量子点表面制成了探针，将生物素化的随机d n a 、序列及互补序列分别固定于链酶亲和 素化的琼脂糖小球上，将量子点探针溶液加入到琼脂糖小球溶液中，在荧光显微镜下观 察，发现在固定互补序列的小球上有很强的荧光，而固定随机d n a 序列的琼脂糖小球上 却看本到荧光，有效地说明了量子点探针对待检测d n a 样本的检测作用，特异性很好， 量子点的标记很成功。 n i e 和他的同事【3 2 】巧妙地将不同数量、不同荧光特征的量子点组合进同一个内部镂 空的高分子小球中，从而形成具有不同光谱特征和亮度特征的微球，并将d n a 序列连接 到微球上，完成量子点编码。 1 1 2 2 活体及细胞成像 a k e r m a n 等【3 3 】率先报道了利用p e g 包裹的量子点标记多肽来定位活体组织血管， d a l em w i l l a r d 等【3 4 】将生物素化抗微管蛋白的抗体与红色量子点与亲和素的偶联物进行 反应，进而对细胞中的微管蛋白进行量子点标记，可以对其变化进行追踪观察。d u b e r t r e t 等【3 l 】用磷脂包裹的量子点，将其结合到d n a 上，经过处理注入非洲蟾蜍胚胎中，量子 2 绪论 点微团就稳定地停留在胚胎中，量子点的荧光可以随着蝌蚪的生长一直存在，并且可以 追踪胚胎发育的整个过程 x i a o h ug a o 等【3 5 】把量子点修饰上三嵌段共聚物，再将标记物反应到目标肿瘤的配体 或者功能性的药物载体上，这样就可以在活体小鼠或其他动物中，实现活体成像。 这些实验都充分证明，量子点具有稳定的荧光性能和良好的生物兼容性，为毒理分 析、疾病研究、生理功能研究等提供了很大的便利。 1 1 2 3 作为免疫标志物 量子点由于其优良的光学性质，常被作为标志物应用于毒理分析、食品、动物饲料 安全及疾病控制等免疫检测分析手段中【3 “0 1 ，为免疫分析的检测限、灵敏度、快速简便 等方面提供了很大的便利。 s u n 4 1 等将巯基琥珀酸处理的q d s 与抗体连接后用作高通量蛋白质芯片的荧光标记 物，采用非均相夹心法在微阵列芯片上，形成抗体一抗原检测抗体的结合体，用激光共聚焦 扫描法检测相应的荧光信号，实现了微阵列芯片上的免疫分析。 e l l e nr g o l d m a n l 4 z j 等人用不同尺寸的量子点，通过与不同的抗体偶联，实现了对 霍乱毒素、蓖麻毒素、类志贺氏毒素l 、葡萄球菌肠毒素b 四种毒素的多残留检测，p e n g , c f 【4 3 j 等利用不同尺寸量子点，实现了五种化学、生物残留物的多残留检测。 量子点与抗体的结合使它的优势得到充分发挥，即利用了抗体的高特异性，又使免 疫检测灵敏度得到进一步的提高。 1 2 碳纳米管概述 1 2 1 碳纳米管的性质 各种形状的碳纳米材料广泛用于检测领域，如碳纳米管【4 4 4 5 】、碳纳米线【4 6 4 7 】、碳纳 米粒子【4 s 】等。 纳米碳管是由单层或多层石墨片卷曲而成的无缝纳米级管状壳层结构。根据纳米碳 管中碳原子层数的不同，纳米碳管可以分为两类：单壁纳米碳管( s 咖s ) 和多壁纳米碳 管( m w n t s ) 。纳米碳管的结构形态不同，主要因为纳米碳管的管壁有单层的，也有多层 的，纳米碳管的管身有直线形的，也有弯曲的；多层纳米碳管的片层之间还存在一定角 度的扭曲，称为螺旋角，因此碳纳米管还分螺旋形和非螺旋形两种【4 9 】。 鉴于碳纳米管纳米级的尺度和规整的微观结构，c n t 具有一些特殊的物化性质，开 口的c n t 可以被用作纳米级化学试管、虹吸管、催化剂载体、超级吸附剂、电极材料、 储能材料等。近年来研究者的深入研究使碳纳米管的这些用途得以一一实现 5 0 - 5 3 】。 1 2 2 碳纳米管的应用 1 2 2 1 碳纳米管导电性的应用 在电化学分析领域，碳纳米管电极具有较大的电极表面积和较高的电子传递速率， 与其它碳电极相比，纳米碳管能增大电流响应，降低检出限，电化学分析性能更为优异。 3 江南大学硕士学位论文 在碳纳米管内，由于电子的量子限域所致电子只能在石墨片中沿着碳纳米管的轴向运 动，因此碳纳米管表现出独特的电学性能。实验发现根据其直径和螺旋度的不同，它既 可以表现出金属性又可以表现出半导体性。 b r i t t op j 等【5 4 】首先将碳纳米管制成电极并用于对神经递质多巴胺的电催化氧化，成 功地探测了生物电化学反应，开辟了碳纳米管的应用。a m i d 等【5 5 j 利用多壁碳纳米管、 n a t i o n 和c o b a l t ( i 1 3 5 。n i t r o s a l o p h e n ( c o n s a l ) 复合物修饰碳糊电极，同时检测了复杂样品 中尿酸和维生素c 的含量。与传统的其它碳电极相比，在反应速率和导电性等方面，碳纳米 管修饰电极具有很大的优越性。 1 2 2 2 碳纳米管热学性质的应用 纳米碳管是最好的导热材料，它依靠超声波传递热能，其传递速度可达到每秒l 万 米。并且发现，即使将纳米管捆在一起，热量也不会从一根纳米管传到另一纳米管，这 说明纳米碳管只能在一维方向传递热能。并且，纳米碳管优异的导热性能将使它成为今 后计算机芯片的导热板，也可用作发动机、火箭等各种高温部件的防护材料。 1 2 2 3 碳纳米管的电磁性能的应用 在碳纳米管内，由于电子的量子限域所致，电子只能在石墨片中沿着碳纳米管的轴 向运动，因此碳纳米管表现出独特的电学性能。它既可以表现出金属的电学性能又可以 表现出半导体的电学性能。 e b b e s e n 等【5 6 】人直接测量了多壁碳纳米管的电导，证明了碳纳米管金属性和半导体 性的存在。 碳纳米管具有优异的磁性能，新近发现的碳纳米管软磁材料在高频场中具有巨磁阻 抗效应。其应用领域有功率变压器、脉冲变压器、扼流圈、互感器磁头和磁开关等。它 将成为铁氧体的有力的竞争者【5 7 】。 1 3 免疫印迹及电化学分析方法 1 3 1 免疫印迹方法 免疫印迹法( w e s t e r nb l o t t i n g ) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相 结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋 白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子 的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。 免疫印迹法( i m m u n o b i o t t i n gt e s t ，i b d 亦称酶联免疫电转移印斑法( e n z y m el i n k e d i m m u n o e l e c t r o t r a n s f e rb l o t , e i t b ) ，因与s o u t h c m 早先建立的检测核酸的印迹方法 s o u t h e r nb l o t 相类似，亦被称为w e s t e r n - b l o t 。 二氨基联苯胺( d a b ) 、37 ，3 ，57 ，57 ，四甲基联苯胺( t m b ) 常被用于免疫印迹分析的 染色【5 引。但由于这些化学染料的的检测限太高，做微量复杂蛋白样品的分析时，受到很 大的限制。于是化学与荧光发光染料开始在免疫印迹分析中得以应用，使检测限大大降 低，免疫印迹分析的应用范围进一步扩大。 4 1 3 2 电化学分析方法 电化学作为化学的分支之一，是研究两类导体( 电子导体，如金属或半导体，以及 离子导体，如电解质溶液) 形成的接界面上所发生的带电及电子转移变化的科学。传统 观念认为电化学主要研究电能和化学能之间的相互转换，如电解和原电池。但电化学并 不局限于电能出现的化学反应，也包含其它物理化学过程，如金属的电化学腐蚀，以及 电解质溶液中的金属置换反应。由于电化学的高灵敏度，在各个领域中的应用越来越广。 近年来，电化学与何种纳米材料相结合，应用于各种传感器的研制，在检测分析领 域发挥着越来越重要的作用【5 9 - 6 0 l 。碳纳米管在电化学传感器中的应用在国外内研究比较 多，但大多是在商品化的电极上直接进行修饰，价格较高。 1 4 本课题研究内容、目标 1 4 1 研究内容 1 、将量子点与免疫印迹方法相结合，建立基于聚合量子点的免疫印迹新方法，对微量 复杂蛋白样品进行分析，并与商品化的化学发光试剂盒进行了比较。 2 、将碳纳米管与电化学相结合，制备出碳纳米管纸电极用以对日常饮用水中的藻毒素 进行分析检测，建立了一种快速、操作简便、经济的电化学检测方法。并与传统的e l i s a 方法进行了比较。 1 4 2 研究目的 1 、对量子点进行修饰，增强其稳定性、增强其荧光强度。将修饰好的量子点应用于免 疫印迹分析，降低该研究方法的检测限，扩大其检测范围，突破免疫印迹方法只能做半 定量分析的瓶颈，使其在微量、复杂蛋白样品的分析中得到更好的发挥。 2 、利用碳纳米管材料制备出碳纳米管纸电极，作为工作电极，用电化学方法将其应用 于日常饮用水中微囊藻毒素的检测分析，以得到一种快速、操作简便、经济的检测方法。 5 江南大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 1 1 实验药品 碲化镉( c d t e ) 量子点 蛋白a 抗蛋白a 抗体 生物素化羊抗兔抗体 牛血清白蛋t j ( b s a ) 生物素( b i o t i n ) 亲和素( a v i d i n ) 硼氢化钠 氯化钠 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 t w e e n - 2 0 羧基修饰的单壁碳纳米管( s w n t s ) 微囊藻毒素抗体 n a t i o n 聚苯乙烯磺酸钠( p s s ) 实验材料及方法 中科院化学所 上海捷宁生物科技有限公司 武汉博士得生物工程有限公司 s i g m a 上海伯奥生物科技公司 北京拜尔迪生物有限公司 北京拜尔迪生物有限公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 成都有机化学有限公司 实验室前人制备 f l u k a s i g m a 2 1 2 主要溶液 1 阳极缓冲液i 0 3 mt r i s ，1 0 ( v 甲醇，p i l l 0 4 2 阳极缓冲液i i 2 5 r a mt r i s ，1 0 ( v v ) 甲醇，p i l l 0 4 3 阴极缓冲液 2 5 m mt r i s ，4 0 m m 甘氨酸，l o ( v v ) 甲醇，p h 9 4 4 p b s ( 0 0 1 m o l l ，p h 7 4 ) n a c l 8 9 n a 2 h p 0 42 9 9 k h 2 p 0 4 0 2 9 k c l 0 2 9 溶于1 0 0 0 m l 超纯水中 6 实验材料与方法 5 封闭液 b s a 5 9 t w e e n - 2 0 5 0 此 溶于1 0 0 m l 超纯水中 6 抗体稀释液 0 0 1 m o l l ，p h 7 4p b s 缓冲液中加入0 0 5 t w e e n 2 0 2 1 3 实验仪器 k f l o w 纯水机 a b l 0 4 - n 型电子分析天平 p h s 3 t c 精密酸度计 d h g - 9 0 7 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 电热恒温水浴锅 可调试移液器 u v - 2 8 0 2 p c s 紫外扫描仪 集热式磁力搅拌器 z f 2 5 8 全自动凝胶成像分析系统 凝胶电泳仪d y c p 4 0 c 型 c h l 7 6 0 b 电化学工作站 k q 3 0 0 b 型超声波清洗器 2 2 基于量子点的免疫印迹新方法的实验步骤 凯佛隆公司 上海m e t l l e rt o l e d o 集团 上海天达仪器有限公司 上海精宏实验设备有限公司 上海仪表集团供销公司 t h e r m ol a b s y s t e m s 公司 尤尼柯公司 金坛市荣华仪器制造有限公司 上海金鹏分析仪器有限公司 t h e r m o 公司 上海辰华仪器公司 昆山市超声仪器有限公司 2 2 1b s a 的还原变性 将1 6 5 m gb s a 溶于1 0 m l 双蒸水中，配制4 2 m g m l 硼氢化钠溶液，在搅拌条件 下向b s a 溶液中逐滴加入1 0 0 肛l 硼氢化钠溶液。室温下搅拌反应l h 反应结束后将其 放入6 0 8 0 4 c 水浴中加热直至没有气体放出，约需2 0 m i n ，以分解反应体系中过量的硼 氢化钠。b s a 经过硼氢化钠还原变性后，蛋白结构中的二硫键被打开，最终的d e n a t u r e d b s a ( d b s a ) 水溶液的浓度为5 1 0 巧m 2 2 2d b s a 的琥珀酰胺生物素化( n h s b i o t i n - d b s a 的制备) 将琥珀酰胺生物素( n h s b i o t i n ) 按2 0 m g m l 溶于二甲亚砜中，将d b s a 与n h s b i o t i n 按摩尔比1 ：3 0 进行混合，搅拌条件下反应2 h 。反应完成后将反应液移入超滤管中，以 6 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，以去除反应液中过剩的琥珀酰胺生物素。离心完将残留在超滤管 膜上的溶液取出，用p h 7 4 的p b s 缓冲溶液回复原体积。操作完成后紫外扫描仪对d b s a 的琥珀酰胺生物素化结果进行鉴定。 7 江南大学硕士学位论文 2 2 3 生物素化的变性b s a 包裹量子点 测得碲化镉( c d t e ) 的p h ，用n a o h 调节超纯水的p h 与c d t e 的p h 相同，然后 用该n a o h 水溶液透析量子点，以去除其中游离的巯基乙酸。 将d b s a 和量子点按一定的摩尔比( 1 ：1 ，l ：2 ，1 ：4 ，l ：6 ) 混合均匀，于6 0 8 0 水浴加热1 5 r a i n 。然后室温下静置两天，使包裹反应完全。 用s d s p a g e 及荧光扫描对量子点的包裹结果进行鉴定。 s d s p a g e 条件：8 分离胶，4 浓缩胶，电压：1 0 0 v ，时间：1 2 h 。 2 2 4 亲和素化荧光量子团的制备 将亲和素与荧光量子团按摩尔比4 ：l 反应l h ，4 0 0 0 r r a i n 离心5 m i n ，去上清，用 p h 7 4p b s 复溶沉淀即得。 2 2 5s d s - p a g e 变性凝胶电泳 纯蛋白样品处理：将蛋白样品稀释至特定浓度，加入等量的变性电泳样品稀释液， 在沸水中加热3 - 5 r a i n ，以使蛋白质变性完全，再在室温下放置1 0 m i n ，待样品冷却后， 将其置于离心机中，以1 3 ，0 0 0 r m i n 的速度离心5 m i n ，最后取上清液进行电泳分析。 2 2 6w e s t e r nb l o t t i n g 转移蛋白 1 将凝胶电泳去除浓缩胶部分，在2 0 0 m l 阴极缓冲液中浸泡1 5 r a i n 于电极缓冲液中浸 泡1 5 r a i n 。 2 取滤纸6 张，剪成与凝胶一样大小。在阳极缓冲液i 中浸泡两张滤纸，阳极缓冲液i i 中浸泡一张滤纸，阴极缓冲液中浸泡三张滤纸，时间均不少于3 0 s 。 3 将p v d f 膜裁剪成与凝胶一样大小。在甲醇中浸湿膜约1 5 s ，此时膜应该均匀地由 不透明变为半透明，小心地将膜移入超纯水中浸泡2 m i n ，再将膜放入阳极缓冲液i i 中平衡至少5 m i n 。 4 将半干式转印槽的阳极板置于水平实验台上，然后依次将两张浸透阳极缓冲液i 的 滤纸、浸透阳极缓冲液i i 的滤纸、处理后的膜、凝胶、浸透阴极缓冲液的三张滤纸 放在阳极板的电极板中央，最后将阴极板放到叠层上。 5 连接好电源，以2 0 m a c m 2 ，转移4 0 m i n ，即可达到转移蛋白的目的。 2 2 7 蛋白质鉴定( 免疫检测) 1 转移成功后的p v d f 膜在3 7 烘箱中干燥l h ，取出后用甲醇浸泡数分钟，用超纯 水洗净。 2 将膜置于培养皿中，加封闭液5 m l ，在室温振摇条件下对膜进行封闭1 h 。 3 去除封闭液，用p h 7 4p b s 洗涤p v d f 膜，5 m i n 次，洗涤3 遍，加一抗【用抗体稀 释液稀释) 3 m l 在室温振摇反应1 h 。 4 去除一抗反应液，用p h 7 4p b s 洗涤p v d f 膜，5 m i n 次，洗涤3 遍，加生物素标记 8 兰墼塑垫量查垫 的二抗佣抗体稀释液稀释) 3 m l 室温振摇反应1 h 。 5 去除一抗反应液，p h 74p b s ，5 m i t # 次，洗涤3 遍，最后加亲和素标记的聚合量子 点佣p b s 缓冲液稀释) 3 m l 反应2 h 。 6用p b s ，5 m l , d 次充分洗涤后，用全自动凝胶成像分析系统对结果进行拍照及数据处 理。待测蛋白量越多，对应的反应上的聚合量子点越多，所得积分光密度值越高。 7图2 - 1 即为聚合量子点形成过程的示意图和聚合量子点反映到p v d f 膜上的反应示 意图。 毋户， a d 8 s a 气矿 l 。簿一篱 p o l v0 0 s a )b ) 图2 - 1 为制备聚合量子点濂程图( a ) 及聚合量子点在免疫印迹分析中的反应示意圈( b ) 2 f i g u r e l - 1s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e p r e p a r a t i o n o f p o l y - q d s ( a ) a n d i t sa p p l i a n c e i n w e $ t e l x l b l o t ( b ) 2 2 8 优化实验 1 ) 转移电流、时间 根据蛋白分子量选择一定范围内的三组电流、时间如表2 - 1 ，在d y c p 一4 0 c 型电泳 槽进行蛋白转移。 表2 - 1 蛋白转移电流、时间。 tamel2lt h e d t i m e o f p r o t e i n t r a a s f m i a g 转移完成后，加入相应一抗、h r p 标记二抗溶液分别反应l h ，然后用二氨基联苯 胺( d a b ) 进行染色，以确定转移效果。 江南大学硕士学位论文 2 ) 封闭液选择 目标蛋白转移到p v d f 膜后，取三条同样上样量的蛋白转移后的p v d f 膜，在同一 批次其他条件均一样条件下进行封闭液的选择。本实验选了三种常用的封闭液：5 酪 蛋白加0 0 5 t w e e n 2 0 、5 脱脂奶粉加0 0 5 t w e e n 2 0 、5 b s a 加0 0 5 t w e e n 2 0 进行 比较，选取背景值最小的封闭液。 3 ) 一抗浓度选择 将一抗用抗体稀释液分别稀释2 0 0 、4 0 0 、6 0 0 、1 2 0 0 倍在同一批次其他条件均一样 条件下进行实验，从反应后荧光强度比较得出一抗最佳浓度。 4 ) 生物素化二抗浓度选择 将生物素化化二抗用抗体稀释液分别稀释1 0 0 0 、4 0 0 0 、1 6 0 0 0 倍，在同一批次其他 条件均一样条件下进行实验，从反应后荧光强度比较得出生物素化二抗最佳浓度。 5 ) 一抗反应时间选择 选择一抗反应时间o 5 h 、1 h 、2 h ，在同一批次其他条件均一样条件下，分别进行实 验，从反应后荧光强度比较得出一抗最佳反应时间。 6 ) 生物素化二抗反应时间选择 选择生物素化二抗反应时间0 5 h 、l h 、2 1 1 ，在同一批次其他条件均一样条件下，分 别进行实验，从反应后荧光强度比较得出生物素化二抗最佳反应时间。 7 ) 反应体系p h 选择 分别设定反应体系p h 为6 4 、7 4 、8 4 ，在同一批次其他条件均一样条件下，分别 进行实验，从反应后荧光强度比较得最佳反应体系p h 。 8 ) 聚合量子点反应时间选择 选择聚合量子点反应时间0 5 h 、l h 、2 h ，在同一批次其他条件均一样条件下，分别 进行实验，从反应后荧光强度比较得出聚合量子点最佳反应时间。 9 ) 聚合量子点反应浓度选择 将聚合量子点分别稀释5 0 0 、1 0 0 0 、2 0 0 0 倍，在同一批次其他条件均一样条件下进 行实验，从反应后荧光强度比较得出聚合量子点最佳浓度。 2 2 9 标准曲线的建立 将已知含量的待测样品的标准品配成由高到低6 个浓度，按照以上步骤在优化后的 最佳条件下进行反应，根据凝胶成像仪测定结果，以绝对蛋白质量为横坐标，以所测积 分光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2 2 1 0 实际样品检测及回收率计算 实际样品处理：实际样品为用p r o t e i n a 免疫吸附纯化柱纯化的抗体，用紫外扫描鉴 定出洗脱液中的蛋白含量，把样品均稀释到l m g m l 。每个样品取l ou l 于p e 管中，并 加入相同体积的变性电泳样品稀释液，混合均匀。将混匀的样品置于沸水中1 5 m i n ， 再在室温下放置1 0 m i n ，待样品冷却后，将其置于离心机中，以1 3 ，0 0 0 r r a i n 的速度离心 1 0 实验材料与方法 5 m i n ，最后取上清液进行分析检测。 根据待测蛋白样品分子量选择合适的分离胶及浓缩胶浓度。配制相应的分离胶、浓 缩胶。 添加回收率计算：在已测定含量的三个样品中分别添加蛋白a 标准蛋白，使得添加 终浓度分别为1 0 p g m l 、1 0 0p g m l 、5 0 0p g m l 然后根据以上步骤进行检测。并按照公 式进行回收率的计算。 添加回收率= 壁曼苎堡堕垂坠羔鼍萎盂箬丝旦堂1 。 2 2 1 1 检测限的计算 该检测方法的检测限( l o d ) 由公式：l o d - - 3 3 s d s 算得，s d 为响应值的标准偏 差，s 为标准曲线的斜率。 2 2 1 2 与商品化试剂盒的比较 在同等绝对蛋白质量情况下与将基于聚合量子点的免疫印迹方法与商品化的试剂 盒( p i e r c eb i o t e c h n o l o g y , r o c k f o r d ，u s a ) 进行比较。试剂盒的操作步骤如下： 1 将蛋白转移完成的p v d f 膜用封闭液在室温摇匀状态下，封闭一小时。 2 去除封闭液，加入一抗，在室温摇匀下，反应1 h 。 3 将印记膜在洗液中洗涤2 遍。 4 使印记膜在洗液中摇晃洗涤，至少5 m i n 次，洗涤5 遍。 5 加入h r p 标记的二抗在室温下，摇晃反应l h 。 6 重复3 、4 步骤，去掉多余的酶标二抗。 7 准备底物液，将试剂1 和试剂2 等体积混合均匀，以o 1 2 5 叫c m 2 p v d f 膜加入到反 应容器中。室温反应l m i n 。 8 去除底物液，将印记膜取出，用纸巾小心将膜上的残留物擦掉，赶出可能存在于膜 与容器见得的泡。 9 摄取图像。 2 3 碳纳米管在免疫传感器中的应用实验步骤 2 3 1 电极的制作 在该实验中，一般都以单壁碳纳米管作为传感器制作材料，多壁碳纳米管传感器的 制作过程与单壁碳纳米管的操作过程一样。首先将单壁碳纳米管( s w n t s ) 分散在聚合物 聚苯乙烯磺酸钠( p s s ) 水溶液中，超声l o m i n ，促进s w n t s 的分散，其质量浓度为 5 0 m g m l 。p s s 不仅能很好地分散碳纳米管，还是一种高效的蛋白质稳定剂，当抗体结 合到碳纳米管间的间隙时，p s s 在这里恰当地发挥了它的作用，保证了传感器的货架期。 在6 m ls w n t s p s s 溶液中加入藻毒素抗体1 0 1 t l ，抗体终浓度为1 0 1 上g m l ，于振荡 器上混合均匀。将滤纸切成一定形状( 5 c r u x 0 5 e m ) ，置于碳纳米管抗体溶液中，使其 江南大学硕士学位论文 与溶液充分接触，静置1 0 m i n 后，取出滤纸片，冷冻干燥，以保持抗体最大的活性。重 复上述过程1 2 遍，将干燥好的自制电极置于4 冰箱保存。 2 3 2 微囊藻毒素的电化学检测 本实验采用c h i7 6 0 b 电化学工作站作为检测仪器，在2 v 初始电压、采样间隔o 0 0 1 s 条件下，以甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，制得的碳纳米管电极为工作电极组 成三电极系统。电解液为p h 7 4 ，浓度为o 1 m o l l 的p b s 缓冲液。 向烧杯中加入5 1 x l 不同浓度的藻毒素标准品，经过5 m i n 的反应后，立即用电化学 工作站进行i - t 曲线扫描。得到各浓度藻毒素标准品下的i - t 图，i - t 图谱的变化与微囊藻 毒素标准品浓度相对应。 通过电极与藻毒素标准品反应前后的s e m 图可以看出，电极表面发生了明显的变 化，反应后电极致密度不如反应前，因为电极中的抗体与抗原发生反应，使得碳纳米管 之间的间隙变大，这也是在不同浓度藻毒素标准品下电流减小的原因。可过不同浓度藻 毒素标准品反应后的电化学i - t 图可以明显看出。根据各浓度下的i - t 图绘制标准曲线。 2 3 3 扫描电镜( s e m ) 与原子力显微镜( 删) 用j s m6 3 8 0