干细胞和细胞治疗.pptVIP

1,干细胞和细胞治疗stemcellandcelltherapy,2,干细胞stemcell,未分化细胞自我更新(self-renew)无限增殖体外长期培养多向分化潜能(multipotential),3,4,干细胞的类型：,胚胎干细胞embryonicstemcells胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞，有自我更新和多向分化潜能，可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。成体干细胞adultstemcells成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞，包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞，因此又称为组织干细胞。如神经干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞等。,5,胚胎干细胞embryonicstemcells（es细胞）,6,胚胎早期发生：囊胚形成（囊胚内细胞团）,7,排卵、早期胚胎发生(囊胚形成),8,胚胎干细胞的分离和建系,将囊胚内细胞团的细胞通过体外培养产生未分化的细胞克隆，建立胚胎干细胞系1981年evans和martin首次成功分离和建立小鼠胚胎干细胞系1998年thomson等首次成功分离和建立人胚胎干细胞系胚胎干细胞可在体外诱导分化形成各种成体细胞,9,胚胎干细胞体外诱导分化,外源诱导因子诱导es细胞分化诱导因子：维甲酸(ra)、骨形成蛋白bmps)、成纤维细胞生长因子(fgfs)等转基因诱导es细胞分化用转基因技术使某种促分化基因在es细胞中表达、调节其分化与其他细胞共培养诱导es细胞分化创造细胞分化的微环境,10,胚胎干细胞体外诱导分化,11,成体干细胞adultstemcells又称组织干细胞tissuestemcells,12,成体干细胞的概念,成体干细胞又称组织干细胞，传统的观念认为它们是存在于成体组织的未分化细胞，现在认为也包括未成年动物的组织干细胞，它们具有不断增殖和自我更新能力、又具有多向分化潜能。如造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、上皮干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞等,13,成体干细胞的功能,自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的细胞，参与组织更新和损伤修复；外界条件诱导下成体干细胞可横向分化成其他组织的细胞，参与这些组织的损伤修复。,14,造血干细胞的分化,15,表皮干细胞的分化,16,干细胞应用前景,细胞治疗组织工程药物筛选发育研究基因功能研究,17,细胞治疗celltherapy,细胞治疗是指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内，以达到替代受损细胞、治疗疾病的目的。利用干细胞及其分化细胞进行细胞治疗是干细胞临床应用的重要研究方向。胚胎干细胞和成体干细胞都能用于细胞治疗，但目前只有少数成体干细胞在细胞治疗上己开始取得临床疗效，大多数的干细胞治疗还在实验阶段。,18,血液病的细胞治疗,如白血病的细胞治疗造血干细胞移植：自体移植（脐带血造血干细胞）无排斥反应同系移植（同卵孪生之间骨髓造血干细胞）一般无排斥反应同种移植（人与人之间骨髓造血干细胞）有排斥反应（供、受者组织相容性抗原不同）需组织配型、选择供者（骨髓库）；抑制受者的免疫应答、诱导免疫耐受。,19,神经系统疾病的细胞治疗,如帕金森氏病细胞治疗胚胎干细胞细胞移植神经干细胞细胞移植1、干细胞直接移植2、诱导分化成相应神经细胞（多巴胺能神经元）后进行细胞移植,20,心肌疾病的细胞治疗,如心肌梗塞的细胞治疗胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞细胞移植成体干细胞（骨髓基质干细胞、脂肪干细胞、心肌干细胞等）诱导分化成心肌细胞细胞移植,21,干细胞治疗中的难点,异体移植的免疫排斥反应解决途径：自身体细胞核移植（治疗性克隆）干细胞基因改造采用自身干细胞成瘤性的危险胚胎干细胞植入动物体内会形成畸胎瘤，如何防止干细胞移植后可能因分化不彻底形成肿瘤，是必须解决的问题。解决途径：完善定向诱导分化方法改进筛选纯化技术,22,治疗性克隆（体细胞核移植）,23,我们实验室的一项工作,胰腺干细胞的细胞分化与i型糖尿病的干细胞治疗,24,i型糖尿病的治疗,外源胰岛素治疗胰腺或胰岛移植干细胞治疗：胚胎干细胞诱导分化成细胞细胞移植基因导入使其表达胰岛素细胞移植胰腺干细胞诱导分化成细胞细胞移植,25,胰腺干细胞的标志1990年，lendahl等人发现神经干细胞中存在一种新的中间丝蛋白巢蛋白（nestin），现在nestin已是公认的神经干细胞标志之一。2000年，hunziker和stein发现胰腺导管和胰岛中也存在nestin阳性细胞。2001年，zulewski等人从胰腺中分离到nestin阳性细胞，将其命名为nips（nestin-positiveislet-derivedprogenitorcells），并发现具有多向分化潜能(multipotential)，在体外可自发形成类胰岛细胞团（islet-likecellclusters,iccs）.因此，人们相信nestin可能也是胰腺干细胞的标志。但是，nips是否确实是胰腺干细胞，能否用于细胞治疗必须进一步证实。2001年起，我们为此做了一点实验。,26,我们的实验:,人胎胰腺nestin阳性细胞的分离、体外培养和生物学特性检测（目的是确认nips是胰腺干细胞）；体外诱导分化nips形成能产生胰岛素的细胞；类胰岛细胞团(iccs)异种体内移植糖尿病的干细胞治疗实验研究。,27,第一个实验：,人胎胰腺nestin阳性细胞(nips)的分离、体外培养和生物学特性检测,28,人胎胰腺的nestin阳性细胞的分布免疫组化技术显示nestin阳性细胞,nestin阳性细胞位于胰腺小导管壁及其相连的原始细胞团,分离胎胰导管和细胞团在ehaa培养液（含2%fbs）中进行原代培养,在ehaa培养液中的胎胰导管和细胞团,培养48小时后细胞贴壁并开始铺开,贴壁细胞鉴别：是否存在nips免疫荧光染色检测ck19、胰岛素、nestin阳性细胞,呈ck19阳性的胰腺上皮细胞（细胞较大),呈胰岛素阳性的细胞（细胞较小）,nestin阳性细胞(nips)（梭形）,31,nips的筛选培养和体外扩增贴壁细胞在无糖低血清条件培养液中筛选培养nips4周后大部分细胞死亡、仅存少量梭形细胞(nips),dmem/f12培养液中加生长因子bfgf促进梭形细胞(nips)体外扩增。亚克隆纯化、传代培养图为由单个梭形细胞(nips)的扫描电镜照片梭形细胞(nips)可在体外长期传代培养,nips的干细胞表型确定免疫组化在蛋白质水平检测nestin表达半定量rt-pcr在mrna水平检测nestin和干细胞标志基因abcg2表达,nestin,semiquantitativert-pcr,筛选培养的梭形细胞(nips)集落,免疫组化显示筛选培养的细胞均呈nestin阳性反应,半定量rt-pcr显示筛选培养的细胞表达nestin和abcg2,nestin,nips达到80%铺满时可自发形成小的iccs,nips能自发形成类胰岛细胞团(iccs).nips在dmem培养液(含11.1mm葡萄糖、10%fbs和20ng/mlbfgf)中培养,免疫组化显示这种iccs主要由nestin阳性细胞组成,rt-pcr显示这种iccs高水平表达abcg2和nestin,rt-pcranalysis,培养2周后形成的iccs大而致密,glucagon,nips具有多向分化潜能培养液中撤去bfgf使nips分化,rt-pcranalysis,免疫组化显示此时iccs表达glucagon,rt-pcr显示此时iccs有多种谱系基因的表达，具有向胰腺多种类型细胞分化的能力,35,这一实验结果表明：nips表达干细胞标志abcg2，能长期培养，有多向分化潜能，在细胞形态、生长行为和分化潜能上具有干细胞特征，因此可以认为是胰腺干细胞.,abcg2是abc运输蛋白（atpbindingcassettetransporter）家族成员，其功能是将细胞内的促分化因子泵出细胞以维持干细胞的未分化状态，现在认为它是干细胞状态决定因子。已有报道es细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、肌干细胞等均表达abcg2。,36,第二个实验：,体外诱导分化nips形成产生胰岛素的细胞；,培养10天后形成很多大而致密的iccs,insulin,诱导nips形成细胞nips在含高浓度葡萄糖(16.5mm)和多种诱导因子(igf,hgf,betacellulinandnicotinamide)的dmem培养液中培养,rt-pcranalysis,免疫组化显示iccs中有胰岛素阳性的细胞,此时iccs表达细胞的标志，但仍少量表达nips和其他细胞的标志,38,iccs的细胞内胰岛素含量磁性分离酶联免疫方法测定iccs的细胞内胰岛素含量,细胞诱导分化后的iccs(icc3)细胞内胰岛素含量明显高于多向分化的iccs(icc2)，但仍低于胎胰胰岛(islet)的胰岛素含量,insulinsecretioninresponsetoglucose,葡萄糖或促分泌素对iccs分泌胰岛素的作用磁性分离酶联免疫方法测定iccs分泌胰岛素量,t:tolbutamidec:carbacholg:glp-1,insulinsecretioninresponsetosecretagogues,在不同浓度葡萄糖刺激下iccs中细胞胰岛素分泌量与萄葡糖浓度呈正相关,各种分泌刺激因子刺激iccs释放胰岛素。t-甲苯磺丁脲c-碳酰胆碱g-胰高血糖素样肽,40,这一实验结果表明：nips具有多向分化潜能，在一定条件下能定向分化为功能性细胞.,41,第三个实验：,类胰岛细胞团(iccs)异种体内移植糖尿病的干细胞治疗实验研究。（将定向诱导人nips形成含细胞的iccs移植到严重联合免疫缺失小鼠体内）,42,糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射链脲佐菌素stz)肾膜下移植iccs治疗糖尿病,nod-scid小鼠,腹腔内注射streptozotocin,肾膜下移植含类细胞的iccs,高血糖,注射stz前,注射stz后,移植iccs后,302010,血糖水平(mmol/l),注射后3天小鼠出现稳定的高血糖症,移植4天后小鼠血糖明显下降,insulin,糖尿病小鼠肾膜下移植iccs后形态观察免疫组化方法检测含胰岛素细胞,左肾移植部位,移植后40天，移植部位血管增生,免疫组化显示移植部位的胰岛素阳性细胞,移植iccs后血糖明显下降(p0.05),糖尿病小鼠肾膜下移植iccs后血糖水平测量,stz处理3天后所有nod-scid小鼠出现高血糖，移植4天后小鼠血糖水平下降至接近正常并保持稳定至40天，未移植的小鼠保持高血糖。,移植40天后，移植物在移植部位发生异常增殖并侵入肾实质，形成导管、细胞团、血管等结构。,正常nod-scid小鼠肾膜下移植iccs移植部位的组织切片h.e染色,肾膜下区域侵入肾实质区域,renaltubule,正常nod-scid小鼠肾膜下移植iccs移植部位透射电镜观察,可见导管和细胞团,肾小管附近可见导管和血管,47,这一实验结果表明：移植的iccs可在糖尿病小鼠体内特殊环境下进一步分化生成更多类细胞，合成和分泌适量胰岛素，能显著降低血糖水平。但在正常小鼠中能多向分化、异常增殖。,48,讨论,1,糖尿病小鼠体内微环境对iccs的定向诱导分化作用，可能使糖尿病的干细胞治疗成为可能。在体内诱导较体外彻底，细胞比例高于体外，能显著降低糖尿病小鼠血糖水平，说明糖尿病小鼠体内特殊环境有利于iccs向细胞分化。（1）糖尿病小鼠的血清可作为胰腺干细胞体外培养的诱导因子，其中高浓度葡萄糖和胰高血糖素样肽1(glp-1)起主要作用。（2）移植部位血管增生，为生长和分化提供营养並有利于胰岛素及时进入血液循环。,49,讨论,2,干细胞治疗的安全性问题不容忽视。（1）干细胞诱导分化的不彻底性有待解决。iccs在正常小鼠体内的异常增殖，反映iccs中存在较多未分化细胞，如何控制诱导分化的方向和纯度並有效抑制可能的恶性增殖是目前干细胞治疗研究碰到的棘手问题。（2）干细胞移植会不会致癌仍是有待解决的问题。肿瘤干细胞(cancerstemcell)理论认为干细胞与癌细胞在增殖调节机制方面有着相同的信号途径和调控因子，癌症可能起源于异常活化的干细胞。abcg2是一种干细胞标志分子，同时又是多种癌细胞的抗药基因，可能是联系干细胞和癌细胞的分子基础之一。,50,讨论,3,