（纺织工程专业论文）羊毛织物固定化溶菌酶抗菌整理研究.pdf

摘要 摘要 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 是专门作用子微生物细胞壁的水解酶。它广泛分布于动物、植物 和微生物中，具有抗菌性强、安全无毒、热稳定性好、作用范围广等优点，在食品、医 药、生物工程、化妆品等行业得到了广泛应用。国内外关于溶菌酶固定化的研究报导， 大多是通过吸附作用或戊二醛交联作用将其固定在无机材料上，而关于将其固定于纺织 品表面，并建立一种新型的纺织品抗菌方法还尚不多见。 本文首先研究了吸附法和戊二醛交联法对溶菌酶在羊毛织物上的固定化效果，并对 这两种固定化工艺进行了优化，在此基础上，对固定化溶菌酶的性质进行了研究。主要 内容包括酶的最适温度、最适p h 值、热稳定性、操作稳定性、贮存稳定性以及一些添 加助剂对酶活力的影响，同时对不同方法固定的溶菌酶进行了一系列表征，结果分析及 比较。最后，对固定了溶菌酶的羊毛织物的抗菌性能进行了测试。 试验结果表明：溶菌酶通过戊二醛交联固定在羊毛织物上，主要工艺条件为：戊二 醛浓度o 2 ，交联时间2 h ，溶菌酶用量5 9 l ，固定化时间6 h ，固定化p h 值7 0 ；静态 物理吸附法的工艺条件为：固定化p h 值7 0 ，溶菌酶用量5 9 l ，沉积时间o 5 h 。溶菌 酶经固定化以后，固定化酶的最适温度和游离酶相同，都是4 0 。c ；最适p h 与游离酶相 比有一点偏移，固定化酶为7 o ，游离酶为6 0 ；固定化溶菌酶在一定的条件下，可以被 重复使用；固定化酶的热稳定性优于游离酶的热稳定性；固定化酶的贮存稳定性好；抑 制剂对于固定化酶活力的影响比游离酶要小；金属离子对于固定化酶的抑制作用要小于 游离酶。通过红外、扫描电镜、考马斯蓝染色等技术对经吸附法和交联法在羊毛织物上 固定的溶菌酶进行了表征，证实溶菌酶的确固定在羊毛织物上。最终测得在最优工艺条 件下整理的羊毛织物抗菌性能良好，交联法的抑菌率高达8 0 9 5 ，吸附法的为5 6 1 9 ， 且交联法的耐沈涤性好。 关键词：溶菌酶；固定化；羊毛织物；戊二醛；性质；抗菌效果 a b s t r a c t a b s t r a c t l y s o z y m ew a sas p e c i a l i z e de n z y m ef o rd i s r u p t i o n o fm i c r o b i a lc e l l s i tw a sw i d e l y e x i s t e di nt h ea n i m a l s ，p l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m sw i t hs om a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha sp e r f e c t a n t i b a c t e r i a lp e r f o r m a n c e ，s a f e ，n o n t o x i c ，t h e r m a ls t a b i l i t y , a n de x t e n s i v eu t i l i z i n gr a n g e i t h a db e e nw i d e l ya p p l i e di nt h ef o o d ，p h a r m a c e u t i c a l ，b i o t e c h n o l o g y ，c o s m e t i c sa n do t h e r i n d u s t r i e s m a n ys c h o l a r sb o t h a th o m ea n db r o a dd i dl a r g en u m b e r so fs t u d i e so n i m m o b i l i z a t i o no fl y s o z y m e t h e yi m m o b i l i z e dl y s o z y m eo nd i f f e r e n tt y p e so fs u p p o r t sa n d h a dd i f f e r e n tp u r p o s e s b u tt h e r ew e r eaf e wr e p o r t so ni m m o b i l i z a t i o no fl y s o z y m eo nf a b r i c f o re s t a b l i s h i n gan e wm e t h o do fa n t i b a c t e r i a lt e x t i l e s t h ep r o c e s s e so fl y s o z y m ei m m o b i l i z e do nw 0 0 1f a b r i cw e r es t u d i e di nt h ep a p e ra n dt h e o p t i m a lc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o nw e r eo b t a i n e d o nt h i sb a s i st h ec h a r a c t e r i z a t i o n so f i m m o b i l i z e dl y s o z y m et h a tw a si m m o b i l i z e du n d e ro p t i m a lc o n d i t i o nw e r er e s e a r c h e d t h e m a i nc o n t e n t si n c l u d e dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp h ，t h e r m a ls t a b i l i t y ，o p t i o n a ls t a b i l i t y , s t o r a g es t a b i l i t ya n dt h ee f f e c t so fs o m ea d d i t i v e so na c t i v i t i e so fi m m o b i l i z e da n df l e e l y s o z y m e f i n a l l y ，t h ea r t i c l eg a v ear e s e a r c ho na n t i b a c t e r i a le f f e c to ft h ew o o lf a b r i cb y i m m o b i l i z e dl y s o z y m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z a t i o no f1 y z o z y m ew i t hw o o l f a b r i ca n dg l u t a r a l d e h y d ew e r ea sf o l l o w s ：w o o lf a b r i c w a sc r o s s - l i n k e dw i t ho 2 g l u t a r a l d e h y d ef o r2h o u r s ，l y s o z y m e5 9 l ，i m m o b i l i z a t i o nt i m e6 h ，i m m o b i l i z a t i o np h7 0 t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z a t i o no fl y z o z y m ew i t hw o o lf a b r i cb ya d s o r p t i o nw e r e a sf o l l o w s ：l y s o z y m e5 9 l ，i m m o b i l i z a t i o np h7 0 ，a d s o r p t i o nt i m e0 5 h t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo fi m m o b i l i z e dl y s o z y m ew a s t h es a m ea st h ef r e ee n z y m e t h eo p t i m u mp ho f i m m o b i l i z e dl y s o z y m ew a s7 0 ，c o m p a r i n gw i t ht h ef r e ee n z y m ep r e s e n t e dt h eo p t i m u mp h a t 6 0 u n d e rac e r t a i nc o n d i t i o n ，t h ei m m o b i l i z e dl y s o z y m ew a sr e u s a b l e t h et h e r m a la n d s t o r a g es t a b i l i t i e sa n dt h ee f f e c to fm e t a li o n so na c t i v i t yo f i m m o b i l i z e dl y s o z y m ew e r e b e t t e rt h a nt h o s eo ff r e ee n z y m e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y , i n f r a r e d r a yt e s tt e c h n i q u e s a n dt h eb r a d f o r dm e t h o dw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z el y s o z y m ei m m o b i l i z a t i o n a tl a s t ，t h e a n t i b a c t e r i a le f f e c tw a sa s s e s s e db yu s i n gs h a k ef l a s kt e s t t h er e d u c t i o np e r c e n t a g eo f s t a p h y l l o c o c c u sa u r e u sb yc r o s s l i n k i n gg o tt o8 0 9 5 ，a n dt h er e d u c t i o np e r c e n t a g eb y a d s o r p t i o nw a s5 6 19 t h ew a s h i n gr e s i s t a n c eb yc r o s s l i n k i n gw a s w e l l k e y w o r d s ：l y s o z y m e ；i m m o b i l i z a t i o n ；w o o lf a b r i c ；g l u t a r a l d e h y d e ；c h a r a c t e r i z a t i o n s ； a n t i b a c t e r i a le f f e c t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 翊煎鱼 日 期：甜p 纩 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 翻堡垒 导师签名： 日期： 生丛堡“ 第一章绪论 第一章绪论 1 1 羊毛织物的抗菌整理 羊毛是纺织工业的重要原料，具有弹性好、吸湿性强、保暖性好、光泽柔和等特点， 这些性能使毛织物具有各种独特风格。羊毛纤维及相关材料主要是由角蛋白构成的，角 蛋白是含硫蛋白质的复合体。尽管分子间存在的二硫键、盐式键和范德华力使毛纤维对 于蛋白水解酶的水解作用有较强的抵抗作用，但在适宜的温度和湿度条件下，羊毛纤维 会成为细菌和真菌生长的合适媒介，这会导致毛纤维降解【l 】。因此羊毛织物应该进行防 微生物处理，以避免微生物的生长和传播而造成毛纤维的损坏。 目前国内的抗菌织物主要由两种方法制j ! 导【2 - 3 】：( 1 ) 直接采用抗菌纤维制成各类织物； ( 2 ) 将织物用抗菌剂进行后整理加工以获得抗菌性能。在这两种抗菌加工中，后整理方法 约占7 0 。比较而言，前者抗菌效果持久，耐洗性好，但技术含量高，难度大，涉及领 域广，抗菌纤维生产较为不易，对抗菌剂要求高；虽然后者耐洗性及抗菌效果持久性较 差但是其加工处理较为简单，而且可供选择的抗菌剂范围广，纺织品不管是原料纤维还 是纱线或织物甚至成衣均可通过后整理方法获得抗菌功效，因此在目前上市的各类抗菌 织物中，以后整理加工的居多。 抗菌剂抑制或杀死细菌有几种方式，不同种类的抗菌剂，抗菌机理不同，可概括为 以下几种：( 1 ) 使细菌细胞内的各种代谢酶失活，杀死细菌；( 2 ) 与细胞内的蛋白酶发生 化学反应，破坏其功能；( 3 ) 抑制孢子生成，阻断d n a 合成，抑制细胞生长；( 4 ) 加快磷 酸氯化还原体系，打乱细胞f 常的生长体系；( 5 ) 破坏细胞内的能量释放体系：( 6 ) 阻碍 电子转移系统以及氨基酸转酯的过程；( 7 ) 通过静电场的吸附作用，破坏细胞壁而杀死细 菌【4 - 5 】。 目前用于羊毛织物抗菌整理的抗菌剂主要有无机、有机和天然抗菌剂三大类【6 】。在 这三类抗菌剂中有机抗菌剂耐热性较差，易分解；天然类抗菌剂耐热性较差，加工困难 且研究时间短，目前应用最为广泛的是具有耐热性好、抗菌谱广、有效期长的无机抗菌 剂。表1 1 对这三种抗菌剂进行了简单的归纳【7 】。 表1 1 抗菌剂的分类及其特点 t a b 1 1t h ec l a s s i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fa n t i b a c t e r i a la g e n t s 江南大学硕十学位论文 1 1 1 无机抗菌剂 无机类抗菌剂多为金属离子以及一些光催化抗菌剂和复合整理抗菌剂。无机抗菌剂 的组成主要包括载体与抗菌成份，其中载体不是抗菌成份，而是保证活性组份稳定，同 时具有缓释性。抗菌成份主要是一些金属离子，如a 矿、z n 2 + 、c u 2 + 、p d 2 + 、h 9 2 + 等以及 它们的化合物，通过与细菌中的细胞蛋白结合，使细菌变性或失活。考虑到安全性，常 选用a 矿、c u 2 + 、z n 2 + 。然而由于c u 离子带有颜色，影响织物外观；z n 离子抗菌性差， 其强度仅为a g 离子的1 1 0 0 0 t 引。因此，市场上商品化的绝大多数是载银的无机抗菌剂。 银系列抗菌机理主要分为接触抗菌和光催化抗斟9 1 。目前比较认可的是接触抗菌机理： a 矿与细菌接触后，凭借库仑引力牢固吸附在带负电荷的细胞膜上，并进一步穿透细胞 壁进入细菌内部，与其中的硫基反应，破坏细胞合成酶的活性，使细胞丧失分裂增殖能 力而死亡【l m 】，并且a 矿会从死菌体中游离出来继续杀菌，抗菌效果较为持久。银系列 抗菌剂存在的问题，主要是a 矿是强氧化剂，在空气中久置会和空气中的硫反应，颜色 会由浅棕色往棕色、深棕色、褐色、黑色等变化，使其应用受到很大局限；另外，a 矿 对细菌的抗菌效果最为有效，但对真菌和霉菌效果不是很好。这两点是以后对银系列抗 菌剂的研究重点。 1 1 2 有机抗菌剂 有机系列多为传统抗菌剂，以有机酸、酚、醇为主要成分，以破坏细胞膜、使蛋白 质变性、代谢受阻等为抗菌) 6 l n t l 2 】，其优点是杀菌力强、效果持久、来源丰富；缺点是 毒性大，会产生微生物耐药性、耐热性较差，易于迁移等。季铵盐类抗菌剂因其分子结 构可变性强，性能优良，合成简单，而且价格低廉、杀菌速度快，被人们广泛研究和利 用i l 引。最著名的是美国道康宁公司的d c 5 7 0 0 ，其活性成分的学名为3 ( - - 甲氧基硅烷基) 丙基二甲基十八烷基氯化物，有耐久性、安全性好及广谱抗菌的特点，与d c 5 7 0 0 结构 类似的商品3 ( 三甲氧基硅烷基) 丙基二甲基十四烷基季铵盐，性能类似。 一种有机抗菌剂对微生物的毒杀和抑制性能一方面取决于该抗菌化合物所带的能 够发挥毒性的基团；另一方面也与该化合物的取代基特性( 如亲油性和亲水性等) 、分子 中各原子及基团的排列、空间排布、分子反应性能等密切相关。有机抗菌剂的用量相对 较少，一般在1 0 - 6 级甚至在1 0 圆级就具有明显的抗菌效果。 1 1 3 天然抗菌剂 天然抗菌剂是人类使用最早的抗菌剂，包括壳聚糖、日伯醇、黄姜根醇、孟宗竹提 取物【l4 1 ，其主要抗菌机理与有机季铵盐类似。目前最常用的是壳聚糖。壳聚糖是目前自 然界中已经发现的唯一的天然碱性多糖，具有良好的抗菌性能、生物相容性、吸附性能， 无毒性，而且容易修饰和改性，容易加工成纤维、薄膜、颗粒等各种形态，使之能适应 各种环境应用的需要。由于壳聚糖具有良好的抗菌性能和广泛的抗菌谱，目i j 已经应用 于织物整理剂，赋予织物良好的抗菌性能。用壳聚糖整理剂处理得到的抗菌纤维和织物 具有优异的耐洗涤性制b 】，洗涤对抗菌织物的抗菌性没有明显的影响。 2 第一章绪论 1 2 溶茵酶 溶菌酶又称细胞壁质酶或n 乙酰胞壁质聚糖水解酶。1 9 2 2 年英国细菌学家 a f l e m i n g 在人的唾液、眼泪中发现存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用， 故命名为溶菌酶【l6 1 。此后在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现 了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入，发现不仅有溶解细菌细胞壁的溶菌酶，还有作 用于真菌细胞壁的种类，同时对其作用机制也有了更进一步的了解。近几年，人们根据 溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐、畜牧及生物工程中，具有一定的应用 价值。 1 2 1 溶茵酶的分类 溶菌酶根据其作用的微生物种类可分为两大类【l6 1 ，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞 壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶有两种，一种是作用于p 1 ，4 糖苷键的细胞壁溶解酶，另一 种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶 解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以 找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多，其它植物组织及微生物细胞中也存在。 根据来源不同，其性质及作用机制略有差异。 ( 1 ) 鸡蛋清溶菌酶 鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3 4 3 5 ，作为溶菌酶类的典型代表，是目前重点 研究的对象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由1 8 种1 2 9 个氨基酸残基组成，具有4 个 s s 键，分子量为1 4 0 0 0 ，等电点为1 1 1 ，最适温度为5 0 ，最适p h 值为6 7 ，其化学性 质非常稳定，在p h i 2 1 1 3 范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也很稳定，在 p h 4 7 、i o o 处理l m i n 不失活，是一种稳定的碱性蛋白质。 ( 2 ) 人及哺乳动物溶菌酶 人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、肾、 淋巴组织中，l m l 眼泪中含7 m g 溶菌酶，1 m l 乳汁中含0 1 0 5 m g 。人溶菌酶由1 3 0 个氨 基酸残基组成，有4 个s s 键，分子量为1 4 6 0 0 ，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3 倍。对于 哺乳动物溶菌酶，目前已从牛、猪、猫、兔、猴、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶， 其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性也远低于人溶菌酶约3 0 0 0 倍。 ( 3 ) 植物溶菌酶 目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为 2 4 0 0 0 2 9 1 0 0 。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1 3 ，但对胶 体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的1 0 倍。 ( 4 ) 微生物产生的溶菌酶 目前微生物产生的溶菌酶分为7 类：( 1 ) 内n 乙酰已糖胺酶，此酶作用机理与鸡蛋 清溶菌酶相同，破坏细菌细胞壁肽聚糖中的b 1 ，4 糖苷键；( 2 ) 酰胺酶，切断细菌细胞壁 肽聚糖中n a m 与肽“尾”之间的n 乙酰胞壁酸，l 丙氨酸键；( 3 ) 内肽酶，使肽“尾”及肽 “桥”内的肽键断裂；( 4 ) p 1 ，3 、p 1 ，6 葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞 3 江南大学硕七学位论文 壁；( 5 ) 壳多糖酶，与葡聚糖酶共同作用，可分解霉菌和酵母；( 6 ) 磷酸甘露糖酶，与葡 甘露糖酶共同作用，可分解原生质；( 7 ) 脱乙酰壳多糖酶，主要分解毛霉和根霉。 ( 5 ) 噬菌体产生的溶菌酶 该酶是一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿主细胞上不存 在该酶。 1 2 2 溶茵酶的功能 1 2 2 1 抗菌消炎 溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶，此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之 一，该酶能催化水解细胞壁中的n 一乙酰胞壁酸和n 乙酰氨基葡萄糖之间的b 1 ，4 糖苷键， 使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直 接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白a 、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌 如大肠杆菌等。此外，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，同时能增强 抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目 的【1 7 】。 1 2 2 2 抗病毒 溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与d n a 、r n a 、脱辅基蛋白形成复盐， 使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果 较为显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性，其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病 毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感梨17 1 。 1 2 2 3 增强免疫力 溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功 能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。可改善和增强巨嗜细胞吞噬和 消化功能，激活白细胞吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强 机体的抵抗力【1 7 】。 1 2 2 4 其它方面的药理作用 溶菌酶还具有激活血小板的功能，可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增 强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对 组织局部起保护作用【1 7 】。 1 2 2 5 促进双歧乳酸杆菌增殖 溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴 儿消化吸收，可以促进人工喂养婴儿肠道细菌的正常化；能够加强血清灭菌蛋白 ( p r o p e r d i n ) ，丫一球蛋白( 丫一g l o b u l i n ) 等体内防御因子对感染的抵抗力，特别对早产婴儿有防 御体重减轻、预防消化器官疾病等功效【1 7 】。 1 2 3 溶菌酶的抗菌机理 细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由n - 乙酰氨基葡萄糖( n a c e t y l g l u c o s a m i n e ) 及n 一乙酰胞壁酸( n a c e t y l m u r a m i ca c i d ) 交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽， 4 第一章绪论 称为肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ) 。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，它是由n a m 、n a g 和 肽“尾”( 一般是4 个氨基酸) 组成，n a m 与n a g 通过p 1 ，4 糖苷键相连，肽“尾”则是通过 d 乳酰羧基连在n a m 的第3 位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”( 肽键或少数几个氨基酸) 连接，n a m 、n a g 、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的 骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤【l7 1 。溶菌酶能有效地 水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是n 乙酰胞壁酸( n a m ) 的1 位碳原子和n 乙酰 葡萄糖胺( n a g ) 的4 位碳原子间的p 1 ，4 糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对 细胞的保护作用，最后细胞溶解死亡1 1 引。 对于g + 细菌与g 细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，g + 细菌细胞壁几乎全部由肽 聚糖组成，而g 细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶只能破坏g + 细菌的细胞壁， 而对g 细菌作用不大。 1 3 酶的固定化 上世纪6 0 年代，一项新的技术：固定化酶技术丌始发展起来。最初主要是将水溶 性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，称为“水不溶酶”或“固相酶”。 后来发现，也可以把酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。把酶置于超滤装置中时，高分 子底物与酶被截留在超滤膜一侧，而反应物可以透过膜流出，在这种情况下，酶自身仍 是可溶的，只不过被固定在一个很有限的空间内，因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰 当。1 9 9 7 年第1 届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称【l 9 1 。 酶在水溶液中一般不太稳定，并且酶只能与底物作用一次，使用起来很不方便。而 将酶固定在各种载体上使用具有重要意义：( 1 ) 当酶被固定时，可以很快的从反应混合物 中分离，并能重复使用；( 2 ) 对固定化酶的微环境进行合理的控制，可增强其稳定性【2 0 1 。 1 3 1 酶的固定化方法 从上世纪6 0 年代起，固定化酶的研究迅速发展，固定化方法目前已超过2 0 0 种以 上【1 9 】。酶的固定化方法大致可分以下几类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法。 ( 1 ) 吸附法 经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物酶固定，称为吸附法。吸附法是最 简单、最具经济吸引力的方法，操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可以同时 达到纯化和固定化的目的，且酶失活后可重新活化再生【1 9 2 0 1 。吸附的牢固程度与溶液的 p h 值、离子强度、温度、溶剂性质和利，类以及酶的浓度有关【l 9 ，2 1 】。所以为了得到最好 的吸附并保持最高的活性，控制实验条件十分重要。吸附法分为物理吸附法和离子交换 吸附法。常用的载体有无机载体、有机载体、有机大分子物质等 1 9 2 0 1 。 ( 2 ) 包埋法 包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内，这种结构可以防止酶渗出，但底物 能渗入格子内与酶相接触。此法的优点是适用范围广，许多酶都可用此法固定，工艺简 便，酶分子仅仅是被包埋起来，固定化过程中酶未参与化学反应，故可得到活力较高的 江南人学硕士学位论文 固定化酶【1 9 2 0 1 。但是，用此法制成的固定化酶，不能对大分子底物的生化反应起催化作 用。包埋法分为凝胶包埋法和微囊化法( 界面聚合法、分相法、流体干燥法、流膜法) 【1 9 2 0 1 。 ( 3 ) 共价键结合法 共价键结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化 学共价键连接，以固定酶的方法。通常要求在低温( o ) 、低离子强度和生理p h 值条件 下进行，并通常加入酶的底物以防止酶的活性部位于电位表面发生键合。由于酶和载体 间连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性，但因反应条件较为剧烈， 酶活性有所降低，且制备过程较繁琐。酶和载体的共价键合有三种方式：( 1 ) 与载体直接 反应连接；( 2 ) 通过同源双功能试剂与载体连接；( 3 ) 通过异源双功能试剂与载体连接后 再与载体反应连接【2 0 1 。 ( 4 ) 交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间形成共 价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内 交联【2 0 1 。交联剂有多种，最常用的是戊二醛。其它交联剂有异氰酸衍生物、双氮联苯、 n ，n 聚甲烯双碘丙酮酰胺和n ，n 乙烯双马来酰亚胺等【撙】。此法的缺点是可能使酶活性 降低，很少单独使用，般与其它方法联合使用【2 2 1 。 各种固定化方法的优缺点比较见表1 2 所示【旧】。 表1 2 各种固定化方法的优缺点比较 t a b 1 - 2a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so ft h ev a r i o u si m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s 1 3 2 固定化酶的性质变化 将酶固定化制成固定化酶后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化【2 3 】。 ( 1 ) 稳定性 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：( 1 ) 对热的稳定性高，可 以耐受较高的温度。( 2 ) 贮存稳定性好，可以在一定条件下贮存较长的时间。( 3 ) 对蛋白 酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。( 4 ) 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和 盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等2 3 1 。 ( 2 ) 最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能变化也不大。但有些固定化 酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。可能是受到固定化方法和固定化载体的 影响，使用时要注意【2 3 1 。 6 第一章绪论 ( 3 ) 最适p h 值 酶经固定化后，其作用的最适p h 值会发生一些变化。影响固定化酶最适p h 值的 因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质【2 3 1 。 ( 4 ) 底物特异性 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有 一定的关系。对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。 而对于那些既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物 特异性往往会发生变化。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起 的。酶固定在载体上以后，使得大分子底物难于接近酶分子而催化速度大大降低，而分 子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不 刚2 3 1 。 1 4 本论文的目的、意义及研究内容 1 4 1 研究的目的和意义 目前在羊毛织物抗菌整理中应用的三类抗菌剂，各有其优缺点。传统的有机抗菌剂 效果好，品种多，但由于在抗菌谱、耐热耐候性、持效性、使用安全性、细菌耐药性等 方面存在局限性，使得其在某些场合的应用受到了限制。天然类抗菌剂，如某些杀菌植 物、矿物，其应用范围窄，多数严重影响织物的色光。无机类抗菌剂耐热性好，但用于 纺织品后整理难以获得耐久的效果，并且大部分品种存在重金属毒性问题【2 4 1 。 现阶段对抗菌纺织品的要求主要是具有高效广谱的抗菌能力；抗菌效果持久，耐洗 涤，耐磨损，寿命长；耐热，耐同照，不易分解失效，柔软、透湿、舒适性佳；使用安 全，对健康无害，不会对环境造成污染。抗菌整理剂的理想特征【2 5 】是：( 1 ) 具有优良 的抑制、杀菌、消毒和除臭的功能，具有广谱抗菌效果。( 2 ) 抗菌效果耐久性强，耐漂洗 和同晒。( 3 ) 对人体不产生副作用，无毒，不污染环境。( 4 ) 不影响纺织品本身的风格特 征，不损伤纤维，不影响其他纺织助剂的功效。( 5 ) 抗菌整理剂的使用方法简便，成本低， 与其他整理剂具有相容性。 在环保呼声日益高涨的今天，越来越多生物酶技术应用于纺织行业。溶菌酶是一种 天然的防腐剂，具有抗菌性强，安全无毒，热稳定性好，作用范围广等无可比拟的优势 【2 6 1 。它是专门作用于微生物细胞壁的水解酶，能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖。其水 解位点是n 乙酰胞壁酸( n a m ) 的l 位碳原子和n 乙酰葡萄糖胺( n a g ) 的4 位碳原子间的 b 1 ，4 糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最后细胞溶解死亡。 关于溶菌酶的应用有很多【l6 1 ，溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性 免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，目前日本已生产 出医用溶菌酶，其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结 构的功能，以此酶处理g + 细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中 细胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定 的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、 7 江南大学硕士学位论文 料酒及饮料中的防腐：还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的 生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。国内外对溶菌酶进行了较深入的 研究，关于溶菌酶的固定化就有很多【2 7 铷】。但由于不同溶菌酶的抑菌谱不同，所以各国 都极力发掘出更多品种优良的溶菌酶，其中海洋溶菌酶是一个研究的热点。对于溶菌酶 的发展，可以预见在2 l 世纪它将发挥越来越大的作用。 基于溶菌酶的抗菌特性，若将其固定于纺织品表面，有望建立一种新型纺织品抗菌 方法，拓展生物酶在纺织品中的应用。并且酶固定化后，其性能、作用条件和作用环境 都会有一定程度的改变，可以更好的利用。 1 4 2 研究的主要内容 由于羊毛纤维是一种蛋白质纤维，溶菌酶也是一种蛋白质。通过戊二醛的交联作用， 其分子一端的醛基与羊毛载体上的氨基进行反应，另一端醛基再与酶分子上的氨基发生 反应，从而实现酶分子的化学交联固定。同时羊毛织物还可以通过吸附法将溶菌酶进行 固定。所以本文主要通过吸附法和戊二醛交联法将溶菌酶固定在羊毛织物上，使之达到 良好的抗菌效果。主要内容有以下几个方面： ( 1 ) 研究了通过吸附法和戊二醛交联法固定溶菌酶的固定工艺。 ( 2 ) 对经吸附法和交联法在羊毛织物上固定的溶菌酶进行了一系列表征，通过红外、 扫描电镜、考马斯蓝染色等技术，对固定化结果进行分析及比较。 ( 3 ) 对固定化溶菌酶的性能与游离酶进行了比较，考察了酶的最适温度、最适p h 值、 热稳定性、操作稳定性、贮存稳定性、以及一些添加剂对酶活性的影响等。 ( 4 ) 对于固定溶菌酶后的羊毛织物进行了抗菌效果测试与耐洗涤性测试。 8 第二章试验材料、仪器和方法 第二章试验材料、仪器和方法 2 1 试验材料 载体材料：羊毛织物( 全毛华达呢) ，2 2 0 9 m 2 ，无锡协新毛纺厂。 溶菌酶：1 2 0 0 0 u m g ( i q p _ 品) ，广西庞博生物工程有限公司。 底物：微球菌粉( m l y s o d l e i k t i c u s ) ，南京建成生物工程研究所。 试验药品及试剂：3 0 过氧化氢、硅酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、 甘氨酸、醋酸钠、醋酸、乙醇、氯化钡、氯化钙、氯化铜、e d t a 、氯化镁、硫酸铝、 硫酸铁、氯化钠、氯化钾、尿素、考马斯亮蓝g 2 5 0 、磷酸均为分析纯( a r ) ；十二烷基 硫酸钠为化学纯( c p ) ；润湿剂j f c 、阳离子1 2 2 7 、正章丝毛洗涤剂为工业级；2 5 戊二 醛、蛋白胨、琼脂粉、牛肉浸膏为生化试剂。 2 2 试验仪器 表2 1 试验仪器 t a b 2 - 1a p p a r a t u so f e x p e r i m e n t a t i o n 2 3 试验及测定方法 2 3 1 游离溶菌酶活力的测定 测定原理：溶菌酶溶解细菌的细胞壁，从而降低细菌悬液的浊度，可以用分光光度 计测定这一反应【37 1 。 9 江南大学硕士学位论文 酶活力定义：一个溶菌酶单位相当于在规定条件下于4 5 0 n m 处每分钟使吸光度降低 0 0 0 1 时所需的酶量。酶活力的单位通常用u m g 来表示。 ( 1 ) 磷酸盐缓冲液( p h = 6 2 4 ) 的配制：将0 1 m o l l 磷酸氢二钠和0 1 m o l l 磷酸二氢钠 溶液按l ：3 加以混合，p h 值= 6 2 4 。 ( 2 ) 底物的配制：取一定量的菌粉加入少量浓度为0 1 m o f l 磷酸盐缓冲液( p h = 6 2 4 ) ， 在玻璃匀浆管中研磨3 - 5 m i n ，倾出并稀释，至悬液吸光度值( x = 4 5 0 n m ) 在1 3 左右。 ( 3 ) 酶溶液的配制：称取一定量的溶菌酶溶于p h 为6 2 4 的磷酸盐缓冲液中，配制酶 浓度为l m g m l 的酶溶液。每次吸取o 1 m l 浓度为l m g m l 的酶溶液用磷酸盐缓冲液稀 释至1 0 m l ，此时酶浓度变为0 0 1 m g m l ，则0 5 m l 酶液中含有酶的重量为0 0 0 5 m g 。 ( 4 ) 操作步骤：打开分光光度计，调波长至0 4 5 0 n m 处预热。将一定量的微球菌粉溶解 于一定量的磷酸盐缓冲液( p h = 6 2 4 ) 中，使吸光度值在1 3 左右，此底物溶液于2 5 c 水浴 中保温。用l c m l l 色皿装2 5 m l 底物于水浴中，测定o d 4 5 0 值，此时为零时读数。加入0 5 m l 游离酶的酶液，迅速摇匀，从加入酶液起计时，记下反应1 5 s 时的读数e l 以及反应7 5 s 时 的读数e 2 ，空白值用浓度y o o 1 m o l l 的磷酸盐缓冲液( p h = 6 2 4 ) 3 8 。3 9 】。根据公式( 2 1 ) 计算 酶的活力【3 7 铷】。计算公式如下： 溶菌酶活力( u m g ) = 石丽a i o 甭d 霭4 5 0 ( 2 1 ) a o d 4 5 r 一微球菌液在4 5 0 r i m 处1 5 s 时的吸光度值与7 5 s 时的吸光度值之差； 样品量一每0 5 m l 酶液中含溶菌酶的毫克数。 2 3 2 固定化溶茵酶活力测定 将一定量的微球菌粉用o 1 m o l l 磷酸盐缓冲液( p h = 6 2 4 ) 稀释，于2 5 。c ，4 5 0 n m 的 波长下测吸光度值为0 6 0 8 之间作为底物，每2 5 m l 微球菌液加入两片羊毛织物( 直径 为l c m ) ，通过微球菌液的浊度变化来确定羊毛织物上固定化溶菌酶的活性【2 。 固定化溶菌酶活力单位定义：每平方厘米羊毛织物使a o d 4 5 0 下降0 0 0 1 为一个活 力单位( 2 5 c ，p h = 6 2 4 ) 。 固定化溶菌酶活力( u c m 2 ) ：a 0 9 4 i 5 0 x 一10 00(2-2) a o d 4 5 0 ：4 5 0 n m 处微球菌液每分钟吸光度的变化； s ：加入羊毛织物的面积( c l i l 2 ) 。 2 3 3 溶菌酶的固定化方法 2 3 3 1 戊二醛交联法 ( 1 ) 羊毛织物预处理 采用h 2 0 2 ( 3 0 ) 对羊毛织物进行氧化预处理，工艺处方如下：h 2 0 24 0 m l l ，n a 2 s i 0 3 3 5 l ，j f c1 0 9 l ，5 0 。c 、p h = 8 8 5 ，时间3 5 m i n ，浴比1 ：5 0 。氧化预处理之后用去离 子水充分洗涤，晾干备用。 ( 2 ) 戊二醛交联 将羊毛织物剪成直径为lc m 的小圆片，浸渍于0 2 的戊二醛溶液中，于2 5 c 水浴恒 l o 第二章试验材料、仪器和方法 温振荡器中低速振荡6 d , 时，取出后用去离子水充分洗涤3 - 4 次。 ( 3 ) 溶菌酶固定化 将上述经戊二醛处理后的羊毛织物置于浓度为5 9 l 的溶菌酶缓冲溶液( p h = 7 o ) 中， 于4 c 反应6 d 时后，取出用去离子水充分洗涤，低温风干并置于4 。c 的冰箱中贮存备用。 共价偶联酶固定反应方程式见图2 3 。 2 邮3 c h 。一一n - c h - 2 删。 当一n - c h - ( o h 2 卜c h _ n e 酶 ( 2 3 ) 2 3 3 2 吸附法 ( 1 ) 羊毛织物氧化预处理，工艺处方同戊二醛交联法中的预处理相同。 ( 2 ) 溶菌酶固定化 将经预处理的羊毛织物浸泡于浓度为5 9 l 的溶菌酶缓冲溶液( p h - - 7 0 ) 中o 5 h ，溶 菌酶分子在羊毛纤维表面通过静电吸附和重力沉降作用实现其固定化。 2 3 3 3 考马斯亮蓝试验 蛋白试剂考马斯亮蓝g 2 5 0 的配制：称取1 0 0 m g 考马斯亮蓝g - 2 5 0 ，溶于5 0 m l 9 5 的乙醇中，加入8 5 的( w v ) 的磷酸1 0 0 m l ，最后用蒸馏水定容到1 0 0 0 m l 。 取相同大小的未经任何处理的羊毛织物、只双氧水预处理的羊毛织物、吸附法固定 溶菌酶的羊毛织物、只戊二醛交联的羊毛织物和交联法固定溶菌酶的羊毛织物五种样 品，分别加到2 0 m l 考马斯亮蓝g 2 5 0 溶液中，在室温下反应5 m i n 后取出水洗2 次， 室温晾干，用数码相机拍照。 2 3 4 固定化溶茵酶的性质 在下面的一系列实验中所用的固定化溶菌酶都是为戊二醛交联法在优化