（环境工程专业论文）光合工程菌生理生化特性及生物处理反应动力学研究.pdf

摘要 摘要 光合细菌是一类以光为能源，能够利用低分子有机物和硫化物、氨等物质作为 供氢体兼碳源进行不放氧光合作用的微生物。近2 0 年来，已研究开发出利用光合细 菌法处理高浓度有机废水的工艺技术，并在实际工程应用中取得了良好的效果。进 一步采用现代生物技术对光合细菌开展深入的研究，以增强光合细菌氧的利用能力 和提高净化废水效率，对发展高效率低能耗的废水生化处理技术具有重要的意义。 本论文以透明颤菌血红蛋白基因光合工程菌( p s b p h s g m g v 曲) 为研究对象， 通过实验优化工程菌的培养条件，以分子生物学技术手段，从多方面检验反复多次 转接培养后的光合工程菌目的基因( v g b ) 的存留情况，并研究其生理生化特性以及环 境因子对光合工程菌的影响，为工程菌的应用提供依据。 本论文主要研究结果如下： 1 ) 通过对光合工程菌中提取的质粒进行电泳实验，确认了光合工程菌内含有重组 穿梭质粒( p h s g m g v g b ) ；以提出的质粒为模板，对v 曲目的基因进行扩增，扩增 产物的电泳图显示出清晰的目的基因条带；另外，对提取出的重组穿梭质粒进行双 酶切实验后，经过电泳实验可以同时看到完整的穿梭质粒、无目的基因的质粒以及 v g b 目的基因的三种条带。通过上述三种分子生物学方法进行检测的结果有力地证明 经多次转接培养后目的基因( v g b ) 仍很好的保存在于工程菌菌体中，说明构建的光合 工程菌( e b p 0 1 ) 稳, 定性良好。 2 ) 论文研究了p h 值、盐度、温度等环境条件对光合工程菌的影响，结果表明： 工程菌可以p h 在5 8 的培养基中生长，p h 为5 时的o d 值最大；在0 5 1 4g l 的 盐度范围内，光合工程菌菌液o d 值随盐度的增加而增大，盐度再进一步升高工程 菌会随盐度的增大长势减弱；工程菌在2 0 3 0 范围内长势随温度上升而呈现增强趋 势，3 5 下较其他温度下培养生长期虽提前，但较快进入了衰亡期。确定该基因工 程菌的最佳培养条件是p h 5 、盐度1 4g l 和3 0 。 3 ) 本论文自行设计制作了微生物呼吸强度测定系统，由测定的呼吸速率曲线发现 在系统内氧气减少到野生光合菌出现呼吸速率缓慢的时候，光合工程菌依旧保持了 较高的呼吸强度，在实验的时间内光合工程菌比野生光合菌产生的二氧化碳要多近 3 0 ，基于此可以认为光合工程菌在氧胁迫条件下较之野生光合菌会有更强的污水处 理能力。 4 ) 从有限通气的培养条件下绘制出的光合工程菌生长曲线上可以看出：光合工程 菌生长的停滞期( 适应期) 比野生光合菌略长，但进入对数生长期后表现出较高的比生 河北科技大学硕士学位论文 长速率，而且，随着氧气的逐渐消耗，仍旧保持了较高的生长速度；稳定期，光合 工程菌比野生光合菌的菌液浓度要高约2 0 。 5 ) 实验建立了光合工程菌和野生光合菌的生长动力学方程和基质降解动力学方 程，并测定了主要参数。小试实验结果表明光合工程菌对模拟污水的c o d 去除效率 要高于野生光合菌约7 ，c o d 去除率分别达到了8 5 6 和7 8 3 。 本文研究结果为发展光合工程菌处理废水的技术提供了参考依据。 关键词光合工程菌；野生光合菌：目的基因；环境因子；呼吸速率；动力学研究 a b s t r a c t = = 昌= 宣告皇写墨昌= = ；葛昌盎盲昌高昌= 暑昌昌崔昌皇昌昌皇穹= = 昌皇皇皇= = 寄= 皇篇；篁高= 皇昌霉昌昌昌目昌昌： 宣l 昌昌宣= 昌= ：眚= a b s t r a c t p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ( p s b ) i sak i n do fm i c r o o r g a n i s mt h a tc o u l dt a k el i g h ta st h e e n e r g ys o u r c ea n dd o e sn o tr e l e a s eo x y g e nw i t hp h o t o s y n t h e s i s i tc a r lm a k eu s eo ft h el o w m o l e c u l eo r g a n i c ，s u l f i d e ，a m m o n i aa n do t h e rm a t t e ra sh y d r o g e nd o n o ra n dc a r b o ns o u r c e o v e rt h ep a s t2 0y e a r s ，t h ep s bm e t h o dh a sb e e nr e s e a r c h e da n dd e v e l o p e df o rt e c h n o l o g y i nd e a l i n gw i t hh i g hc o n c e n t r a t i o no fo r g a n i cw a s t e w a t e r , w h i c hh a sg o tg o o dr e s u l t si n t h ee n g i n e e r i n ga p p l i c a t i o n f u r t h e rr e s e a r c h i n go nt h ep s bw i t hm o d e m b i o t e c h n o l o g y ， w h i c ht oe n h a n c ei t s a b i l i t yo fo x y g e nu t i l i z a t i o na n dt oi n c r e a s et h ee f f i c i e n c yo f w a s t e w a t e rp u r i f i c a t i o n ，w i l lh a v e i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e i n d e v e l o p i n gb i o c h e m i c a l w a s t e w a t e rt r e a t m e n tt e c h n o l o g yw i t hh i g he f f i c i e n c ya n d1 0 w p o w e r i nt h i s p a p e r , w et a k e t h ei q t r i e o s c i l l a h e m o g l o b i ng e n ee n g i n e e r i n gs t r a i n ( p s b p h s g - m g v g b ) a ss t u d yo b je c t t h r o u g he x p e r i m e n t sw eo p t i m i z e dt h ec u l t u r e c o n d i t i o no ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i na n dt e s t e dt h e t a r g e tg e n e ( v g b ) i nt h ee n g i n e e r i n g s t r a i na f t e rt r a i n i n go nm a n yt i m e s a l s o ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n dt h ei n f l u e n c eo fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，w h i c hw o u l d p r o v i d eab a s i si nt h ea p p l i c a t i o n o ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i n ，w e r es t u d i e d t h em a i nt h e s i so ft h i ss t u d ) , a r ea sf o f l o w s ： 1 ) t h r o u g ht h ee l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n t sf o r t h ep l a s m i do ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i n i ti sc o n f i r m e dt h a tt h ee n g i n e e r i n gs t r a i ns t i l lc o n t a i n e dt h ep s b p h s g m g v g b p u tt 1 1 e p l a s m i da sat e m p l a t ef o rt h et a r g e tg e n e ( v g b ) a n dm a k ei tg e ti n c r e a s e d e l e c t r o p h o r e s i s o fp c r p r o d u c t ss h o w sc l e a rt a r g e tg e n eb a n d s i na d d i t i o n ，a f t e rm a k i n gd o u b l ed i g e s t i o n f o rt h ee x t r a c t e dp l a s m i d ，w ec a ns e et h et h r e ee l e c t r o p h o r e s i sb a n d so fc o m p l e t e ds h u t t l e p l a s m i d ，p l a s m i dw i t h o u tt a r g e tg e n e ( v g b ) a n dt h et a r g e tg e n e ( v g b ) t h er e s u l t sf r o m a b o v et h r e em o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d sn o to n l yc o u l dc o n v i n c i n g l yd e m o n s t r a t et h a tt h e t a r g e tg e n e ( v g b ) s t i l lc o n t a i n sw e l li nt h ee n g i n e e r i n gs t r a i nb u ta l s oi n d i c a t et h a tt h e s t a b i l i t yo ft h ec o n s t r u c t e de n g i n e e r i n gs t r a i ni sf i n e 2 ) t h i sp a p e rg i v e sas t u d yo nt h ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n so fp h ，s a l i n i t ya n d t e m p e r a t u r ew h i c hi n f l u e n tt h eg r o w t ho ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i n t h er e s u l t ss h o wt h a t ：t h e e n g i n e e r i n gs t r a i nc o u l dg r o wa m o n gf r o mp h 5t o8a n dt h eo dg e t st h em a x i m u mv a l u e w h e nt h ep hi s5 w i t h i n0 5 1 4g ls a l i n i t yr a n g e ，t h eo dv a l u ea st h es a l i n i t yi n c r e a s e s ， b u tw i t ht h es a l i n i t ye n h a n c i n gc o n t i n u o u s l yt h eg r o w t ho ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i nw i l l i i i 河北科技大学硕士学位论文 b e c o m ew e a k e r i n2 0 。c - 3 0 c s c o p e ，t h ee n g i n e e r i n gs t r a i np r e s e n t sag r o w t ht r e n d t h e g r o w t hp h a s eg e t se a r l i e rb u tt h ed e c l i n ep h a s ea l s og e t se a r l i e ru n d e r35 c a tl a s t ，t h e o p t i m u mg r o w t hc o n d i t i o n sf o rt h ee n g i n e e r i n gs t r a i na r ep h 5 ，s a l i n i t y1 4g la n d3 0 c 3 ) i ti sd e s i g n e da n dp r o d u c e dm i c r o b i a lr e s p i r a t i o nr a t em e a s u r e m e n ts y s t e m f r o mt h e d e t e r m i n e dr e s p i r a t i o nr a t eo ft h ec u r v ew ec a r ld i s c o v e rt h a tt h ee n g i n e e r i n gs t r a i ns t i l l m a i n t a i nah i g hr e s p i r a t i o nr a t ew h e nt h eo x y g e nc o n c e n t r a t i o nr e d u c e dt om a k et h e r e s p i r a t i o nr a t eo ft h ew i l dp s bs l o wi nt h es y s t e m i nt h ee x p e r i m e n t a lp e r i o dt h e e n g i n e e r i n gs t r a i np r o d u c e sc 0 2m o r et h a nt h ew i l dp s bn e a r l y3 0 ，b a s e do nw h i c h c o u l dc o n f i r mt h a tt h es e w a g et r e a t m e n tc a p a c i t yo ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i ni ss t r o n g e rt h a n t h ew i l dp s bw h e nt h eo x y g e nc o n c e n t r a t i o ni sl i m i t e d 4 ) f r o mg r o w t hc u r v eo ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i nd r a w i n gi nl i m i t e do x y g e nc o n d i t i o n ，i t i sf o u n dt h a tt h es t a s i sp h a s e ( a d a p t a t i o np h a s e ) o ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i ni sal i t t l el o n g e r t h a nt h ew i l dp s b ，b u ti ts h o w sh i g h e rr a t i og r o w t hr a t ei nt h el o g a r i t h m i cp h a s ea n ds t i l l k e e ph i g h e rs p e e do fg r o w t ha so x y g e nc o n s u m eg r a d u a l l y i nt h es t a t i o n a r yp h a s e ，t h e c o n c e n t r a t i o no ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i ni sh i g h e rt h a nt h ew i l dp s bn e a r l y3 0 5 ) i ti se s t a b l i s h e dt h eg r o w t hk i n e t i c se q u a t i o na n dt h es u b s t r a t ed e g r a d a t i o nk i n e t i c s e q u a t i o nf o rt h ee n g i n e e r i n gs t r a i na n dt h ew i l dp s bi nt h et r e a t m e n tp r o c e s s i n g ， m e a n w h i l e ，d e t e r m i n e dt h em a i np a r a m e t e r s t h er e s u l t so ft h el a bt e s ts h o wt h a tt h e s i m u l a t e ds e w a g ec o dr e m o v a lr a t eo ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i ni sh i g h e rt h a nt h ep s b a l m o s t7 a n dr e a c h8 5 6 a n d7 8 3 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t so ft h i sp a p e rc o u l dp r o v i d er e f e r e n c eb a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n to ft h e s e w a g et r e a t m e n tt e c h n o l o g yw i t ht h ee n g i n e e r i n gs t r a i n k e vw o r d s p h o t o s y n t h e t i ce n g i n e e r i n g s t r a i n ； w i l d p s b ；t a r g e tg e n e ； e n v i r o n m e n t a lf a c t o r ；r e s p i r a t i o nr a t e ；k i n e t i c ss t u d y i v 河北科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发 表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：承义举 门 砂v 答年b 月7 r 指导教师签名： 勿孝年涉只| r 河北科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 口保密，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 形f 保密。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：乡次义珠 乙矽( 7g 年7 月j 同 指导教师签名：删 砒年汜茂lr 第】章绪论 第1 章绪论 1 1概述 目前，水资源短缺及工业废水和生活污水污染，已成为影响我国持续发展的重 要环境问题之一。随着我国经济的高速发展，水污染问题变得更加突出。根据国家 环境保护部发布的( 2 0 0 7 年中国环境状况公报f l 】：2 0 0 5 、2 0 0 6 、2 0 0 7 年污水排放 量分别为5 2 4 5 亿吨、5 3 6 8 亿吨、5 5 6 7 亿吨，化学需氧量排放量分别为14 1 4 2 万 吨、14 2 8 2 万吨、13 8 1 8 万吨。到2 0 0 7 年化学需氧量己开始呈递减趋势，但是废 水每年排放总量仍在增加。全国地表水污染依然严重，七大水系总体水质与上年持 平，19 7 条河流4 0 7 个断面中，i - - - i i i 类、v 类、劣v 类水质的断面比例分别为 4 9 9 、2 6 5 f d2 3 6 ；2 8 个国控重点湖( 库) 中，满足i 类水质的占o ，i i 类占7 1 ， l 类占2 1 4 ，i v 类占1 4 3 ，v 类占1 7 9 ，劣v 类占3 9 - 3 。水污染给全国的工 业、农业等带来严重的不利影响，对环境的生态系统会造成极大的危害，严重时会 使水体生态平衡破坏，水生生物受到损害，甚至危及人类的健康和生命安全，并使 经济严重受损。为了解决制约我国经济社会发展的水资源和水质污染问题，国家进 一步加大环保科技投入，充实环保事业发展后劲，把“水体污染控制与治理”作为 国家十六个重大科技专项之一，列入国家中长期科学和技术发展规划纲要 ( 2 0 0 6 2 0 2 0 ) 9 ，旨在实现“十一五”期间水体主要污染物c o d 排放量减少1 0 的目 标和为江河湖海休养生息恢复良好的生态平衡提供科技支撑。 解决水污染问题的举措之一就是选用先进合理的技术方法对污水进行处理。污 水处理技术，按作用原理可分为物理法、化学法和生物法三大类。物理法是利用物 理作用来分离污水中的悬浮物或乳浊物，常见的有重力分离、气浮、过滤等。化学 法是利用化学反应的作用来去除污水中的溶解物质或胶体物质，常见的有氧化还原、 化学沉淀、光催化氧化、微电解等。生物法是采用人工措施创造出有利于微生物生 长繁殖的环境，利用微生物代谢作用分解转化污水中的有机污染物，使水质得到净 化。采用生物处理法是去除污水中有机物的最经济有效的选择，它分为好氧和厌氧 两大类。由于该方法具有适用面宽、运行稳定、经济高效等优点，人们越来越重视 采用生物法处理有机污水【2 1 。2 0 0 7 年，国家新建城市污水处理厂4 8 2 座，新增污水 处理能力13 0 0 万吨日，城市污水处理率由2 0 0 6 年的5 7 提高到6 0 ，27 0 0 家重 点工业企业新建了废水深度治理工程【lj ，在这些污水处理工程中污水的生物处理技术 是应用最广泛的工艺技术。 污水生物处理的目的是使污水中挟带的污染物质，主要是有机物，通过微生物 河北科技大学硕士学位论文 的代谢活动予以转化及稳定，达到无害化。在这无害化过程中，有害物质转化和稳 定作用的主体是微生物。目前，常用的活性污泥法和生物膜法等生物处理系统，所 需的机械化程度高，占地面积大，能耗较高，剩余污泥处理负担较重，而且主要适 于处理低浓度有机污水。 高效的处理方法与新的特种微生物的优化组合，在污染治理中将达到事半功倍的 效果。2 0 世纪5 0 年代初，由于分子生物学和生物化学的发展，对生物细胞中存在的脱 氧核糖核酸( d n a ) 的结构和功能有了比较清晰的阐述【3 】。随着科技的不断发展，2 0 世 纪7 0 年代初人们实现了d n a 重组技术，逐步形成了以基因工程为核心内容，包括细胞 工程、酶工程、发酵工程的生物技术f 4 】。这一技术发展到今天，正形成产业化并列为 世界领先专业技术领域之一，广泛应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国 防等许多部门，并日益显示出其巨大的潜力，同时也将为世界面临的环境保护等问题 的解决提供广阔的应用前景。实践证明，采用基因工程技术治理污染环境，可提高微 生物净化环境的能力，最大限度地去除环境中的污染物，是保障可持续发展的一项最 有力的措施。随着基因工程菌的出现，基因工程技术将不断应用于更多的污染环境的 治理工程中1 5 叫。 1 2 光合细菌简述 光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ，简称p s b ) 广泛存在于自然界的水田、湖泊、 江河、海洋、活性污泥及土壤内，是一类以光为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条 件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源，进行不放氧光合作 用的微生物【1 0 1 2 】。近2 0 多年来发展起来的光合细菌处理法，是一种以红假单胞菌为 主、降解率高、能耗低的污水处理系统。光合细菌处理法适用于高浓度有机废水， 能够显著降低有机污水中的b o d 值和c o d 值，效率高，占地面积较小，可以节约 电能及运转费用，作为副产物的菌体有综合利用的价值。因此，光合细菌处理方法 日益受到重视。 1 2 1 光合细菌的分类 光合细菌属于革兰氏阴性细菌，这一类群的细菌菌体形态极为多样，主要有球 形、杆形、螺旋形和卵圆形；细胞大小通常为( 0 6 0 7 岬) ( 1 0 1 0r t m ) ，多数依靠 鞭毛运动，亦有滑行运动或不运动者；主要以二分分裂繁殖，少数菌体以芽殖或三 分分裂繁殖1 1 3 】。所有的光合细菌都含有菌绿素和类胡萝卜素，随其种类和数量的不 同，菌体呈现不同的颜色。光合细菌类型多样，根据伯杰细菌鉴定手册( 第九版) 可分为6 个类群，2 7 个属，见表1 1 。 2 第1 章绪论 表1 1p s b 的分类 t a b l e1 - 1t h ec l a s s i f y o fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a 类群名称t a x o n 数量q u a n t i l y 着色茵科( c h r o m a t i a c e a e ) 外硫红螺菌科( e c t o t h i o r h o d o s p i f i l a c e a e ) 红色非硫细菌( p u r p l en o n s u l f u rb a c t e r i a p n b ) 绿硫细菌( g r e e ns u l f u rb a c t e r i a l 多细胞绿丝菌( m u l t i c e l l u l a rf i l a m e n t o u sg r e e nb a c t e r i a ) 盐杆菌( h e l i o b a c t e r i u m ) 9 属g e n e r a l 属g e n u s 6 属g e n e r a 5 属g e n e r a 4 属g e n e r a 2 属g e n e r a 1 2 2 光合细菌的生理特征 在不同的环境中，p s b 具有固碳、固氮、脱氮和氧化硫化物等多种不同功能， 在自然界的碳、氮、硫循环中起着重要的作用。在光照条件下p s b 能利用硫化氢、 硫代硫酸盐、分子氢或其它还原剂，经细菌型光合作用，将二氧化碳还原成为有机 营养物，并能固定大气中的氮【l4 1 。目前所知，所有的厌氧型光合细菌都能以二氧化 碳为碳源，以无机物为供氢体，在光照下进行自养生长。同时，这些细菌也能进行 异养生长，吸收有机营养物质，将其中一部分通过生物氧化作用最终转化为c 0 2 和 h 2 0 等稳定的无机物，并获取能量用以合成代谢，另一部分有机营养物用于合成新 的细胞质。低分子有机酸是光合细菌利用的主要基质之一。 研究证明，p s b 菌体中含有大量的蛋白质、辅酶q 和相当完全的b 族维生素， 尤其是维生素b 1 2 、生物素和叶酸含量特别高，还含有蛋氨酸等多种氨基酸，菌绿素 和类胡萝卜素等。目前已从p s b 菌体细胞中分离出了8 0 种以上的类胡萝卜素，并不 断出现新的报道。此外，p s b 细胞内还含有碳素储存物质糖原和聚b 羟基丁酸 1 5 , 16 j 。 1 2 3光合细菌在污水处理中的研究现状 2 0 世纪6 0 年代，日本m k o b a y a s h i 等【17 】注意到光合细菌在高浓度有机污水自净 中的作用，从而开始了光合细菌在污水处理领域中的应用。2 0 世纪7 0 年代日本小林 证泰等提出了用光合细菌处理有机废水的工艺，并成功地对粪尿和食品、淀粉、皮 革、豆制品加工的废水进行处理。1 9 7 8 年，日本率先实现了光合细菌处理高浓度有 机污水的工业应用，其后许多国家的研究人员也做了大量的研究及推广工作，建立 了一批日处理几十、几百乃至几千吨高浓度有机污水的大、中型实用系统，有的已 运转1 0 多年，效果良好。这充分显示了p s b 处理法的优越性，具有重要的开发利用 价值。据报道l l 引，韩国在日本协助下，建成了日处理6 0 0 吨b o d 高达2 3 万m e r l e 河北科技大学硕士学位论文 的酒精污水处理场，己于1 9 8 1 年投入运转。2 0 世纪9 0 年代k h a n n ap t l 9 】首先发现 沼泽红假单胞菌可厌氧降解芳烃物质；k r o o m e m a n 等【2 0 j 研究发现在低氧条件下用厌 氧的沼泽红假单胞菌和产碱杆菌( a l c a l i g e n e s ) 混合培养分解3 氯苯酚；c a r o l i n es h a r w o o d 等【2 l j 也报告了p s b 可通过苯甲酰酶a 途径厌氧代谢芳香环化合物，使芳香 环裂解。近年来，澳大利亚、美国等也相继进行了光合细菌处理污水的开发研究， 使得这一技术得到了迅速的发展f 2 2 1 。 我国在此领域也做了不少工作，取得了一些成绩。2 0 世纪8 0 年代，上海交通大 学与南通发酵厂合作，在小林正泰的帮助下，进行了大量的试验研究，1 9 9 2 年6 月 建成了日处理1 5 0t - - 一2 0 0t 柠檬酸废水p s b 法处理系统。1 9 9 5 年，管希夷1 2 3 等对该 工艺进行了改革，将处理量提高到3 0 0t - 4 0 0t d ，系统c o d 的去除率也提高至 9 7 5 。李景生【2 4 j 等采用炭渣填料固定p s b 混合菌膜技术，对乳品厂废水处理进行 试验研究，整个工艺流程中p s b 段处理效果明显，出水各项指标均达到排放标准， 其中c o d 、b o d 5 和s 厶的去除率分别为9 7 ，9 8 ，8 6 。程树培【2 5 】等将细胞融合 技术用于豆制品废水，光合细菌与酿酒酵母的融合细胞f o a 和f z l 连续发酵废水，融 合子在耐酸耐热、絮凝性、降解效率、菌体得率等方面综合了双亲的优势。其絮凝 性能明显地优于双亲，表明将原生质体融合技术引入废水资源化处理的应用领域具 有良好前景。郑爱榕f 2 6 】等研究发现p s b 可将黄泔水中的氮、磷有机物降解为无机氮 ( 主要是n t - l - n ) 矛i 磷酸盐以及c 0 2 等，处理后的黄泔水养殖螺旋藻，藻生长周期为 2 2d 、生长速率为2 0 - - 3 0m g ( l d ) 。藻体内蛋白质平均含量为每1 0 0g 藻体( 干重) 含 有5 2 6g 蛋白质( 干重) ，游离氨基酸平均含量为每1 0 0g 藻体( 干重) 含有2 4 1g 游离 氨基酸( 干重) 。 有些学者将光合细菌与其他生物法或其他废水处理工艺结合取得了较好的效 果。何萍【2 7 】等用光合细菌与小球藻复合处理豆制品有机废水，c o d 和b o d 5 总去除 率达到9 6 4 和9 7 5 。郭养浩【2 8 】等采用生物转盘为反应器，以耐盐光合细菌形成生 物膜处理味精废水，废水经预酸化、厌氧好氧串并联工艺连续处理，在停留时间为 4 0 - - 4 8 小时的条件下，c o d 去除率达到9 2 以上。 1 3 透明颤菌血红蛋白基因简述 1 3 1透明颤菌的简介 透明颤菌( 所f 地甜c f 肋) 是一类专性好氧的革兰氏阴性丝状菌【2 9 ，3 0 1 ，在缺氧条件下 该菌可合成一种可溶性的血红蛋白。1 9 8 6 年前后，w a k a b a y a s h is 等从光谱特性、氧 结合动力学和蛋白质初级结构等角度证明它是一种原核生物的血红蛋白，并将其命 名为透明颤菌血红蛋( v i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n ，v h b ) t 3 l 】。由于它具有氧结合特性， 4 第1 章绪论 从而预示着在好氧的生物发酵过程中具有潜在的应用价值，在不增加投资的情况下， 达到提高产量的目的，因此自它被发现之日起便引起了各国学者的广泛关注。v h b 是迄今为止发现的最早，研究得最为深入、结构和功能了解得比较清楚的一种原核 生物的血红蛋白。 1 3 2 透明颤菌血红蛋白基因组成及特点 存在于透明颤菌细胞中的透明颤菌血红蛋白基因( v g b ) 是控制血红蛋白表达的基 因，该基因在野生型透明颤菌中是以单拷贝的方式随染色体一起复制表达的。1 9 8 6 年w a k a b a y a s h i 等首先分析确定了v h b 的氨基酸序列。d i k s h i t 和w e b s t e r 根据己报 道的氨基酸序列合成d n a 探针杂交筛选v i t r e o s c i l l a 基因库，得到了含有v g b 基因的 1 4k b 的d n a 片段【3 2 1 。同年，k h o s l a 和b a i l e y 也用类似的方法克隆了v 曲基因，并 测定了其核酸序列1 3 引。 由x 射线晶体学和定点突变研究表明：透明颤菌血红蛋白的远端血红素空穴的 构象因受e 螺旋和f 螺旋构型的干扰而剧烈改变。由此推测v h b 可能有与 f a d n a d h 还原酶关联的位点。但通过对v g b 基因下游序列分析证明，v 曲基因不 是末端氧化酶多基因操纵子的一部分，而是单独的基因【34 i 。目前v g b 基因的基本结 构己经比较清楚，包括调节区、编码区和终止序列。k h o s l a 等采用引物延伸法研究 了基因调节区的结构【3 5 1 。调节区位于结构基因上游约1 5 0 个核苷酸的范围内，主要 包括p 1 、p 2 两个重叠启动子，p 1 是强启动子，p 2 相对较弱，它们各有一个p f i b o w 盒，但都缺少3 5 区序列。在调节区还包括f n r ( 延胡索酸硝酸盐还原蛋白) 和 c r p ( c a m p 宿主蛋白) 两个d n a 结合蛋白的识别序列，参与调节启动子的活性。研 究p 1 上游序列发现了一段中心对称的反向重复序列t t g a t a t t 从，这段典型的 d n a 结合蛋白的识别序列与f n r 蛋白的识别序y j j ( t t g a t - a t c a a ) 仅相差一个碱 基。在v g b 基因转录终止区还有一个茎环结构a c c a t a a g g t g g t 和原核转录终止 区t t t t t a 。 v 曲基因的启动子是强启动子，启动子的活性受溶氧浓度调节。当溶氧水平低于 2 0 就可被诱导，在无氧及富氧环境均不被诱导。v g b 基因可在多种宿主中表达，不 同宿主内启动子强度各不相同。 1 3 3 透明颤菌血红蛋白的作用机制和功能 关于v h b 的作用机制，其中比较典型的假说：是协助扩散假说，在贫氧条件 下v h b 增加了氧流向一个或两个细胞色素b o 、b d 末端氧化酶的量p 6 1 ，提供较高的 胞内氧浓度，改变细胞内部氧化还原状态；二是氧化还原效应物假说，氧合型的v h b 可能影响细胞的一些关键的氧化还原敏感组分的活性，这样的影响能够依次被转换 5 河北科技大学硕十学位论文 来增加能量守恒的效率【3 。m 0 1 。随着人们对v h b 研究的不断深入，这些假说均得到了 部分证实。 v h b 具有运输氧和传递电子的功能。超微结构研究显示，v h b 合成于细胞质中 并聚集在细胞膜附近，在限氧条件下能捕捉氧，并协助氧转移到生命力旺盛的呼吸 膜上1 3 2 , 4 1 】。在透明颤茵或重组大肠杆菌中好氧呼吸器位于细胞内膜，带有一个朝向 细胞质膜的氧结合位点。免疫金标记实验表明，在重组大肠杆菌中有近4 0 的v h b 分布在周质空间，这样细胞能更好地捕捉环境中的氧，并传递氧到呼吸膜。这些现 象和结论支持协助扩散假说。根据v h b 在大肠杆菌中表达的氧结合动力学特征以及 生物化学和生理变化，细胞的总a t p 产量增加，中心碳代谢途径发生改变，而且细 胞中n a d ( p ) h 含量减少，表明v h b 提高了电子传递链的周转率。 由于在细胞周质空间含有大量的v h b t 4 引，推测v h b 的n 末端序列可能是作为 该蛋白的输出信号。v h b 的起始位置有一个由1 6 个氨基酸残基构成的信号肽，但其 n 末端序列不符合通常的信号肽特征，在运输过程中它不能被切除；而且也不像大 多数运输信号一样，它对于蛋白质的功能是非常重要的，它的前1 6 个氨基酸残基是 一个完整的0 【螺旋结构的部分，并且缺乏n 末端前1 4 个氨基酸残基的v h b 突变株 是不能结合血红素的。这些现象说明v h b 的n 末端序列不仅可以作为输出信号，而 且在蛋白质中还具有一定的功能。 1 3 4 透明颤菌血红蛋白基因的应用 目前该基因己被克隆到多种异源微生物体内，并提高了菌体的生长密度1 4 引。将 透明颤菌血红蛋白基因克隆到大肠杆菌体内，并在大肠杆菌中诱导表达获得成功， 对大肠杆菌的生长促进量可达两倍以上【删；v g b 基因在天蓝链霉菌中表达，使所产的 放线菌紫素增加1 0 倍以上【4 5 】；在头孢霉菌c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m )的表达，使 头孢菌素c ( c e p h a l o s p o r i nc ) 的产量提高了5 倍多【4 6 】；在枯草杆菌中表达，提高了细 胞蛋白质的分泌【4 7 】；在青霉素酰化酶基因工程菌中的表达，提高了青霉素酰化酶的 产量【4 8 】：透明颤菌血红蛋白的表达也可提高金色链霉菌对氧的利用效率，产物合成 比原始菌株提高1 1 4 【4 9 1 。另有摇瓶发酵实验证明v h b 在限氧条件下可明显促进肉 桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成f 5 卅；中国科学院遗传研究所的章银梅等选用阳 性菌b 内酰氨酶基因( b l a ) 的启动子来表达v g b ，使得该基因在枯草杆菌中成功得到表 达【5 1 】；v g b 也能够提高有毒代谢物的降解能力，如利用有机磷酸脂水解酶( o p h ) 与 v h b 共表达，o p h 的活力提高了4 8 【5 2 】；v g b 在假单胞菌和伯克氏菌中表达提高了 降解苯甲酸和2 ，4 二硝基甲苯的能力【3 9 】；在转v g b 基因植物中，植物的生长状态也 发生了变化。如v g b 转入烟草后，烟草种子萌发提前、生长加快、植株的叶绿素含 量增加【5 3 1 。但是，在不同异源生物体内或同一生物不同培养条件下，v h b 的表达也 6 第1 章绪论 产生不同的效果。如沙雷氏菌属是一类兼性厌氧细菌，在转入v 曲基因后，粘质沙 雷氏菌在固体培养基上生长加快，在液体培养基中细胞数下降，细胞个体却增大1 5 4 | 。 v h b 作为一种受氧敏感型启动子调节的蛋白，在限氧条件下能促进细胞的生长 和代谢产物的合成1 5 5 1 ，从分子水平上控制v g b 基因重组菌对氧气的利用能力。虽然 对它的作用机制还不十分清楚，处于假说阶段，但人们可以利用基因工程的手段来 解决实际生产中的问题，因此具有广阔的应用前景。 透明颤菌是严格的需氧菌，但它又生长在贫氧环境中。在供氧不足的条件下， 透明颤菌血红蛋白能够从分子水平上提高细胞自身对溶解氧的利用能力，并能改善 细胞的氧输送效率，满足细胞的呼吸要求，使之适应较低的溶解氧水平，从而促进 细胞的生长和一些代谢产物的合成，使细胞在贫氧环境中存活，且可以提高细胞中 目的产物的产量和收率。 迄今为止该基因主要应用于微生物发酵与生物制药产业，在环境工程水处理方 面的应用到目前为止还没有见到相关报道。利用基因工程菌能够高效利用溶解氧的 特性，可以在少量曝气条件下进利用基因工程菌能够高效利用溶解氧的特性，进行 废水的好氧处理，进而可以降低废水处理的运行成本，有可能发展和改进现有的废 水生化处理技术，因而相关的科学研究工作已逐步受到人们的重视。 1 4 课题研究意义及主要内容 1 4 1 课题的研究意义 目前，世界各国家都高度重视环境保护工作。积极开展污水处理技术及污水资 源化新技术的研究，对于消除污染，改善环境，保护水资源，实现社会经济可持续 发展战略，具有十分重要的现实意义。 通过构建特殊的基因工程菌来提高污水生化处理的效率是当前环境生物工程的 一个研究热点。污水生物处理工艺从对氧的需求不同，可以主要分为好氧生物处理 和厌氧生物处理，好氧生物处理是应用得最为广泛的工艺。在好氧生物处理中，使 用动力达到充氧的目的，而动力消耗占了处理成本的主要部分，因此提高微生物本 身对氧气的利用能力，可达到节省能源，降低污水处理运行成本的目的。 本实验室利用分子生物学最新研究理论和技术，已经将含有v g b 天然启动子的 啦基因在光合