（食品科学专业论文）草鱼鱼鳞胶原肽的制备及其特性研究.pdf

草鱼鱼鳞胶原肽的制各及其特性研究 摘要 淡水鱼加工过程中会产生大量的下脚料，如鱼鳞、鱼皮、鱼骨等，我国每年大 约可产生6 5 万吨的鱼鳞，除部分出口和加工外，绝大多数未能很好的开发利用。鱼 鳞中含有丰富的胶原蛋白，可通过水解制成高附加值的胶原肽，但目前对淡水鱼鱼 鳞胶原肽的提取和性质的研究较少。本课题以草鱼鱼鳞为对象，研究蛋白酶种类、 酶解条件对草鱼鱼鳞水解效果的影响、胶原肽制备的工艺优化、鱼鳞胶原肽的组成 和功能性质等，为开发高附加值的鱼鳞胶原肽奠定基础。主要研究内容及结果如下： ( 1 ) 研究了蛋白酶种类对草鱼鱼鳞水解效果的影响。在胃蛋白酶、复合蛋白酶、 木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶等四种蛋白酶中，木瓜蛋白酶水解草鱼鱼鳞的效率较高， 水解度和氮收率分别达到7 5 4 和7 9 4 4 。胃蛋白酶水解草鱼鱼鳞时氮收率较高且 水解产物在低温下具有凝胶形成能力。草鱼鱼鳞胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白 酶和复合蛋白酶的水解产物分别呈乳白色、淡黄色、淡黄色和黄色，前两种水解产 物口味平淡，碱性蛋白酶水解产物呈弱苦味，而复合蛋白酶水解产物苦味较强。 ( 2 ) 研究了水解条件对胃蛋白酶水解草鱼鱼鳞效果的影响，并通过正交试验对 胶原肽的制各工艺进行了优化。水解温度、底物浓度、加酶量和起始p h 值对胃蛋 白酶水解草鱼鱼鳞水解产物的水解度、氮收率和凝胶强度均有显著影响( p 0 0 5 ) 。 以凝胶强度和氮收率为参考指标，胃蛋白酶水解草鱼鱼鳞的适宜水解条件为：水解 温度为6 5 ，底物浓度为5 ，加酶量为1 4 0u gp r o ，起始p h 值为4 0 ，水解时间 为1 2 0 m i n 。在此条件下，水解度、氮收率和凝胶强度分别为1 4 6 、6 4 3 8 和2 0 5 1 9 。 ( 3 ) 研究了水解条件对木瓜蛋白酶水解草鱼鱼鳞效果的影响，并通过正交试验 对胶原肽的制备工艺进行了优化。水解温度、起始p h 值、底物浓度和加酶量对木 瓜蛋白酶水解草鱼鱼鳞水解产物的水解度和氮收率均有显著影响( p 0 0 5 ) 。以氮收 率和水解度为参考指标，木瓜蛋白酶水解草鱼鱼鳞的适宜水解条件为：水解温度为 6 0 ，起始p h 值为5 0 ，底物浓度为5 ，加酶量为3 0 0 0u gd o ，水解时间为1 2 0 m i n 。 在此条件下，水解度和氮收率分别为1 2 6 8 和8 9 4 2 。 ( 4 ) 研究了草鱼鱼鳞胶原肽的组成和功能性质等。鱼鳞胶原肽中甘氨酸、脯氨 酸、羟脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量较高。采用胃蛋白酶制备的胶原肽的组分较少、 分子量较大，而采用木瓜蛋白酶制备的胶原肽的组分较复杂，平均分子量较小。采 用胃蛋白酶制备的鱼鳞胶原肽经s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶过滤层析后可分为两个组分， 随着水解时间延长，大分子量组分的比例下降，而小分子量组分比例增加。采用胃 蛋白酶制备的胶原肽具有较高的乳化性、起泡性、泡沫稳定性和粘度，溶解性稍差， 而采用木瓜蛋白酶制备的胶原肽的溶解性较好，乳化性、起泡性、泡沫稳定性和粘 度较低。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 采用胃蛋白酶制备的鱼鳞胶原肽具有较好的胶凝性能，质量浓度为2 5 ( w v ) 的鱼鳞胶原肽的胶凝温度为9 1 2 ，熔化温度为1 1 8 0 。随着质量浓度的增加，鱼 鳞胶原肽的凝胶强度增加，在胶原肽溶液p h 值为6 或8 时凝胶强度较大。在胶原 肽溶液中适量添加转谷氨酰胺酶可增强其凝胶强度，而添加n a c i 会降低其凝胶强 度。在白鲢鱼糜中添加鱼鳞胶原肽会使鱼糜凝胶的凝胶强度、硬度、内聚性、弹性、 咀嚼力等减小，在食品工业中应用时可利用鱼鳞胶原肽的胶凝性质和乳化性等特性 而用作胶体稳定剂、乳化剂等，而不适宜用作鱼糜制品添加剂。 关键词：草鱼鱼鳞；胶原肽；酶解；功能性质 2 草鱼鱼鳞胶原肽的制各及其特性研究 a b s t r a c t f i s h e r i e sa n df i s hp r o c e s s i n gc r e a t el a r g ea m o u n to fb y - p r o d u c t s ，s u c ha sf i s hs c a l e ， f i s hs k i na n df i s hb o n e ，a n dt h e r ea r ea p p r o x i m a t e l y6 5 0 ，0 0 0t o n sf i s hs c a l e se v e r yy e a ri n c h i n a , m o s to ft h e ma r ed i s c a r d e de x c e p tt h a ts o m ea r eu t i l i z e da n de x p o a e d a sk n o w n , f i s hs c a l e sc o n t a i na b u n d a n tc o l l a g e nw h i c hc a l lb eu s e dt op r e p a r ev a l u a b l ec o l l a g e n p e p t i d e h o w e v e ll i t t l ew o r kh a sb e e nd o n eo np r e p a r a t i o no fc o l l a g e np e p t i d ef r o mf i s h s c a l e so fg r a s sc a r pa n de v a l u a t i o no fi t sc h a r a c t e r i z a t i o n s i no r d e rt oo f f e rf o u n d a t i o nf o r p r e p a r i n gv a l u a b l ec o l l a g e np e p t i d e ，t h ea i mo ft h i sw o r kw a st os t u d yt h eh y d r o l y z i n g e f f e c t so fp r o t e a s e st y p e sa n dh y d r o l y z i n gc o n d i t i o n so nt h eh y d r o l y s a t e so fg r a s se a r p s c a l e s ，t h eo p t i m i z a t i o no fh y d r o l y z i n gp r o c e s s ，a n dt h ec h a r a c t e r i z a t i o no fs c a l ec o l l a g e n p e p t i d e t h em a i nr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ( 1 ) t h ee f f e c t so fp r o t e a s et y p e so nh y d r o l y s i so fg r a s sc a r ps c a l e s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e r ew a sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gp e p s i n , p r o t a m e x ，p a p a i na n d a l c a l a s c a m o n gt h e f o u r p r o t e a s e s ，t h eh y d r o l y s a t e s o fp a p a i nh a dt h eh i g h e s t h y d r o l y z i n gd e g r e e ( 7 5 4 ) a n dn i t r o g e nr e c o v e r y ( 7 9 4 4 ) ，w h i l e t h e p e p s i n h y d r o l y s a t e sh a dah i 曲n i t r o g e nr e c o v e r ya n dc o u l df o r mg e l i nl o wt e m p e r a t u r e a c c o r d i n g t ot h e s e n s o r y e v a l u a t i o nt o p e p s i n , p a p a i n , a l c a l a s e a n dp r o t a m e x h y d r o l y s a t e so fg r a s sc a r ps c a l e s ，t h e yw e r em i l k y , y e l l o w i s h , y e l l o w i s ha n dy e l l o w r e s p e c t i v e l y , t h ef i r s tt w oh y d r o l y s a t e st a s t e dp l a i n ，t h ea l c a l a s eh y d r o l y s a t et a s t e db i t t e r l o w l y , w h i l e t h ep r o t a m e xh y d r o l y s a t et a s t e db i t t e rs t r o n g l y ( 2 ) t h ee f f e c t so fh y d r o l y z i n gc o n d i t i o n so nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fg r a s sc a r p s c a l e s 、析t l lp e p s i na n dt h eh y d r o l y z i n gp r o c e s so p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw e r e s t u d i e d t h e r ew a sas i g n i f i c a n te f f e c to fh y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp hv a l u e ， s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n , a n dp e p s i nd o s a g eo nt h eh y d r o l y z i n gd e g r e e ，n i t r o g e nr e c o v e r y a n dg e ls t r e n g t ho fp e p s i nh y d r o l y s a t e s ( p o 0 5 ) h y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r eo f6 5 c ，i n i t i a l p hv a l u e4 0 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n5 ( w v ) ，p e p s i nd o s a g eo f1 4 0u gp r o ，a n da h y d r o l y s i st i m eo f12 0m i nw e r ef o u n dt ob et h eo p t i m u mc o n d i t i o n st oo b t a i nah i g h e r g e ls t r e n g t ha n dn i t r o g e nr e c o v e r y , a n dt h eh y d r o l y z i n gd e g r e e ，n i t r o g e nr e c o v e r y , g e l s t r e n g t ho fp e p s i nh y d r o l y s a t e sw e r e1 4 6 ，6 4 38 a n d2 0 5 1g ，r e s p e c t i v e l y ( 3 ) t h ee f f e c t so fh y d r o l y z i n gc o n d i t i o n so nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fg r a s sc a r p s c a l e s 、析t l lp a p a i na n dt h eh y d r o l y z i n gp r o c e s so p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw e r e s t u d i e d t h e r ew a sas i g n i f i c a n te f f e c to fh y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp hv a l u e ， s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n , a n dp a p a i nd o s a g eo i lt h eh y d r o l y z i n gd e g r e ea n dn i t r o g e n 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 r e c o v e r yo fp a p a i nh y d r o l y s a t e s ( p 0 0 5 ) h y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r eo f6 0 c ，i n i t i a lp h v a l u e5 0 ，p a p a i n d o s a g eo f3 0 0 0 u gp r o ，s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n 5 ( w v ) ，a n da h y d r o l y s i st i m eo f12 0m i nw e r ef o u n dt ob et h eo p t i m u mc o n d i t i o n st oo b t a i nah i g h e r n i t r o g e nr e c o v e r ya n dh y d r o l y z i n gd e g r e e ，a n d t h eh y d r o l y z i n gd e g r e ea n dn i t r o g e n r e c o v e r yo fp a p a i nh y d r o l y s a t e sw e r e12 6 8 a n d8 9 4 2 ，r e s p e c t i v e l y ( 4 ) c o m p o s i t i o na n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fs c a l ec o l l a g e np e p t i d ew e r es t u d i e d t h ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o no ft h es c a l ec o l l a g e np e p t i d ep r e p a r i n gu s i n gt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n sr e v e a l e dt h a tt h e r ew e r el a r g ea m o u n to fg l y c i n e ，p r o l i n e ，h y d r o x y p r o l i n e ， g l u t a m i ca c i da n da l a n i n e c o m p a r e dw i t hc o l l a g e np e p t i d ep r e p a r e dw i t hp a p a i n , t h e c o l l a g e np e p t i d ep r e p a r e d 、衍t hp e p s i nh a dl a r g e ra v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t , l e s sf r a c t i o n s t w of r a c t i o n so fc o l l a g e np e p t i d ep r e p a r e dw i t hp e p s i nw e r eo b t a i n e dt h r o u g hs e p h a d e x g - 10 0 g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y a st h eh y d r o l y z i n gt i m ep r o l o n g e d , t h el a r g e r m o l e c u l a rw e i g h tf r a c t i o n so fp e p s i nh y d r o l y s a t ed e c r e a s e da n dt h es m a l l e rm o l e c u l a r w e i g h tf r a c t i o n si n c r e a s e dg r a d u a l l y t h ec o l l a g e np e p t i d ep r e p a r e dw i t l lp e p s i no b t a i n e d b e t t e re m u l s i f y i n gp r o p e r t y , f o a m i n gp r o p e r t ya n dh i g h e rv i s c o s i t y , w h i l et h ec o l l a g e n p e p t i d ep r e p a r e d 、 ，i t hp a p a i nh a db e t t e rs o l u b i l i t y , p o o r e re m u l s i f y i n gp r o p e r t y , f o a m i n g p r o p e r t ya n dl o w e rv i s c o s i t y t h ec o l l a g e np e p t i d ep r e p a r e d 、忻t hp e p s i nf r o mg r a s sc a r ps c a l e sh a dg o o dg e l p r o p e r t i e s ，t h eg e l l i n gp o i n ta n dm e l t i n gp o i n to f 2 5 ( w v ) c o l l a g e np e p t i d ew e r e9 1 2 ( 2 a n d11 8 0 c r e s p e c t i v e l y t h eg e ls t r e n g t ho fc o l l a g e n p e p t i d ep r e p a r e dw i t hp e p s i n i n c r e a s e d 谢t i lt h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o n ，a n dh a dh i g h e rg e ls t r e n g t ha tp h6o r8 t h e g e ls t r e n g t ho fc o l l a g e np e p t i d ei n c r e a s e d 谢t l lp r o p e ra d d i t i o no ft r a n s g l u t a m i n a s e ，w h i l e t h e g e ls t r e n g t hd e c r e a s e d 州t l lt h ea d d i t i o no fn a c l t h eg e ls t r e n g t h , h a r d n e s s ， c o h e s i v e n e s sa n de l a s t i c i t yo fs i l i v ic a r ps u r i m ih a dat e n d e n c yt or e d u c ew i t ha d d i t i o no f s c a l ec o l l a g e np e p t i d e ，c o l l a g e np e p t i d ew a sn o ts u i t a b l et ob ea d d e dt os i l v e rc a r p s u r i m i ，b u tt h es c a l ec o l l a g e np e p t i d eh a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o na sc o l l o i ds t a b i l i z e ro r e m u l s i f i e r , s i n c et h es c a l ec o l l a g e n p e p t i d eh a v eg o o dg e l a t i o na n de m u l s i f i c a t i o n p r o p e r t i e s k e y w o r d s ：g r a s sc a r ps c a l e s ；c o l l a g e np e p t i d e ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s 4 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：手锋 时间：如7 等月愿日 学位论文使用授权书 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密，商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 黼张申锋撇名： 蛳期：砷年多鹏日 褂期：1 年石月( g 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 草鱼鱼鳞胶原肽的制各及其特性研究 1 前言 1 1 我国淡水产品加工与综合利用 1 1 1 我国淡水产品j n z 现状 中国是世界上渔业最发达的国家，2 0 0 6 年我国水产品总产量为5 2 9 0 万吨( 其 中淡水产品2 4 0 2 7 3 万吨) ，水产品总量连续1 6 年居世界第一位，占到了世界水产 1 3 亿万吨的4 0 以上。全年出口量达到3 0 1 5 万吨，贸易顺差5 0 6 亿美元，继续位 居农产品出口首位。2 0 0 6 年，我国淡水养殖产量为2 1 4 8 3 1 万吨，占到养殖总产量 的6 0 左右( 中国渔业年鉴，2 0 0 7 ) 。可以预见在我国实行海洋捕捞零增长、近海水 体污染加重和赤潮频发的情况下，海水产品产量增加将趋于平缓，而迅速新增的水 产品需求量将由淡水养殖产品的增加来弥补( 熊善柏，2 0 0 7 ) 。 在水产品产量不断提高的同时，水产品加工业得到快速发展，已开发生产出冷 冻冷藏制品、腌制品、干制品、烟熏制品、鱼糜制品、罐头制品及动物蛋白饲料等 多种类型的产品，其中冷冻冷藏制品和腌制品是主要类型。2 0 0 6 年我国共有水产品 加工企业9 5 4 9 个，加工能力1 7 9 9 4 2 万吨年，实际加工量1 3 3 2 4 8 万吨( 其中淡水 产品1 1 7 2 3 万吨) 。但我国淡水产品加工业起步较晚，我国水产品加工企业大多集 中在沿海六省，其加工产量、产值均在全国的9 0 以上，海水产品加工比例已达到 4 8 6 2 ，而淡水产品加工比例仅占9 6 0 。与世界先进地区相比，淡水鱼加工业存 在加工比例低、技术装备水平低、产品技术含量低、加工企业规模小、市场竞争力 弱等问题。因此，我国淡水产品加工发展的重点是：鱼糜制品酶法交联技术、重组 织化技术的研发；鱼糜制品气调保鲜技术的研发；蛋白质分步酶水解技术的研发； 淡水鱼加工成套设备的研发；淡水鱼加工全程质量控制体系的建立等( 熊善柏，2 0 0 4 ； 云龙，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 淡水产品废弃物综合利用 在淡水鱼加工过程中，淡水鱼采肉率低，会产生大量的下脚料，包括鱼皮、鱼 骨、内脏、鱼鳞等，下脚料几乎占到鱼体重量的7 0 。这些下脚料中富含蛋白质、 油脂、矿物质等，如草鱼鱼鳞中的粗蛋白含量在6 0 左右，秋季鲢鱼内脏中的含油 率高达1 9 2 ( 何秋生等，2 0 0 7 ) 。如能充分利用这些成分，不仅可提高鱼类加工的 附加值，同时可减少环境污染，获得良好的经济效益。 目前，鱼类下脚料的利用途径主要包括：加工成饲料鱼粉；将鱼头、鱼骨加工 成骨粉、鱼骨糊、鱼香酥、复合氨基酸钙等( 张憨和张骏，2 0 0 6 ) ；利用内脏提取鱼 油、多肽，提炼e p a 、d h a 制品( 曾学熙等，2 0 0 7 ) ；从鱼鳞和鱼皮中提取胶原蛋 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 白( 钟朝晖等，2 0 0 7 ) 、胶原肽( 刘庆慧等，1 9 9 8 ) ；鱼露、鱼冻的加工( 邵伟等， 2 0 0 6 ：贾冬英等，2 0 0 5 ) ；鱼肚制品的加工等。现阶段，淡水鱼下脚料的综合利用已 引起社会各部门及企业的重视，如湖北水产研究所利用下脚料研制了风味鱼骨酱； 湖北工业大学利用现代生物技术和超微粉碎技术将淡水鱼下脚料综合利用，开发了 下脚料多肽营养液、超微鱼骨粉和保健鱼油三种产品( 李敏等，2 0 0 7 ) 。尽管我国对 下脚料综合利用开展了大量研究工作，研制和生产了一些相关产品，但综合利用鱼 类下脚料的整体水平还不高。 1 2 鱼鳞的组成及其综合利用 1 2 1 鱼鳞的组织结构 鱼鳞是鱼真皮层的变形物，约占鱼体重量的3 5 ，由结缔组织构成。根据鱼 鳞形态的不同，通常分为三种：一种是板鳃鱼( 如鲨鱼等) 所特有的檐鳞；另一种是 斜方型、边缘相联的硬鳞；第三种是骨鳞，这在硬骨鱼类中最多( 刘文涛等，2 0 0 6 ) 。 目前，人们利用的鱼鳞原料都是骨鳞，其结构紧凑，柔软坚韧。 迄今有关鱼鳞组织结构的报道仅限于赤力鱼( p a g r u sm a j o r ) 、鲫鱼等少数鱼种。 i k o m a 等( 2 0 0 3 ) 通过透射电镜( t e m ) 、扫描电镜( s e m ) 、x 射线衍射和红外光谱等 分析手段对赤立鱼鳞进行了系统研究。电子显微镜图显示鱼鳞的表面有类似于年轮 的环形条纹。鱼鳞可分为上下两层：上层为骨质层，主要成分是羟基磷灰石，并零 散地分布着一些胶原纤维；下层为纤维质层，直径7 0 8 0n n l 的胶原纤维在同一薄层 中紧密地平行排列，且与相邻薄层中的胶原纤维成9 0 。夹角，于是形成了由多层薄 片构成的正交式夹板结构。赤立鱼鳞的这种结构与z y l b e r b e r g 等( 1 9 9 1 ) 研究的孔 雀鱼( p o e c i l i ar e t i c u l a t a ) 鱼鳞极为相似，而与z y l b e r b e r g 等( 1 9 8 2 ) 所研究的鲫鱼 ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 鱼鳞的双股螺旋式夹板结构不同。可见，不同品种鱼鳞的结构存 在差异。 1 2 2 鱼鳞的化学组成 不同鱼种鱼鳞的化学成分差别很大( 见表1 1 ) ，并且鱼鳞主要成分的含量随季 节变化而有差异，这会影响到鱼鳞的加工适应性( 钱曼，2 0 0 8 ) 。 由表1 1 可知，淡水鱼鱼鳞的主要成分是蛋白质和灰分。与鲢鱼鳞、鳊鱼鳞和 鲤鱼鳞相比，草鱼鳞中的蛋白质和脂肪含量较低，灰分含量较高。草鱼鳞鳞片较大， 便于收集和加工。干鱼鳞中蛋白质含量约为6 0 * o - 7 0 ，主要为胶原蛋白和硬蛋白( 其 中胶原蛋白占2 0 - 4 0 ) ，鱼鳞中的钙以羟基磷灰石的形式存在，而羟基磷灰石是 灰分的主要成分，这样的组成对提取胶原蛋白和胶原肽比较有利。 6 草鱼鱼鳞胶原肽的制备及其特性研究 表1 1 常见鱼鳞的主要成分( 全年平均值) t a b l el - 1m a i nc o m p o n e n t so ff i s hs c a l e so fs o m ec o m m o nf i s h ( a n n u a lm e a nv a l u e ) 注：【l 】钱曼，2 0 0 8 ：【2 】段蕊等，2 0 0 6 1 2 3 鱼鳞的综合利用 我国淡水鱼资源丰富，2 0 0 5 年淡水鱼总产量为2 1 8 4 万吨，其中有鳞鱼1 3 1 0 万 吨以上，每年大约可产生6 5 万吨的鱼鳞，据统计我国每年废弃的鱼鳞达3 0 万吨( 刘 文涛等，2 0 0 6 ) 。而目前我国淡水鱼加工企业规模较小、分散，对鱼鳞的研发滞后而 未很好的开发利用，这不仅造成了巨大的资源浪费，而且会污染环境。目前，对鱼 鳞的研究和利用主要包括以下几个方面：提取鱼鳞胶原蛋白( 钟朝辉等，2 0 0 7 ；钱 曼，2 0 0 8 ) ；制备鱼鳞胶原肽( 李春美等，2 0 0 5 ；涂宗财等，2 0 0 5 ) ；提取卵磷脂( 吴 继魁和张俊玲，2 0 0 5 ) ：制备羟基磷灰石( 杜海燕等，2 0 0 1 ；原续波等，2 0 0 4 ) 等。 1 3 鱼类胶原蛋白特性 1 3 1 胶原蛋白概述 胶原蛋白( c o l l a g e n ) 主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血 管中，是结缔组织中极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能，是一 种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质( 蒋挺大和张春萍，2 0 0 1 ) 。胶原蛋白是哺乳 动物体内含量最高的蛋白质，占体内蛋白质总量的2 5 3 0 ，相当于体重的6 。 经过数十年的研究和发展，已发现并确认了2 5 种类型的胶原蛋白( 周倩等，2 0 0 8 ) 。 胶原蛋白一级结构均为“g l y x y 重复序列，其中x 大都为脯氨酸，而y 为 其他氨基酸，羟脯氨酸也常出现( 李彦春等，2 0 0 2 ) 。因此，胶原蛋白中含有大量的 甘氨酸，约占氨基酸总量的2 7 左右，因提取原料的不同而存在差异，最高可达到 3 3 以上。脯氨酸和羟脯氨酸的含量也比较高，这两种氨基酸是胶原蛋白的特有氨 基酸，而色氨酸、酪氨酸以及蛋氨酸等必需氨基酸含量低，因此，胶原蛋白属不完 全蛋白质。胶原蛋白呈白色，是一种糖蛋白，具有很强的延伸力，不溶于水，在酸 中可溶解( 李小勇，2 0 0 6 ) 。胶原蛋白具有独特的生化性质，如细胞适应性和细胞增 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 殖作用、止血功能和低抗原性，使其在化妆品、护肤护发用品、整容整形产品、止 血棉材料和医药材料方面得到广泛应用( 韩风杰，2 0 0 6 ) 。 1 3 2 鱼类胶原蛋白的特性 胶原蛋白广泛存在于鱼头、鱼骨、鱼皮、鱼鳞中，一些软体动物如海蜇、海参 等海产品中胶原蛋白的含量也非常丰富。近几十年来，世界有关胶原的研究主要针 对哺乳动物如牛、猪等的胶原蛋白，从鱼类资源提取胶原蛋白的研究还不普遍。进 行过鱼类胶原研究的国家主要是日本和欧洲国家，并集中于海产鱼类胶原的研究。 鱼类属于变温动物，与哺乳动物来源的胶原蛋白相比，鱼类胶原蛋白在i 型胶原性 质上具有若干特异性： ( 1 ) 鱼类组织中的胶原纤维即使在低温下也易溶于中性盐溶液或稀酸，比较容 易调制成可溶性胶原溶液( 林琳，2 0 0 6 ) 。 ( 2 ) 对酶、热的反应更容易，即鱼类胶原蛋白的热稳定性比较低，这和鱼类胶 原蛋白中亚氨基酸( 脯氨酸和羟脯氨酸) 含量低有关，因为胶原蛋白的热稳定性与 亚氨基酸( 脯氨酸和羟脯氨酸) 的含量呈正相关性( l e u e n b e r g e r , 1 9 9 1 ) 。 ( 3 ) 鱼类胶原蛋白热稳定呈现鱼种特异性，即暖水鱼类的胶原蛋白比冷水性鱼 类胶原蛋白的热稳定性高，这与亚氨基酸含量因鱼种不同有关( b a d i ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 ( 4 ) 绝大多数的真骨鱼类的胶原含有其它脊椎动物所没有的第三条口链，即 由三条异种口所形成的单一性杂分子a , ( i ) a 2 ( i ) a 3 ( i ) 组成，而不是【口, ( i ) 1 2 a2 ( i ) ( 傅燕风等，2 0 0 4 ) 。 1 4 鱼类胶原肽 胶原肽是由动物结缔组织中的胶原蛋白经过适度水解得到的多肽，因其具有良 好的乳化性、胶凝性、成膜性和增稠性等功能特性，已广泛应用于食品、化妆品和 医药等工业中。2 0 0 6 年全世界胶原肽的年产量已超过2 0 万吨( b a d i ie ta 1 ，2 0 0 6 ) ， 其原料主要是牛、猪等哺乳动物的皮和骨，但随着疯牛病、口蹄疫等疾病的流行， 世界各国都将目光转向从水产品中提取胶原肽( c h oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 4 1 胶原肽的制备方法 胶原肽的制备方法主要包括化学方法和酶法等。化学方法是利用酸或碱水解胶 原蛋白，虽然方法简单、成本低廉，可是水解过程中能破坏l 型氨基酸，形成d 型氨基酸，产物复杂，蛋白质的营养损失大，并且生产过程产生的废水多，生产周 期长( s i r i p o me ta 1 ，2 0 0 8 ) 。与酸法和碱法相比，酶法具有水解效率高、条件温和、 易于控制水解进程等优点( ne ta 1 2 0 0 8 ) 。酶法被广泛用来改善蛋白质的功能性质， 如溶解性、乳化性、胶凝性能、起泡性、持水性和包油性等( k i me ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 草鱼鱼鳞胶原肽的制各及其特性研究 衡量蛋白水解物的效率可采用氮回收率、水解度等指标，以此来确定最佳的水 解参数( 何国庆和丁庆孝，2 0 0 6 ) 。水解的底物、蛋白酶的选择和水解度都会影响所 得水解产物的理化性质( w 如$ w ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 。良好的水解条件是确保蛋白质水解液 品质的关键。水解通过水解参数如温度、水解时间、p h 和底物浓度等来控制。水解 时蛋白质回收率、氨基酸组成和分子量分布范围是水解产品较重要的指标。在一定 温度和p h 的条件下，酶的浓度越高，水解速度越快：水解时间越长，水解度越高， 但应综合考虑水解效率与增加的成本。 蛋白酶的选择是胶原肽生产的关键，因为蛋白酶具有特异性，水解产物的理化 和功能性质与蛋白酶的选择密切相关。按照水解蛋白质的方式不同，蛋白酶可分为 以下几种。 ( 1 ) 内切酶：切开蛋白质分子内部肽键，将蛋白质水解成分子量较小的多肽类。 包括动物蛋白酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等；植物蛋白酶，如木瓜 蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如碱性蛋白酶 a l c a l a s e 、复合蛋白酶p r o t a r n e x 等。 ( 2 ) 外切酶：切开蛋白质氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸。其中又把 作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。风味蛋白酶属于外 切酶( 雷鸣，2 0 0 7 ) 。 ( 3 ) 此外还有一些蛋白酶能够水解蛋白质或多肽的酯键和酰胺键。 常用于水解鱼类蛋白的蛋白酶主要有植物来源的木瓜蛋白酶( h o y l ea n dm e r r i t t ， 1 9 9 4 ；s h a h i d ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 和动物来源的胃蛋白酶( v i e r ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 、胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶等，还有一些微生物来源的蛋白酶也用于鱼类蛋白质的水解，如碱性蛋 白酶( g u e r a r de ta 1 ，2 0 0 1 ) 等。常用蛋白酶的特性及适宜反应条件如表1 2 所示。 表l - 2 常用蛋白酶特性及适宜反应条件 t a b l e1 - 2t h ec h a r a c t e r i z a t i o n sa n d o p t i m u m c o n d i t i o n so fs o m ep r o t e a s e s 注：【l 】雷鸣，2 0 0 7 ：【2 】张宇昊，2 0 0 7 ；【3 】瞿应良，2 0 0 7 ；【4 s t e i ne ta 1 ，2 0 0 4 9 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 目前，从鱼类下脚料中提取胶原肽的研究主要集中在对海鱼的研究。已研究过 的鱼种包括黄鳍金枪鱼( g u e r a r de ta 1 ，2 0 0 1 ) 、鳕鱼( r a s ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 、罗非鱼 ( j a m i l a ha n dh a r v i n d e r , 2 0 0 2 ) 、尼罗河鲈鱼( m u y o n g ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 等。国内研究了 从斑点叉尾蛔的鱼皮( 刘海英，2 0 0 7 ) 、斑点叉尾蛔鱼头( 韩军，2 0 0 8 ) 、罗非鱼皮 ( 郭瑶，2 0 0 6 ) 等提取胶原肽，但从草鱼鱼鳞提取胶原肽的研究还很少见报道。 1 4 2 鱼类胶原肽的性质 一般来说，构成胶原肽的蛋白质主要由以下的氨基酸所组成：甘氨酸、脯氨酸、 羟脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸等。甘 氨酸是胶原肽中含量最高的氨基酸，最高可达到氨基酸总量的1 3 ，胶原肽中含有很 少或不含色氨酸和半胱氨酸。 胶原肽的品质主要取决于其热特性和流变学性质，而胶原肽的凝胶强度、粘度、 胶凝性能和熔点与其分子量分布、氨基酸组成密切相关( b i n s ie ta 1 ，2 0 0 9 ) 。影响胶原 肽品质的因素主要有原料的品种、年龄、饲养习惯和贮存条件，而对鱼类胶原来讲， 鱼类的生长环境是影响其品质的一个非常重要的因素。首先，一般从在较高温度水 域中生长的鱼类材料中提取的胶原蛋白或胶原肽中亚氨基酸含量较高，具有较多的 氢键作用，因而热稳定性也较好( b a d i ie ta 1 ，2 0 0 6 ) ；第二，分子量较大的胶原肽具 有较大的凝胶强度；另外，胶原肽的制备方法和p h 都会显著影响其品质。凝胶强 度是胶原肽的重要性质，其品质通过凝胶强度或冻力表征，一般包括低( 0 0 5 判定为变化不显著，刚0 5 判定为变化显著。 试验数据取3 次平行测量的平均值。 1 9 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 3 结果与分析 3 1 蛋白酶种类对草鱼鱼鳞水解效果的影响 3 1 1 蛋白酶种类对草鱼鱼鳞水解效率的影响 在预备试验基础上，选用胃蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶等 四种蛋白酶在其各自适宜反应条件下对草鱼鱼鳞进行水解，并考察了水解产物的水 解度、氮收率、凝胶形成能力以及水解液的澄清情况等，结果如表3 1 所示。 表3 - 1 四种蛋白酶水解草鱼鱼鳞效果的比较 t a b l e3 - 1c o m p a r i s o no ft h eh y d r o l y s i se f f e c to fg r a s sc a r ps c a l e sb yf o u rp r o t e a s e s 注：1 ) 底物浓度5 ，胃蛋白酶添加量3 0 0 u gp i o ，其余蛋白酶添加量3 0 0 0u gp r o ，水解时间 1 2 0 m i n ；2 ) “+ ”表示在4 下可以形成凝胶，“一”表示在4 下不能形成凝胶；3 ) 表中数 据为三次试验的平均值标准差，同列中不同字母的水平间存在显著性差异( p 复合蛋白酶水解产物曲术瓜蛋白酶永解产物删性蛋白醇水解产物 圈3 1 四种草鱼鱼鳞蛋白酶水解产物的感官比较 f i g 3 - is e n s o r ye v a l u a t i o no f f 0 盯h y d r o l y s a t e so f g r a s s r ps c a l e s 由表3 - 3 和图3 1 可知，胃蛋白酶水解水解产物呈乳白色，经冷冻干燥易成块 状；复合蛋白酶水解产物呈黄色，粉末状；术瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解产物呈淡 黄色，粉末较均匀。胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解产物口味平淡，碱性蛋白酶水解产 物有弱苦味，而复合蛋白酶水解产物苦味较强。 3 1 3 蛋白酶种类对草鱼鱼鳞水解产物分子量分布的影响 试验中用蓝色葡聚糖2 0 0 0 测定， 水体积，细胞色素c 、v b l 2 和氧化型谷胱甘 肽作为标准物质其洗脱体积分别为1 0 0 m l 1 2 5 m l 和1 4 0 m l ( 如图3 2 ) ，得到凝 胶过滤色谱( s e p h a d