（有机化学专业论文）面包酵母在选择性生物还原中的应用.pdf

摘要 本文利用面包酵母中氧化还原酶的催化性能对含有c = o 双键、c = c 双键及 c = n 双键的化合物进行了生物催化还原反应。其中含有c = n 双键的化合物包括由 苯甲醛与苯胺缩合反应得到n 苯基苯甲亚胺、水杨醛分别与苯胺和乙二胺的缩 合反应得到n 一苯基一2 一羟基苯甲亚胺及n ，n o 二亚水杨基一亚乙基二酰胺以及以 噻吩为原料合成乙酰噻吩并进一步与乙二胺缩合生成的n ，n - 二( 甲基一d 一噻吩 基亚甲基) 亚乙基二酰胺和环上含有c = n 双键的2 一甲基苯并眯唑等。 本文采用干酵母法，酵母培养液法和固定化酵母法等三种不同的方法进行面 包酵母的生物催化还原反应，并在实验过程中考察对比了它们的优缺点。其中干 酵母法操作最为简单、方便，但是由于其中含有较多添加剂导致产物的后处理比 较复杂；而酵母培养液法使用新鲜培养的酵母，活性较好，产物分离也较为简便： 固定化酵母法需要将酵母细胞固定在海藻酸钙颗粒中，可以在有机溶剂中进行反 应，但酵母细胞的活性有所降低。 关键词：面包酵母生物催化还原 亚胺干酵母法 a b s t r a c t b i o r e d u c t i o no fs o m ec o m p o u n d s c o n t a i n i n gc = 0 d o u b l eb o n d c = cd o u b l eb o n d a n dc = nd o u b l eb o n dw i t hb a k e r sy e a s tw a s d e v e l o p e d t b o s ec o m p o u n d s c o n t a i n i n g c = nd o u b l eb o n di n v o l v e n p h e n y l b e n z y l i m i n e ，p r e p a r e d f r o m b e n z a l d e h y d ea n da n i l i n e ，n p h e n y l 一2 一h y d r o x y - b e n z y l i m i n ea n dn ，n - d i s a l i c y l i d e n e e t h y l e n e d i a m i n e s y n t h e s i z e db yt h e r e a c t i o no fs a l i c y l a l d e h v d ew i t ha n i l i n ea n d e t h y l e n e d i a r n i n er e s p e c t i v e l y , a sw e l la sn n - b i s f 1 一t h i o p h e n 2 y 1 e t h y l i d e n e ) 一e t h a n e 一1 2 - d i a m i n e d e r i v e d f r o m e t h y l e n e d i a m i n e a n d 2 - a c e t y l t h i o p h e n w h i c hw a ss y n t h e s i z e dw i t ht h i o p h e n a st h es t a r t i n gm a t e d a l b a k e r s y e a s t c a t a l y z e dr e d u c t i o nw a ss t u d i e db yt h eu s eo fd r yb a k e r s y e a s t p r o c e s s ( d b y p ) c u l t u r e db a k e r s y e a s tp r o c e s s ( c b y p ) a n di m m o b i l i z e db a k e r s y e a s tp r o c e s s ( i b y n t h ee x a m i n a t i o no ft h o s et h r e ep r o c e s s e sa n dt h ec o m p a r i s o n b e t w e e nt h e ma r ea l s os t u d i e di nt h i sp r o c e s s a m o n gt h o s ep r o c e s s e s ，d b y pw a st h e s i m p l e s ta n dt h em o s tc o n v e n i e n t i nt h es a m ew a y , t h ec h a r a c t e ro fc b y p w h i c h e m p l o y e d t h e f r e s h l y c u l t u r e db a k e r sy e a s t 1 i e di nt h e h i g ha c t i v i t y a n dt h e c o n v e n i e n c eo ft h es e p a r a t i o no fp r o d u c t s i b y p - h o w e v e r , h a dt h ed e m a n df o rt h e i m m o b i l i z a t i o no fc e l l so fb a k e r sy e a s ti nt h em i c r o c a p s u l eo fc a l e i u ma l g i n a t e w h i c ha l l o w e dt h er e a c t i o ni no r g a n i cs o l v e n t ，b u tl o w e r e dt h ea c t i v i t yo fb a k e r s y e a s t k e yw o l i d s - b a k e r sy e a s tb i o r e d u c t i o n c = nd o u b l eb o n d d r yb a k e r s y e a s tp r o c e s s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁壅盘堂一或其他教育机构的学位或证 书而使甩过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贞献均已在论文中 作了f j 确的晚喇，1 表示 7 谢意。 学位论文作者签名：彰套茜央签字日期：卯牟年 学位论文版权使用授权书 工月歹 本学位论文作者完全了解墨生盘鲎有关保留、使用学位沦文的成定。 特授权：苤壅盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者躲凝畹吠铷躲琳口目万 签字日期：) 硎诉2 月7 1 签字日期：弛，l 年1 一月彳 天津大学硕士学位论文 第一章前言 第一章前言 1 1 生物催化有机合成的概况 近年来，随着学科间的相互渗透和密切结合，生物催化反应在有机化学中 得到了日益广泛的应用。生物催化( b i o c a t a l y s i s ) 是指利用酶或有机体( 细胞、细 胞器) 作为催化剂实现化学转化的过程，又称生物转化( b i o t r a n s f o r r n a t i o n ) 。生物 催化的手性合成( c h i r a ls y n t h e s i sw i t hb i o c a t a l y s t ) 是指利用纯酶或有机体催化潜 手性化合物转变为手性产物的过程。生物催化的手性合成反应条件温和、效率高， 并具有高度的化学选择性、区域选择性以及对映体选择性，因而得到广泛的应用。 生物催化过程具有无毒、无污染和能耗低等特点，是一种环境友好的合成方法。 生物催化中常用的有机体主要是微生物。微生物作为生物催化的重要参与者，为 生物催化提供多样的酶催化剂，或直接以完整的细胞进行生物催化，后者称为微 生物生物转化( m i c r o b i a lb i o t r a n s f o r m a t i o n ) ，其本质是利用微生物细胞中特定的酶 将人工合成的非天然化合物进行生物转化，转化液经分离纯化可得到所需产品的 过程n 】。微生物生物转化法的优点是工艺简单，不需要酶的分离纯化和辅酶再生， 缺点是副产品多，产物分离纯化困难。 早在18 5 8 年，巴斯德研究发现外消旋酒石酸铵在微生物酵母或灰绿青霉生 物转化下，天然的右旋光性( + ) 滔石酸铵盐会逐渐被分解代谢，而非天然的( 一) 一 酒石酸铵盐逐渐积累而得以纯化，该过程称为不对称分解作用1 2 l 。从1 9 5 8 年开 始，我国由微生物学家方心芳教授和有机化学家黄鸣龙教授合作开展这一领域的 研究，并取得成功【2 】。经过近半世纪的研究，生物催化法已经成为一种标准的有 机合成方法【3 1 。目前，生物催化的手性合成已成功用于制备光学活性氨基酸、有 机酸、多肽、甾体转化、抗生素修饰和手性原料( 源) 等，这是有机合成化学领域 的一项重要进展。 生物转化的主要作用有：外消旋体拆分、几个类似基团同时存在时，对其 中一个功能团进行选择性转化、引入手性中心、对不活泼碳的功能化等。生物转 化方法之所以引起人们兴趣的另一个原因，是考虑到其能量损耗低和对环境污染 小的优势【4 1 0 酶在温和条件下进行催化反应，反应p h 值为5 _ 8 ( 一般在7 左右) ，反应温 度在2 0 4 0 ( 2 ( 一般在3 0 * ( 2 左右) 。在这样的反应条件下，可以减少不必要的副 反应，如产物的分解、异构化、消旋化以及重排反应等，而传统的化学催化反应 则常常不能避免发生这些副反应。酶在生物体内主要是催化在水溶液中进行的化 学反应，在体外也能催化非水介质中的化学反应。酶对底物( 反应物) 表现出高 天泮大学硕士学位论文 第一章前言 的专一性，但大多数酶并非是绝对专一性，它们能接受人工合成的非天然化合物 作为反应底物，因此又表现出定的底物适应性。 1 2 微生物生物催化反应中常用的方法 由于微生物种类繁多、含酶丰富，所以利用微生物可进行多种生物转化反 应。首先，微生物生物转化反应具有高度的选择性，尤其是立体选择性，可以顺 利地完成一般化学方法难以实现的反应，如甾体、萜类与生物碱等有机化合物中 非活泼氢的羟化反应等。再者，微生物生物转化反应条件温和，尤其适用于不稳 定化合物的制各。 微生物生物转化法一般采用游离细胞和固定化细胞培养法。 1 2 1 游离细胞转化法 1 2 1 1 底物的预处理 在任何一种生物转化过程中，必须优先考虑底物的诸多性质，如渗透性、溶 解度、稳定性和毒性等。 若要使微生物对底物发生生物转化作用，首先必须保证底物与催化反应的酶 能相互接触。参与转化反应的微生物酶般为微生物的胞内酶，因此底物必须能 透过细胞壁和细胞膜。真菌的细胞壁对绝大多数低分子量有机化合物的透过性较 好，因此真菌类生物转化效率较高。相反，细菌细胞壁的透过性较差，因此其转 化效率低。底物在微生物培养基中的溶解度大小与生物转化率一般呈线性增加的 关系，但也有例外，如微生物氧化性生物转化中，水不溶性底物则往往表现出很 高的转化率。这是因为绝大部分的氧化酶位于细胞膜中，膜中的脂类对疏水性底 物有较高的亲和力，有助予疏水性底物与氧化酶的接触，从而增加生物转化率。 最常用的一种添加底物方法是利用无毒性的溶剂如9 5 乙醇、丙酮、 d m s o 、d m f 或其它低级醇溶液来溶解底物，形成混溶溶液。d m s o 、d m f 为 高沸点溶剂，它们会影响产物的分离与纯化，因此应尽量减少使用这类溶剂。另 一种方法是直接添加固体粉末状底物，同时在培养基中添加无毒性的表面活性剂 如吐温系列物等，以促进微生物细胞对底物的吸收。在没有有机溶剂存在的条件 下，微生物能耐受高底物浓度。 若底物对微生物有毒副作用，则会干扰微生物的生长。对于这类底物必须 采用少量多次添加的方法，使底物浓度控制在毒性浓度以下；也可采用静态细胞 转化法，以避免底物对微生物细胞初级代谢途径的影响。对酸性或碱性底物以其 盐的形式添加，则可避免培养基p h 值的突变。对于高挥发性底物则应在密闭性 转化体系中进行反应，以减少底物的损失。 天津大学硕士学位论文第一章前言 1 2 1 2 生长细胞培养转化法 生长细胞培养转化法是在微生物细胞培养前或培养一段时间后，将底物直 接加到微生物生长培养基中，微生物自身繁殖生长的同时对底物进行生物转化。 这是生物转化法中最简单和最常用的一种方法。该法的优点是微生物生物转化容 易、效率高，缺点是分离纯化困难。这种方法特别适合于经过诱变处理的微生物 菌种，它们能将底物作为唯一的碳源，同时还能适应连续化操作过程。 1 2 1 3 静态细胞培养转化法 静态细胞培养转化法是将微生物细胞发酵培养一定时间之后，离心收集菌 体，然后将菌体悬浮于含有底物的水或缓冲溶液中进行生物转化，也称为替代培 养法。此法的优点是产物的后处理简单，没有培养基成分的污染，缺点是增加了 额外的细胞收集与重悬过程。这种技术己广泛用于许多有机化合物的生物转化。 静态细胞培养转化法和生长细胞转化法对需氧菌和厌氧菌都适用，它们对 一些有机化合物生物转化的产物、转化率等结果都很相似。但静态细胞转化法所 使用的酶一般为细胞中组成性表达酶，而非诱导性表达酶。 静态细胞培养转化法能有效地控制转化液的组成，以适应底物转化的最佳 条件。而生长细胞培养法则必须使培养基的成分满足微生物生长的最佳条件。因 此，对一些稳定性依赖于p h 值的底物，则可以使转化缓冲液的p h 值保持在底 物稳定的最适宜p h 值范围内。例如，r 雄甾烯- 3 ，1 7 一二酮 ( a n d r o s t 一5 e r i e 3 ，1 7 一c l i o h e ) 在p h 值为6 8 条件下可以被少根根霉生物转化为6 一羟 基4 雄甾烯3 ，1 7 二酮，避免了非酶催化中酸一碱引起的底物的异构化1 5 】。 1 2 2 固定化细胞转化法 固定化细胞转化法是利用惰性基质，通过物理或化学法把生物细胞束缚在 一定空间内，然后用于催化有机化合物的生物转化，从而得到所需产物。固定化 微生物细胞生物转化法将微生物的生长与它们的生物催化过程相分离。该法的优 点是固定化细胞可以长期保持其稳定性，并可以反复使用。缺点是固定化细胞的 生物转化活性比游离细胞的生物转化活性低。这主要是由于固定化基质对化舍物 天津火学硕士学位论文第一章前言 的透过性增加了额外屏障的原因。固定化细胞常采用凝胶基质，如聚丙烯酰胺凝 胶、海藻酸钙和卡拉胶凝胶，以及其它的多孔性聚合物等，也可采用纤维索类聚 合物将细胞吸附在固体表面。固定化细胞可在摇瓶内催化反应，更为经济的方法 是用柱式反应器进行固定化细胞生物转化。固定化细胞也可以悬浮于培养基中在 发酵生长的同时进行生物转化，以保证辅酶的再生以及新活性细胞的生长，维持 催化反应的最高活性水平。固定化酶和固定化细胞技术可使生物催化反应在固定 床内连续进行，这将使生物催化法具有工业化应用价值。 固定化细胞的制备方法主要有吸附法、共价法、交联法和包埋法四种。生 物催化剂( 细胞或酶) 通过物理学方法固定在高聚物微囊内的过程称为包埋法 ( e n t r a p m e n t ) 。常用的生物包埋材料有琼脂、卡拉胶和海藻酸钙等，这些材料适 宜包埋完整的细胞。对于酶分子的包埋则要求聚合物的孔径更小，一般采用丙烯 酰胺凝胶。包埋法要求底物能自由进入凝胶内与酶接触发生反应，产物能游离出 凝胶，同时酶分子保留在凝胶内。 大肠杆菌( e s t h e r i c h i ac o l i ) a s l 8 8 1 含有大量的天冬氨酸酶，它能将延 胡索酸转化为l 一天冬氨酸。细胞经培养发酵后，离心收集菌体，采用卡拉胶固 定化细胞。将含天冬氨酸酶的固定化大肠杆菌装填于填充床反应器中，制成柱式 生物反应器。将3 7 。c 的lm o l l 延胡索酸铵( 含1m m o l l m g c l 。，p h8 5 ) 底物溶 液按一定空间速度( s v ) 连续流过生物反应柱，控制达到最大转化率( 9 5 ) 时， 收集转化液。转化液经过滤澄清后，在搅拌下用1m o l l 的h c i 调节p h 值至2 8 ， 于5 过夜结晶，滤取晶体，用少量冷水洗涤抽干，最后在1 0 5 。c 下干燥得l 一天冬 氨酸粗品。 c 、o o h 警一 _ h ( 天冬氨酸酶 h 一邑一h i 1 3 面包酵母在生物催化中的应用 微生物转化，特别是酵母的转化作用，很早就在面包生产、日常生活和醇 类饮料中得到了广泛的应用，这些都是采用混合微生物培养的方法。微生物纯净 菌种的培养是p a s t e u r 在1 8 6 2 年奠定的基础，随后生物化学家进行了广泛的研究 【”，并用于有机合成上，开创了一个新的化学领域。m a u g l 甚至预言生物转化作 用最终将取代传统的有机化学嘲。近十余年来对酵母的研究十分活跃，已扩展应 天津大学硕士学位论文 第一章前言 用到1 6 种类型的化学反应中。 有机化学家在选择一种微生物时，应该优先选择廉价易得的微生物，而面 包酵母世界总产量达6 0 万吨 9 】。同时，它的培养和分离也比较简单，反应时无 需灭菌，只要将底物与细胞混合，在室温下即可进行反应，对反应选择性也比较 专一，使用时只需小规模装置，操作也较简单，因此得到了广泛的应用。 酵母是生物催化中常用的一种微生物。它是单细胞真核微生物，具有典型 的细胞结构，其菌体细胞以卵形为主。酵母的生长温度范围为4 3 0 ，最适宜温 度为2 5 3 0 。酵母在自然界分布很广，主要生长在偏酸性的含糖环境中。酵母 的菌落较不透明，且颜色比较单调，一般会散发出悦人的酒香味。 工业上最常用的酵母属菌是酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，俗名叫 面包酵母( b a k e r sy e a s t ，以下简写为b y ) ，分布在各种水果的表皮、发酵的果 汁、土壤以及酒曲中。面包酵母中含有脱氢酶、酯酶、丙酮酸脱羧酶及烯醇酸( 酯) 还原酶等多种酶类，参与多种不对称化学反应，可将其分为以下几类进行讨论。 1 3 1 还原反应 氧化还原酶的作用必须要有辅因子的参与，因此在实际应用时更倾向于利 用完整的微生物细胞而非提取的酶。面包酵母中含有较为丰富的氧化还原酶系， 是一种较为理想的生物还原剂。 1 3 1 1 酵母细胞催化0 = 0 双键的还原 ( 1 ) 一般的醛羰基和酮羰基的还原 含羰基的化合物用面包酵母进行不对称还原是应用最广泛的反应之一。 1 8 9 8 年，w i n d i s e h 使用酵母将呋喃醛还原成呋喃醇，并由m a c l e o d 和c e r v i n k a 进一步完善推广应用【l o j 。 面包酵母催化前手性酮的不对称还原 1 1 - 1 7 】。1 9 4 3 年的有机合成一书中， 详细阐述了面包酵母将1 羟基- 2 丙酮不对称还原生成( r ) 一丙二醇( p g ) 的反应l l “。 1 9 8 0 年，以面包酵母为介质的还原反应作为一种重要的合成历程再一次出现在 有机合成上。从乙酰乙酸乙酯到( s ) 乙基3 羟基丁酸乙酯1 1 9 ，继而从2 , 2 一二 甲基一1 ，3 环己二酮到( s ) 3 羟基2 ，2 二甲基环己酮1 2 0 1 的生物转化过程均被报道， 因此，面包酵母参与的不对称还原被认为是有机合成化学中种有用的方法。但 是，这种方法还不适合大规模生产手性醇1 2 l 】。 简单脂肪酮或芳香族酮被酵母还原时遵守p r e l o g 规则，产生相应的( s ) 醇。 多数长链酮不能被酵母还原，只有长链甲基酮才能被酵母催化还原吲。酶能将 化合物1 转化成手性化合物2 t 2 习( r 1 和r 2 = m e 、e t 、n p r 、n b u 、b z ) 。得到的 仲醇主要是s 构型，只有3 羟基庚醇( 由3 - 庚酮还原得到) 主要是r 构型。而 天津火! 学硕士学位论文 第一章前言 具有空间障碍的酮( 如4 - 辛酮、叔丁基甲基酮、异丁基异丙基酮和正戊基苯基酮) 都不能被还原。 r l r 2 二窟o + 2 h i 骂r r l 吣2 h o r 2 hj1 酶能区别化合物中7 c 体系的r e 和s i 面，在羰基的还原中，氢转移到前手性 酮3 的r e 面，生成醇4 。用r l 代表与羰基相邻的大取代基，r s 代表小取代基， 生物转化用下式表示【2 4 1 ： 4 酵母不仅可借助还原酶的作用将羟基丙酮还原成( r ) 1 ，2 丙二醇，同时，在 氧化还原酶作用下它还将( r ) - l ，2 丙二醇氧化成羟基丙酮t 2 5 】。因此如果把消旋的 1 ，2 丙二醇与酵母共同培育，则借助酶的立体选择性氧化反应，只将( r ) 异构体 氧化，可分离出( s ) 1 ，2 丙二醇。而氧化形成的羟基丙酮又可在酵母还原酶作用下， 还原成( r ) 一1 ，2 丙二醇，这样可达到使消旋体分离的目的。 二羟基丙酮衍生物经酵母催化还原生成具有光学活性的二醇【2 6 1 ，化学产率 可商达8 0 ，e e 值大于9 7 。 h 。火 o o h ； 壁：y ，h o 、人，o 如果还原时使用b - 酮酸，最后可用3 ，5 - 二硝基苯甲酸酯的形式进行分离。 不同取代基对于产物构型、比值影响很大。在面包酵母还原氯代乙酰乙酸酯的过 程中，实验数据表明醇的组分对微生物还原有影响。r 链增长不仅影响e - e 值， 还会改变产物构型。l - 肉毒碱的制备就采用了这个方法【2 5 1 。 内强 垄! 坠兰坚主堂竺堡苎 苎二主堕童 _ _ _ h - _ - - - _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ - - _ _ _ - 口。、， 掣o h c t 叭c 瓣骂c t 八c 帜+ c j 儿c o o r 环状酮的还原和直链酮的还原情况相似，生成环状手性醇。具有生物活性 的膦酰基氨基酸，能有效抑制癫痫症和帕金森氏综合症2 7 1 。其中手性环状二烷 基( 3 一羟基- 烯基) 膦酸酯利用酵母催化还原相应酮制各而得到，化学产率为5 4 ， e , e 值达到7 5 。 敝o e l ) 2 一。埝段2 n ： 酵母也可以还原二酮类化合物，但是c 【一二酮被面包酵母还原的产物般不 会停留在酮醇结构阶段，它会被进一步还原为二醇。首先是位阻小的羰基被还原 为( s ) 旺一羟基酮( p r e l o g 规则) ，然后位阻稍大的酮被进一步还原，最终产生二醇， 其优势产物为反式构型【2 ”。 环状p 一二酮可被面包酵母选择性地还原为b 一羟基酮，而不产生二羟基化合 物1 2 。新生成的仲醇手性中心的立体结构可以用p r e l o g 规则预测。酵母催化还 原2 一取代的1 ，3 一环戊二酮所得产物分离后用于蛇形菌素( a n g u i d i n e ) 的合成 3 0 l 。 喵乞浮+ 蟛尬。骂冶渊+ 呛“1 伽 1 0 ( 2 ) 小，p - 酮酯的还原 面包酵母在有苯酰甲基氯的混台溶剂中还原旺酮酯，能有效阻止纯酶反应 生成( s ) - c 【一羟基酯，完整细胞参与的反应能生成( r ) - a 羟基酯，化学产率和e e 值 因r l 、r 2 取代基不同而变化，产率最高达到9 0 ，相应的e e 值可达到8 0 a 上1 3 ”。 r oo h9 h r 2 一p h c o c h 2 c ir g p c 0 辩：p c 0 2 雕 天津大学硕士学位论文 第一章前言 无环p 一酮酯易被酵母还原为b 一羟基酯，后者可作为3 - 内酰胺、昆虫激素和 类胡萝 素等合成的手性源。氢负离子h 。按p r e l o g 规则向羰基发生亲核进攻。 还原醇的手性中心构型由底物结构决定，即与羰基两侧取代基的大小有关口2 1 。 。姒噼一r 。从。邸一 面包酵母中存在多种脱氨酶，它们对同一底物具有不同的立体选择性【3 3 i 。 d 型脱氢酶( 属于脂肪酸合成酶系) 对具有短链醇基的b 酮酯( 如d - 酮酸甲酯) 具有高的反应活性。而l 型脱氢酶则对长链醇基的p 酮酯( 如p 酮酸辛酯) 具 有较高的活性。因此还原反应的立体化学结果可以通过对底物的设计而实现。选 用d 或l 一型脱氢酶的抑制剂也可以得到所需构型的产物，例如不饱和化合物( 如 烯丙醇或甲基乙烯酮) 可抑制l 型脱氢酶，使p 酮酯转化反应中d p 。羟基酯的 对映体过量率增加【3 4 l ，而l b 。羟基酯的纯度降低。将酵母固定在聚氨酯胶内会 得到相同的结果1 3 ”。 在8 酮酯的还原中，加入硫化合物可以提高反应速率以及对映体选择性， 带有巯基的硫化合物，例如l 一半胱胺酸和2 氨基乙硫醇的盐酸盐在反应中可作 为n a d ( p ) h 的再生氢源口”。 o 【单取代p 酮酯被酵母还原产生非对映体顺式和反式p 羟基酯，其产物的 比例不是l ：1 ，这是由于烯醇化引起的快速原位消旋作用改变了动力学拆分的 结果。顺，反非对映体的比率取决于还原过程中酶的立体选择性1 3 ”，n 取代基较 小时，主要生成顺式非对映体，而叶取代基增大时，选择性相反。 r wh o f f m a n n 用面包酵母还原a 烃化的b 酮酸酯。在还原o 【一甲基乙酰乙 酸乙酯时，c 3 位形成s 构型，c 2 位构型是r 、s 构型均有。把这个还原产物的 羟基经硅烷化后再延伸碳链，可以生成( s ) s t e g o b i n o n e ，它是粮食甲虫的信息素。 o_ o h c 一2 墙一c 一2 h s 亡h 3c h 3 徘 。八州人 r 天沛大学硕士学位论文第一章前言 与直链酮酯不同，环状酮酯在被酵母还原时，因为旺，b 一碳碳键不能旋转， 增加了分子的刚性，总是产生顺式p ，羟基酯口。因此，环状b 酮酯还原反应的 对映体选择性总是比无环酮酯还原反应的立体选择性高。 ( 3 ) 其它酮类的还原 酵母还原法同样可以用于带有硝基、氟、硫和杂环功能基化合物的还原。 芳香族的p 一或t 硝基取代的酮类在水有机溶剂中被酵母还原时遵守p r e l o g 规则，生成具有光学活性的( s ) 硝基醇，后者是不对称合成中的常用模块。产物 转化率最高可达1 0 0 ，e e 值均在9 0 以上j 。 o 0 h g k m 一k m 有光学活性的含氟醇类化合物在铁电液晶、药物以及新陈代谢研究工具等 方面有潜在的应用性，它们可由面包酵母还原相应的酮而得到。( 三氟乙酮) 二 苯衍生物在酵母的催化还原作用下生成r 型的相应醇，r 取代基为h 时，化学 产率和e c 值分别为7 4 、9 6 4 0 1 。 o o h 叩r 旦叩孙r 在羧酸衍生物y 碳上苯磺酰甲基的引入中，t r a n $ - g t 苯磺酰基环戊酮在酵母 催化条件下可得到i s ，2 r 舡苯磺酰基环戊醇及其衍生物，e , e ，值大子9 5 h 1 1 。 在低温( 4 ) 条件下，面包酵母能催化还原3 - 羰基一3 一苯基丙氰得到唯一的产 物( s ) 一3 羟基3 苯基丙氰( 产率5 9 ) ，而在室温条件下，得到的是还原产物和 烷基化产物的混合物【4 2 1 。 唧 。勰 咖 声 r 尹q 瓯 孙 她 。令r 天津大学硕十学位论文第一章前言 扩甜睾州 手性氨基醇及其衍生物广泛应用于不对称合成中。面包酵母还原前手性 n ( 2 氧丙氧基) 一邻苯二甲酰亚胺( 化学产率为7 3 ；e e 值大于9 8 ) ，产物在酸 存在条件下水解得到( s ) 2 羟基丙氧胺基盐酸盐h 引。 吖骂瞄母c i - h 3 n + - o 钿 带有环状硫醚结构的1 3 - 酮酸酯用酵母还原可得e e 值为8 5 的立体选择性 产物。此反应用于烟草甲虫信息素a n h y d z o s e r r ic o m i n e 的合成。 - s a 一骂一地l 、s j 1 3 1 2 酵母细胞催化烯烃的还原 ( 1 ) 旺，3 - 不饱和酯的还原 在v e 合成中，具有光学活性的苯骈吡喃环可由拆解方法得到，其中五碳手 性片断经酵母还原烯烃得到【4 4 1 。 宁c h 3宫尹 e t o ，删3 吗e t o ，人v 佣 面包酵母催化还原烯酸酯的反应首先进行水解，然后发生还原，此反应实 际发生在烯酸阶段。面包酵母还原3 苯硫代甲基2 丁烯羟酸内酯可得到( r ) 3 - 苯 硫代甲基丁酸内酯( e e 为9 9 ) ，后者可作为c 5 模块而广泛应用于萜类化合物 合成【4 5 1 。 1 0 天津大学硕七学位论文第一章前言 8 “盥 厂、一。”s ( o ) n p h 拶 o ( 2 ) 不饱和酮的还原 n ，d 一不饱和酮由酵母催化还原得到相应的饱和( s ) 一酮【4 6 】。 面包酵母还原d 一亚甲基酮中的烯键，并继续还原其中的c = o 双键，且c = c 双键的立体选择性和还原速率在很大程度上受r 1 ，r 2 基团的影响。只有r 1 = m e 的a 一亚甲基酮能得到高对应体选择性的a 甲基酮，e e 值大于8 8 【4 7 l 。 o r ，贮一r o h r 2 ( 3 ) 烯丙醇及其衍生物的还原 c 【取代或b - 取代的烯丙醇中c = c 双键可被还原生成手性醇，具有好的对映 体过量率。如l ，3 一共轭二烯5 中仅旺，b 一双键被还原生成化合物6 1 4 8 1 。 丫叩明一丫佣 殄厶删上羔：，殓夫，o h 56 2 取代的乙缩丙稀醛在酵母的催化还原条件下得到高立体选择性的醇，产物 的e e 值大于9 8 4 9 1 。 ( 4 ) 硝基烯烃的还原 含硝基的烯烃很容易被酵母还原为手性硝基烷烃【5 。】。不同的伐，p 二取代和 三取代的硝基烯烃可被酵母还原为手性硝基烷烃。c t ，3 - 二取代硝基烯烃被还原 的立体选择性一般，e e 值最高可达5 2 。三取代的硝基烯烃的还原有很好的对 映体选择眭、中等的非对映体选择性和较高的化学产率。 一 u 天津大学硕士学位论文第一章前言 r n 0 2 ( 5 ) 胺中不饱和c = c 双键的还原 b r a c h y s t a m i d eb 中的苯乙烯基不饱和双键可以被酵母催化还原，生成 b m c h y s t a m i d ea 6 ，产率为5 7 5 1 。 妒刖吖当圹c 鼢儿丫 1 3 1 ，3 酵母细胞催化还原叠氮基 在用化学酶法合成毗咯 2 ，1 - b f n - - - 氮杂萘酮的过程中，用酵母还原具有叠氮 基的化合物可得到相应的胺，产率仅达2 0 【5 2 1 。 r l r 2 1 ，3 2 转移和合成反应 一：彬佣加 1 3 2 1 醛缩台反应 醛缩合反应的机理直到九十年代才得以阐明 5 3 1 ，反应中涉及到丙酮酸脱羧 酶，它能够催化丙酮酸脱羧产生c 2 单元，并催化c - 2 单元从底物醛的s i 一面加 成，形成( r ) a 。羟基酮。偶姻产物可被脱氢酶还原成赤型二醇。还原反应是面包 酵母菌的特点，反应的立体化学遵循p r e l o g 规则，产物二醇的对映体过量率一 般大于9 0 。该反应需要m 9 2 + ，并涉及醛和焦磷酸硫胺素( 辅酶) 结合形成中 间体的过程。 面包酵母能催化d ，p 不饱和芳香醛和a ，p 一不饱和脂肪醛与* 酮酸进行偶姻 反应生成手性二醇i 川，这些化合物是天然产物合成的重要中间体1 5 5 。肉桂醛和旺一 甲基肉桂醛被酵母催化转变为相应的( 2 s ，3 r ) 一二醇，其产物的对映体过量率为 8 5 9 5 。 列 一 刚 天津火学硕士学位论文 第一章前言 1 3 2 2 碳碳双键的加水反应 碳碳双键的不对称加水具有很好的手性合成应用前景，面包酵母能催化取 代巴豆醛衍生物中碳碳双键的加水反应和醛基的还原反应【翊。该反应需要含有 苄氧基或苯甲酰氧基化合物的诱导 5 6 。 卧v 。一洲卸骂卧v 。人i 黑嗡xx 1 3 3 水解反应 x = h ，、o 利用冻干面包酵母中的脂肪酶可有效的催化拆分外消旋体乙酸1 炔一3 酯口8 和外消旋内酯的乙酸酯1 5 9 】，并可有效地抑制副反应。 r 人詈r n 8 、+r 人丽矿飞+ 萼芷h + 斗可斗 o a c r 人 0 综上所述，由于具备多种优点，所以面包酵母在有机化学中有着广泛的用 途。随着研究的进一步深入，人们将会发现面包酵母的更多应用，绿色化学的发 展也将促进面包酵母在有机合成中的应用。 1 4 非水介质中的生物催化反应 1 4 1 非水介质中的生物催化反应 人工合成的有机物一般在水溶液中溶解度较小，水作为溶剂还容易引起一 些非天然有机化合物的水解、消旋、聚合和分解等副反应，因此有机合成反应多 数选用非水介质。但是，天然酶主要是在水溶液中发生催化作用。1 9 8 4 年a m k l i b m a o v 等研究了酶在非水介质中的催化反应t 6 0 ，发现同一种酶在不同的有机溶 剂中可以表现出不同的立体选择性，这些研究促进了生物催化反应溶剂工程的研 究。 华 天津大学硕士学位论文 第一章前言 许多天然酶在非水介质中的催化活性下降，如旺胰凝乳蛋白酶和枯草芽孢 杆菌蛋白酶的催化活性在脱水正辛烷中降低4 5 个数量级，在其他有机溶剂中也 有类似的情况。影响非水介质中酶活性的因素很多，如溶剂的性质、水的含量、 化学环境的p h 值、扩散因素、底物和产物的溶剂化等，其中非水介质中的水的 含量对酶的催化活性影响为最大。 在有机溶荆中酶的催化活性与有机溶剂的亲水性呈负相关性，通常在疏水 性溶剂中酶的催化活性比在亲水性溶剂中高，这是因为疏水溶剂夺取酶分子表面 必需水的能力比亲水性溶剂弱。添加微量水到含酶的疏水性有机溶剂中或用其他 方法提高体系的水活度，可使酶的催化活性升高，但是水活度不能准确地预测极 性有机溶剂对酶活性的影响，因为存在着酶的溶剂化作用1 6 1 】。 反应介质的p h 值是影响菲水介质酶反应的重要因素之一，p h 值影响着酶 的离子化，而离子化状态决定了酶的构象，酶的构象又影响了酶的活性和选择性。 酶蛋白质中的可电离基团在有机溶剂中不能电离，因此在使用前必须对酶进行预 处理。在非水介质中，p h 值不易测定和调控，为此先将酶溶解于少量最适宜p h 值的缓冲溶液中直接冻干或从最适宜p h 值缓冲溶液中沉淀，可以保持酶的电离 状态。这样处理后可增加酶的反应速率，有时可增加一个数量级，从最适宜p h 值水溶液中沉淀的酶在有机溶剂介质中也表现出较高的酶活性。 1 4 2 非水介质中酵母细胞的能量来源 面包酵母催化的生物还原反应一般是在添加了碳水化合物的水溶液中进 行，反应是利用其体内的脱氢酶进行的，需要烟碱辅酶的参与。因此，烟碱辅酶 从氧化态到还原态的再生是反应得以进行的关键因素，而烟碱的再生是伴随着葡 萄糖的氧化过程进行的，如下图所示f 6 甜。 选择碳水化合物作为n a d ( p ) h 再生的能源并不是非常合适，因为在还原反 应中碳水化合物的用量相对于底物来说是大大过量的，而且伴随着碳水化合物的 新陈代谢会生成大量的c 0 2 和有害副产物。t k o m e t a n i 等人的实验表明，在从 乙酰乙酸乙酯( d q 到( s ) 一乙基3 羟基丁酸乙酯( ( s ) i e3 - i - 1 1 3 ) 的反应中，葡萄糖消耗 的速率是e a 还原速率的五倍，而且在有氧条件下，葡萄糖消耗完毕后，还原反 应能持续发生。这个结果证明了以酵母为媒介的还原过程是可以用乙醇作能源 的，这和他们所发现的乙醇可以在有氧条件下代替葡萄糖，而无氧条件下却不行 1 4 恭净 、 衄 加 嘲 鼬 一 一 天津大学硕士学位论文 第一章前言 的结论相一致。乙醇的消耗速率仅为e a 还原速率的二倍。化学产率和光学纯度 与常规方法的结果也比较相近。这种方法既干净又高效，除了c 0 2 以外没有其 它副产物，能源利用率也比较高1 6 3 - 6 5 】。 + 。o h e t o h n a d c e ) 。h 0 2 hk c a r b o n y lr e d u c t a s e c o ，n a d ( p ) h 、：o 在以面包酵母为媒介的还原反应中，n a d ( p ) h 作为还原过程中氢的提供者， 必须连续不断的由细胞中相应的氧化过程再生。而且，这个氧化过程必然伴随着 一种底物的还原。此氧化过程及其相配合的以面包酵母为媒介，以碳水化合物为 能源的传统方法还原前手性酮的还原过程的机理已由y a m a d a 等人阐明【6 2 】。 g l u c o s e i + l n a d ( p )n a d p h t 一 g l u c o s e6 p h o s p h a t e _ 二二+ 6 p h o s p h o g l u e o n o 1 a e t o n e g 一6 - pd e h y d r o g e n a s e j ； 6 - p gd e h y d r o g e n a s e r 1 6 u 1 。s e 5 j 一“。s n “a l e1 。：；j 7 弋+ 6 。9 8 9 “。8 ”“。“4 。 n a d p h n a d ( p ) 在利用乙醇作为能源的新方法中，n a d ( p ) h 是由n a d p ) 十通过乙醇到二氧 化碳的氧化过程再生的，同时伴随着酮的还原。t k o m e t a n i 等人就1 羟基2 丙 酮和乙酰乙酸乙酯的还原提出了以乙醇或乙酸乙酯为能量来源的反应机理，1 。 羟基2 。丙酮还原过程中产生的n a d ( p ) + ，在乙醇到乙酸乙酯的氧化过程中，被脱 氢酶或脱羧酶还原为n a d ( p ) h ；另一方面，e a 还原过程中产生的n a d ( p ) + ，在 乙酸乙酯到二氧化碳的氧化过程中，被还原成n a d ( p ) h 。n a d 俾) h 通过脱离t c a 循环的苹果酸酯脱氢生成丙酮酸酯的过程再生【6 6 1 。 e t h a n o l 7 叮8 c e t a t e 兴r e s p a i r a t o r y c h a i n c 0 2 n a d + n a d p h n a d 十 n a d p h 塔 p ga c ( p g l1 ( a c ) 天津大学硕士学位论文第一章前言 。m 8 “0 1 7 弋”州。 n a d + n a d h 0 2 t c ac y c l e r e s p a i r a t o r y c h a i n ”8 1 批7 ：5 9 7 甜。 n a d pn a d p h e 3 - h b e a 可作为构造模块的手性材料，其光学纯度必须超过9 5 。据报道，面包酵母 参与e a 还原得到( s ) 一e3 - h b 的光学纯度可以达到8 3 9 0 e e 【6 7 1 。1 9 8 8 年，面 包酵母中参与e a 立体选择性还原的两种氧化还原酶( 以n a d p h 为辅酶) 得到 纯化和表，征【6 引。一种酶( 对e a 的k 。值为o 9 r a m ) 催化此反应得到( s ) e3 - h b ； 另一种酶( 对e a 的k 。值为1 7 0 m l v l ) 则得到( r ) 。e3 - h b 。因此可以认为前一种 酶是e a 还原反应的主要参与者。事实上，批量培养时产物的光学活性大大提高， 可以达到9 9 e c 【6 9 1 。他们同时研究了反应过程中氧气的供应情况( 用传质的容 积系数k l a 衡量) 和乙醇的利用率( 底物消耗速率与乙醇消耗速率之比，v s u b v e 。h ) 之间的关系f 7 0 】。结果表明，底物的存在与否不影响乙醇的消耗速率；在伴随辅 酶n a d p h 再生过程的e a 还原反应中，乙醇的利用率随着k l a 的增加而降低， 另一方面，伴随辅酶n a d h 再生过程的反应中，乙醇的利用率不随着k l a 的变 化而变化。 1 5 亚胺类化合物催化还原的现状 对c = n 双键的立体选择性还原提供了一种从前手性酮到光活性胺及其衍生 物的有价值的还原氨化过程1 7 “。光活性的胺及其衍生物在医药品、化学品乃至 光电子学及膜技术中越来越多的应用，使得上述反应有了很大的潜在应用价值。 目前对亚胺( s c h 漪碱) 的还原多数是利用金属配合物作为催化剂进行不对 称加氢反应得到光活性的胺。1 9 9 2 年，c o m e l i s 和j o h a n n e s 等人用金属铑与单磺 酸盐( 2 s ，4 s ) 二( 二苯基膦) 戊烷的配合物催化氢化n - 苯甲基苯乙酰亚胺得到相应 的胺 7 2 1 ，其e e 值可达到9 4 。1 9 9 5 年，t o s h i a k i 和k a z u o 等人成功地在二麟 铱( i ) 催化体系及多种硫亚胺或亚胺作辅助催化剂的条件下对1 烷基一3 ，4 一二氢异 喹啉进行不对称加氢【7