（食品科学专业论文）拟南芥不同U6核小分子RNA基因转录活性的分析比较.pdf

拟南芥不同u 6 核小分子 r n a 基因转录活性的分析比较 摘要 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n al ) u 6 核小分子r n a ( s n r n a ) 基因的转录虽然是 由r n a 聚合酶i i i 驱动的，但转录起始的核心顺式元件是位于基因5 启动子区 域中。u 6s n r n a 基因在拟南芥中有多个拷贝，目前在拟南芥已克隆到三个u 6 基因( 1 3 6 1 ，u 6 2 6 ，u 6 - 2 9 ) ，我们从拟南芥又分离了3 个新的u 6 基因( u 6 - 4 ，u 6 - 5 ， u 6 6 ) 。序列比较分析表明这6 个u 6 基因均包含上游启动子序列及保守的t a t a 元件，在应用生物信息学方法将拟南芥u 6 启动子基因与水稻及人的u 6 基因进 行序列比对时，我们发现在上游启动子区域，存在一段高度保守序列g c c c a t t t ，我们把它命名为c a t 框，这段高度保守序列只存在于拟南芥中。c a t 框可能是另一个潜在的启动元件。为了解这6 个基因的表达模式，我们将它们的 启动子区域与报道基因b 葡糖苷酸酶d n a 片段融合后分别转化到拟南芥植株 中。利用实时定量p c r 技术对转化植株中b 葡糖苷酸酶d n a 片段的转录水平 进行分析，结果表明这些基因的启动子在拟南芥中都具有转录活性，其中u 6 - 2 6 启动子的转录活性高于其它几个基因。这些结果对于研究拟南芥u 6 核小分子 r n a 功能具有一定意义。 关键词：拟南芥，启动子，r n a 聚合酶i i i ，转录活性，u 6s n r n a i v v a r i e dt r a n s c r i p t i o n a le f f i c i e n c i e so f m u l t i p l ea r a b i d o p s i su 6 s m a l l n u c l e a rr n a g e n e s a b s t r a c t a r a b i d o p s i su 6s m a l ln u c l e a rr n a ( s n r n a ) p r o m o t e r sa r et h em e m b e r so ft h o s e t r a n s c r i b e db yr n ap o l y m e r a s ei l lb u ta l lt h e i rc o r ee l e m e n t sf o rt r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o na l el o c a t e di nt h e5 p r o m o t e rr e g i o n p r e v i o u s l y ，t h r e ea r a b i d o p s i su 6 s n r n ag e n e s ( u t j ，u 6 - 2 6a n du 6 - 2 9 ) h a v eb e e ni d e n t i f i e d h e r e ，w ea d d i t i o n a l l y i d e n t i f i e dt h r e en e wu 6l o c i ( u 6 - 4 ，哳巧a n du 6 一回i na r a b i d o p s i sg e n o m e s e q u e n c e a l i g n m e n tr e v e a l e dt h a tt h eu p s t r e a ms e q u e n c ee l e m e n t ( u s e ) a n dt a t ae l e m e n t s w e r ec o n t a i n e di na l ls i xu 6p r o m o t e r s ，a n da l s oau n i q u eh i g h l yc o n s e r v e de l e m e n t n a m e d c a t e l e m e n tw a so b s e r v e di nt h ep r o m o t e rr e g i o n t oe x p l o r et h ee x p r e s s i o n p a t t e r n so ft h e s eu 6g e n e si na r a b i d o p s i s ，w ef u s e dt h e s ep r o m o t e r st ot h ed n a s e g m e n to f b e t a - g t u c u r o n i d a s er e s p e c t i v e l y ，a n dt h e nt r a n s f e r r e dt h e s es i xc o l l s l f f u c t s i n t oa r a b i d o p s i s r e a l t i m er t - p c ra n a l y s i so ft h e s ef u s e dt r a n s c r i p t si n d i c a t e dt h a t t h en e w l yi d e n t i f i e du 6g e n e sa c t i v a t ei na r a b i d o p s i s , a n du 6 - 2 6 p r o m o t e rs e e n 2 st o h a v eh i g h e rt r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yi nl e a f , s t e m , f l o w e ra n ds i l i q u et h a ni no t h e r t i s s u e s t h e s er e s u l t sa l eh e l p f u lt ou n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no ft h e s eu 6s n r n a si n a r a b i d o p s i s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ，p r o m o t e r , r n ap o l y m e r a s ei i i ，t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y ， u 6s n r n a v 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表 或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：查整e t 期：2 塑z 生筌 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可 以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 导师签名；袤举 日期：上皿2 y 第一章综述 1 1r n a 的生物合成与功能研究进展 d n a ，r n a 和蛋白质是生物体中3 种最为重要的生物高分子化合物除某些病 毒基因组r n a 外，绝大多数r n a 分子都是d n a 转录的产物。转录( t r a n s c r i p t i o n ) 即以一段d n a 为模板，在r n a 聚合酶作用下，合成出对应的r n a 的过程。生物体中 含有丰富的r n a ，目前在生物体内已发现十多种r n a ，它们具有重要的生物学功能。 r n a 种类较多，分子量相对较小，各类r n a 分别在遗传信息表达和调控过程中 发挥作用。随着研究的深人，人们发现生物体内r n a 的种类和功能已远远超出从 前对它的认识，r n a 并非只是简单的传递遗传信息从d n a 到蛋白质，除了在基因表 达时作为中间信使，它在生命活动的其他各方面和生物进化过程中也起着非常重 要的作用，例如通过p r e m r n as p l i c i n g 、编辑或再编码的方式来调控基因的表 达方向，调制遗传信息。r n a 还是某些病毒的基因组，直接携带遗传信息。r n a 可以作为酶，起催化作用。可以说，在每个重要的生命活动中，r n a 均扮演了重 要角色。 1 9 5 3 年w a t s o n ，c r i c k 提出d n a 双螺旋结构假说。此后，为了解决遗传信息是 如何从d n a 传递到蛋白质的问题，形成了r n a 研究的热潮( 金由辛，2 0 0 0 ) 。1 9 5 8 年c r i c k 提出了“中心法则”。1 9 5 7 年、1 9 5 9 年和1 9 6 1 年分别发现了t 烈a ，r r n a 和m r n a ，1 9 6 6 年破译了遗传密码。但是这个时期的局限在于，没有充分认识n r n a 生物功能的多样性。 1 9 8 1 年c e c h 发现了r i b o z y m e ( 核酶) ，证明r na 也可作为生物催化剂。核酶的 发现使人们认识到r n a 的生物功能的多样性。r n a 还可以作为功能分子。真核生物 中，转录后的加工同样需要r n a 的参与，大多数m r n a 的剪接需要核小分子r n a ( s n r n a ) 的参与。核酶的发现首先打破了“酶即是蛋白质”这一信条。 1 9 9 8 年，r n a i 的发现使r n a 的研究又掀起了一个新高潮。r n a i 是一种由双链 r n a ( d s r n a ) 介导的同源m r n a 降解现象。刚a i 研究的突破性进展是生物学领域近 年可与人类基因组计划相提并论的重大成果之一，也是当前分子生物学和细胞生 物学最热门的研究领域之一。r n a i 技术能够迅速特异地抑制某个基因的表达，作 为一种简单有效地代替基因敲除的遗传工具而被广泛应用。同时，一类特殊的启 动子，r n a 聚合酶i i i 启动子，也因为能够高效，准确的引导s i r n a 的表达而引起 了人们的关注。r n a 聚合酶i l i 启动子之所以能够可以准确高效的产生s i r n a ，原 因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成r n a ，遇到 4 - 5 个连续的u 即终止，非常精确。当这种带有启动子和s h r n a 模板序列的质粒转 染哺乳动物细胞时，这种能表达s i e n a 的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑 制外源基因和内源基因人u 6 启动子是r n a 聚合酶i i i 启动子，当遇到4 5 个t 时， 转录中止。因此由u 6 启动子表达的s i r n a 能够精确得到合适大d 、s i r n a 目前由u 6 启动子表达s i r n a 弓i 发的转录后基因沉默已经在多种生物中被报道。 近年来国外r n a 研究正在迅速发展，r n a 研究的重要性正不断为人们所重视 r n a 领域的新发现层出不穷，r n a 在生命活动中的重要性不断显现出来。 这一时期要解决的主要问题是：重新认识r n a 在遗传信息传递过程中的作用，探索 r n a 生物功能的多样性和重要性。 2 0 0 6 年诺贝尔科学家已经颁布，其中本年度的化学奖颁给了第一次将基因的 转录过程细致的描述下来的科学家r o g e rd k o r n b e r g ，而本届生理医学奖则颁 给了r n a 干扰的发现者a n d r e wz f i r e 和c r a i gc m e l l o 。这两项大奖都与r n a 有关，可见r n a 研究的重要性和对它的关注度。表i y , j 出了2 0 世纪以来与r n a 研究 有关的诺贝尔奖项的获得。 2 表1 与r n a 有关的诺贝尔奖项 1 2r n a 聚合酶i i i 启动子的研究进展 1 9 5 9 年，w e i s s 和g l a d s t o n e 首次在小鼠肝细胞核中发现了r n a 聚合酶 随后，其他科学家的实验显示，在真核细胞中主要存在3 种不同的r n a 聚合酶， 它们可以催化不同种类r n a 的合成。 通过对q 一鹅膏碱敏感性可以将这3 类r n a 聚合酶区别开：r n a 聚合酶i 对 q 一鹅膏碱不敏感，而较低浓度( 1 0 1 1 0 咭m o l l ) 的q 一鹅膏碱可抑制r n a 聚合酶 i i ，而r n a 聚合酶1 1 1 只能被高浓度( 1 0 6 1 0 “m o l l ) a 一鹅膏碱抑制。其中 r n a 聚合酶i 转录4 5 sr r n a 前体的合成，r n a 聚合酶i i 转录几乎所有前体m r n a 和大多数核内小r n a ( s n r n a ) ，r n a 聚合酶i i i 负责转录u 6s n r n a 、t r n a 、5 sr r n a 3 等小分子转录物。 对应于3 种p a p a 酶，真核生物的启动子也被分成3 类( c l a s s l ，i i ，1 1 1 ) ：类 别i 启动子只负责r r n a 前体基因的转录；类另l j l i 启动子控制大多数蛋白质基因的 表达调控；类别i i i 启动子控制一些小分子r n a 的转录。 其中，类别i i 启动子含有4 类控制元件：t a t a 框( t a t ab o x ) 、起始子 ( i n i t i a t o r ) 、上游元件( u p s t r e a me l e m e n t ) 、和应答元件( r e s p o n s ee l e m e n t ) 。 如以转录起始点为0 ，t a t a 框为中心在一3 0 左右的7 b p 保守区，序列中富含a t ，又 被称为g l o d b e r g h o g n e s s 顺序。研究证明，t a t ab o x 是r n a 聚合酶i i 的接触点。 r n a 聚合酶i 启动子分为两种类型，一型属于结构基因内启动子，二型属于 结构基因外启动予。一型包括t r n a 基因启动子和5 sr r n a 基因启动子，在基因内 部含有启动子控制元件，a 框和b 框( s a k o n j ue ta 1 1 9 8 0 ；g a l l ie ta 1 1 9 8 1 ： g e i d u s c h e ka n dt o c c h i n i v a l e n t i n i1 9 8 8 ) 。二型启动子如哺乳动物u 6 s n r n a 基因启动子( d a se ta 1 1 9 8 8 ：k u n k e la n dp e d e r s o n1 9 8 9 ：e g e l a n de ta 1 1 9 8 9 ) 、人7 s k 基因启动子和h ir n a 基因启动子等。其核心启动子存在于基因外部， 位于基因的5 上游非编码区，由近段序列元件( p r o x i m a ls e q u e n c ee l e m e n t ，p s e ) 和其下游的t a t a 盒构成，其中p s e 和t a t a 盒的间距相对恒定( m a t a ji w 1 9 8 8 ： k u n k e l gr 1 9 8 9 ) 。在p s e 上游有远端序列元件( d i s t a ls e q u e n c ee l e m e n t ，d s e ) ， 包含与转录因子s t a f 结合的s p h 元件和与转录因子o c t - 1 结合的a t g c a a a t 高保守 序列( o c t a m e rs e q u e n c e ) ，具有激活和增强核心启动子转录的能力( s c h a u b ，m e t a l1 9 9 7 ；k u n k e l ，g r e ta i ，1 9 9 6 ) 。 植物u 6 启动子也属于二型r n a 聚合酶i i i 启动子，其上游核心启动序列包 括一6 0 b p 的u s e ( u p s t r e a ms e q u e n c ee l e m e n t ) 框和一3 0 b p 的t a t a 框( w a i b e la n d f i l i p o w i c z1 9 9 0 ：w i i i i s1 9 9 3 ；s c h r a m ma n dh e r n a n d e z2 0 0 2 ) 。目前在植 物u 6 启动子中尚未发现有远端序列元件。目前，这类r n a 聚合酶i i i 启动子因能 方便高效的在体外转录s i r n a 被人们广泛地应用于r n a 干扰技术中，在众多的 r n a 聚合酶启动子中独树一帜。而对于这类r n a 聚合酶启动子本身的研究也引 起了人们极大的兴趣。在人中，除u 6 1 启动子外，更多具有转录活性的u 6 基因 启动子已经被报道。目前已被证明具有活性的u 6 基因有u 6 1 ，u 6 2 ，u 6 - 7 ，u 6 8 和u 6 9 ，这些启动子虽然转录产物相同，但却具有不同的转录特性( d o m i 4 t r o v i c ha n dk u n k e l2 0 0 3 ) 。然而在植物中，关于u 6 基因启动子的报道仍然很 少。1 9 9 0 年，w a i b e l 等人报道了拟南芥中有三个u 6 基因具有转录活性，分别为 u 6 一l ，u 6 2 6 和u 6 2 9 。这三个u 6 基因的编码区序列完全一致，都转录1 0 2 个碱 基的成熟s n r n a 。这三个基因的上游启动子序列存在很大差异，但都含有一3 0 区 的t a t 矗框和一6 0 区的u s e 框。2 0 0 0 年拟南芥基因组全序列的测序成功为越来越 多的功能基因的发现提供了可能。拟南芥中是否还存在其他具有活性的u 6 基 因? 这些基因在植物体中的转录特点是怎样的? 1 3u 6s n r n a 的作用 u 6 基因启动子是植物中启动活性较强的启动子，主要负责引导u 6s n d n a 的 表达，即在u 6 启动子引导下，s n d n a 被转录为s n r n a 。u 6s n r n a 的作用主要是参 与组成剪接复合体。r n a 加工成熟是真核基因表达调控中的重要一环。其中包括 p r e - m r n h 剪接、5 端加帽、3 端加尾等细胞核内m r n a 成熟过程中m r n a 成熟加工 反应直接影响m r n a 最终能否正确表达为蛋白质。 p r e - m r n h 剪接是去除内含子，并将外显子序列连接成为成熟的有功能的m r n a 分子的过程。真核生物的大多数编码蛋白质的基因会含有内含子，即断裂基因 在转录时外显子和内含子均转录到前体m r n a 。内含子由被称为r n a 剪接体的核糖 核蛋白复合物经过两步的催化反应去除，前体n f i i n a 与四种s n r n p ( u 1 ，u 2 ，u 5 。 u 4 u 6s n r n p ) 、小核r n a ( s n r n h ) ，以及许多t s n r n p 的剪接因子相互作用形成剪 接体( g r a b o w s k ie ta t1 9 8 5 ；b l a c ka n ds t e i t z ，1 9 8 6 ；k i s se ta 1 1 9 8 7 ；k o n a r s k aa n d s h a w ，1 9 8 8 ；t a z ie t a l 1 9 9 3 ；k a t l l e r ，1 9 9 6 ) 。其中，us n r n a 是一类进化保守、 修饰程度比较高而且富含尿嘧啶的核内小分子r n a 。它的分子比较小，仅含有 5 0 2 0 0 个核苷酸。作为剪接体的重要功能组分。大多数us n r n a 都是由r n a 聚合 酶i i 转录的，只有0 6s n r n a 是由r n a 聚合酶i i i 负责转录( k u n k e le ta 1 1 9 8 6 ；r e d d y e t a l 1 9 8 7 ；c a r b o n e t a l ，1 9 8 7 ) 。 细胞核前体m r n a 剪接是动态的加工过程( n a g a ike ta l ，2 0 0 1 ) ，首先，u 1 s n r n p 和u 2s n r n p 分别与前体m r n a 的5 剪接位点和分支部位结合，形成复合物 h ( l i ms r ，2 0 0 4 ) 。同时，u 4 u 6s n r n p 复合物与u 5s n r n p 构成三聚体s n r n p ，其中 u 4 和u 6 通过碱基配对相连，非s n r n p 剪接因子与之结合使剪接体成熟，形成复合 物b ( b o e h r i n g e rde ta l ，2 0 0 4 ) 。随后，两步酯基转移反应启动。u lsn r n p 和u 4 s n r n p 从复合物分离，剪接体被激活，催化剪接的第一步酯基转移形成复合 物c 。在反应中分支部位核苷酸的核糖环中的2 羟基亲核攻击5 剪接位点的磷酸二酯键，由此就 形成了“套索”中的2 一5 磷酸二酯键。在第二 步酯基转移反应中，两个外显子被连接，于是成 熟的m r n a 被释放，s n r n p 则进入新的剪接过程( 图 1 ) 。 u 6s n r n a 有1 0 2 个核苷酸，作为剪接体的重要 功能组分，u 6 s n r n a s 必须通过结合各种蛋白形成 u 6 s n r n p ( s n r n p 蛋白) ，才能实现其相应的生物功 能u 6s n r n p 是p r e m m a 剪接催化反应的中心分 子u 6s n r n a 与5 一剪接位点附近内含子序列间 的碱基配对，确保了r n a5 剪接位点识别的忠实 性；u 6 与u 2 分子间的相互作用构成了r n a 剪接体中 的催化中心。 1 4 实时荧光定量p c r 技术 图1 us n r n a 参与r n a 剪接过程 r e a l t i m ep c r ( 实时荧光定量p c r ) 技术是近年发展较快的一项检测技术。 于1 9 9 6 年由美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司推出，它是一种在反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实时监测整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法( m a n n e l l ii ，2 0 0 3 ；m a r i o t t ie ，2 0 0 2 ) 。该技术成功实现了 p c r 从定性到定量的飞跃，是在p c r 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。 用r e a l t i m ep c r 技术比较启动子的表达活性具有灵敏度高、特异性和可 靠性更强、具实时性和准确性等特点。 在荧光定量p c r 技术中，c t 值非常重要。c 是指c y c l e ，t 代表t h r e s h o l d ， c t 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到所设定的域值时所经历的循环数 6 ( 图2 ) 。 值 一 q c t 一 一 - -一 翻2 c t 值的确定 r n ：一个反应管经n 次热循环后，测得的荧光强度( n o r m a l i z e dw i t hr o x 一参比染料) l h + ：反应管含有模板d n a r n 一：反应管不舍有模板d n a 无模板对照：n ot e m p l a t ec o n t r o l ，r n ，在理想状况下，是一条平线，只具有背景荧光数 t h r e s h o l d ：荧光( r n ) 超过本底一达到可检测水平时的临界数值 c t ：t h r e s h o l dc y c l e 临界循环数 基线：b a s e l i n e ，背景益线 实验操作中。c t 值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发 射时所对应的p c r 循环次数( 图2 ) 。每个模板的c t 值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系( m i n u n n im ，2 0 0 1 ) ，c t 值越小，模板d n a 的起始拷贝数越 多；c t 值越大，模板d n a 的起始拷贝数越少。根据c t 值的定量是精确和严格 的，而传统的终点定量则比较粗略。 7 图3 c t 值与d n a 分子初始量的对数之间的线性关系 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代表c t 值( 如图3 所示) 。因此，只要获得未知样品的c t 值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 根据所使用的技术不同，实时荧光定量p c r 又可以分为s y b rg r e e ni 荧光 染料、f r e t 技术、t a q m a n 探针技术等。 f r e t 是指荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) ( h e r t z b e r gm e t a l ，2 0 0 1 ) 。如果某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光 谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长( 高能量) 的荧光基 团传递到长波长( 低能量) 的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移( f r e t ) ( 图5 ) 。 图4 f p , e t 探针的荧光信号产生机制 s y b rg r e e nl 是一种荧光染料，它只能结合d n a 的双链。s y b rg r e e ni 的最大吸收波长约为4 9 7 n m ，发射波长最大约为5 2 0 n r a 。当它与d n a 双链结合 时，发出荧光；从d n a 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。 8 图5 s y b rg r e e ni 与双链d n a 作用示意图 在p c r 反应体系中，加入过量s y b rg r e e ni 荧光染料，s y b rg r e e ni 荧 光染料特异性地掺入d n a 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的s y b rg r e e n i 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与p c r 产物的增 加完全同步( 图5 ) 。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链d n a 分子的数 量。 s y b rg r e e ni 荧光染料法定量p c r 的基本过程是： 1 初始反应s y b rg r e e n 染料与d n a 双链结合时发出荧光； 2 变性当d n a 变性时，s y b rg r e e n 染料便释放出来，荧光急剧减少： 3 聚合在聚合延伸过程中，引物退火并形成p c r 产物； 4 聚合完成当聚合完成时，s y b rg r e e n 染料与双链产物结合，定量p c r 系统检测时，荧光的净增量加大。 在反应中，一个p c r 产物可以与多分子的染料结合，因此s y b rg r e e ni 的 灵敏度很高。在核酸的实时检测方面具有非常多的优点，由于它与所有的双链 d n a 相结合，不必因为模板不同而特别设计，因此设计的程序通用性好，且价 格相对较低。但是，这种方法也可能会存在特异性低的缺陷，因此要做好空白对 照。由于s y b rg r e e ni 能与所有的双链d n a 相结合，对d n a 模板没有选择性， 因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量 的精确性。还可以通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影 响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由s y b rg r e e ni 得到的定量结 果。 总之，各种技术相比较而言，各有自己的优点。这里我们准备采用s y b r g r e e ni 荧光染料法，作为一种最常用的实时荧光定量p c r 技术，具有良好的检 9 测灵敏度。 1 5 论文的主要研究内容 在本论文中，我们首先应用生物信息学的方法找到了拟南芥中的3 个新的u 6 s n r n a 基因，并依次命名为u 6 4 ，u 6 5 和u 6 6 。这三个u 6 基因具有与u 6 1 完 全一致的编码序列，其上游启动子序列中均含有u 6 启动子转录必需的u s e 保守 框和t a t a 框。我们通过实验证明这3 个u 6 基因启动子在植物体内具有转录活性。 为进一步了解拟南芥中存在的6 个u 6 基因( u 6 - 1 ，u 6 2 6 ，u 6 2 9 ，u 6 - 4 ，u 6 5 ， u 6 6 ) 的表达模式，我们将它们的启动子区域与报告基因t 3 葡糖苷酸酶d n a 片 段融合后分别转化到拟南芥植株中，利用实时定量p c r 技术对转化植株中1 3 葡 糖苷酸酶d n a 片段的转录水平进行分析。研究结果显示，这6 个u 6 启动子在 植物体内具有不同的的转录活性，而且同一基因启动子在不同的组织中检测到的 转录活性也存在差异，这一差异在果荚中最为明显。在果荚组织中，6 个u 6 启 动子普遍显示出较低的活性。我们推测，这种现象可能与u 6s n r n a 在生物体内 的功能有关。u 6s n r n a 参与组成剪接体，剪接加工植物蛋白基因的初始转录物， 使其能够成为成熟的mr n a ，从而顺利的翻译成蛋白质。但是在果荚中，很多检 测到的植物蛋白的表达量明显降低。例如，植物组蛋白基因被证明在生长旺盛的 组织中具有持续的高表达量，而在生长代谢不活跃的果荚组织中，表达量较低 ( m a r r y e t a l 。1 9 9 3 ；g a oe ta 1 1 9 9 4 ；m o r a n 2 0 0 0 ) 。a c t i n 基因，通常在表达检测中 被用来作为内标准基因，最近被证明在果荚中表达量明显低于代谢活跃的组织中 ( a ne ta 1 1 9 9 6 ；v o l k o ve ta 1 2 0 0 3 ) 。因此我们推测，正是因为这些植物蛋白基因 在果荚中的表达量降低，转录水平相应也比较低，因此对1 j 6s n p 矾a 的需求量也 降低。我们研究成果对于研究植物体内u 6 s n r n a 功能具有非常重要的意义。 1 0 第二章拟南芥u 6 基因启动子转录活性分析 2 1 材料、试剂与仪器 2 1 1 植物材料和生长环境 野生型拟南芥( 哥伦比亚型) 以及转基因拟南芥均培植于2 2 度培养室中， 在1 6 小时自炽灯光照8 小时暗培养条件下生长。 2 1 2 酶和实验试剂 1 限制性内切酶( e c o r i ，b a m h l ) 及其酶切缓冲液购自t a k a r a 宝生物工 程( 大连) 有限公司； 2 定性p c r 用d n t p s 、t a qd n a 聚合酶及其缓冲液购自t a k a r a 宝生物工 程( 大连) 有限公司； 3 定量p c r 用t a qd n a 聚合酶及其缓冲液，d a t p , d g t p , d c t p , d u t p 购自 上海基因有限公司； 4 ，d l 2 0 0 0m a r k e r 购自华美生物工程公司 5 本实验所用的定性定量p e r 引物由上海博亚生物工程技术服务有限公司 合成。 6 s y b g r e e ni 荧光染料购自上海捷瑞生物有限公司 7 g e le x t r a c t i o nm i i l ik i t 胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司； 8 其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。 2 1 3 溶液、缓冲液、培养基配方 ( 1 ) c t a b 法提取植物基因组d n a 相关试剂 2 c 1 ：a bb u f f e r 2 c 1 ：a b 1 4 mn a c l 1 0 0 r a mt r i s h c lp h 8 0 2 0 m m e d 伪 1 p v p 0 2 2 - m e r e a p t o e t h a n o l t e 缓冲液： i r i s h c l ( p h 8 0 1 e d t a ( p h 8 o 、 1 0 m m lm m r n a s ea ( 2 0 0 0 u m 1 ) ： 用o 1 5m o l ln a c l ，0 0 5m o l l 柠檬酸钠配成1 0m g m l ；使用前1 0 0 c 热处理 1 5r a i n 除去残留的d n a s e 活性 3 mn a a cp r t 5 2 ( 2 ) 植物组织提取r n a 相关试剂 试剂和器皿：所有试剂都用d e p c 水配置，所有器皿都在1 8 0 c 烘8 h r 或者 在双氧水中泡半小时以上，所有的离心管和p i p e t 都用新的，研钵和研棒， 8 0 。c 烘8 h r 。小棒磨双氧水中泡半小时以上。 r n ae x t r a c t i o nb u f f e r o 2 mt r i s - c l ( p h8 ， 0 4 ml i c l 2 5 r a me d t a 1 s d s d e p c 处理的水 2 m l i c l r n a s ef l e e 的水饱和酚 氯仿 无水乙醇 7 0 乙醇 d n a s e ( r n a s ef r e e ) ( 3 ) 小量制备质粒d n a 的碱裂解缓冲液 溶液i ： 葡萄糖 t r i s - c 1 ( p h 8 0 1 e d t a ( p h 8 0 1 溶液i i ： n a o h 5 0 m m o i l 2 5 m m 0 1 l 1 0 m m o l 几 0 2 m o v l s d s 1 临用前用2m o l ln a o h 及1 0 s d s 贮存液稀释配制 溶液i i i ： 乙酸钾 冰乙酸 灭菌水 ( 4 ) 核酸电泳试剂 5 x t b e 缓冲液( 1l ) t r i s 碱 硼酸 e d t a ( p h 8 0 1 5 m o l l 1 1 5 m l 2 8 5 m l 5 4 9 2 7 5 9 2 0 m l0 5 m o l l 母液 6 核酸电泳上样缓冲液 溴酚蓝 蔗糖 ( 5 ) 细菌感受态细胞制备相关试剂 s o b m g 培养基 蛋白胨( p e p t o n e ) 酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) n a c l k c l m g c l 2 d d h 2 0 定容至1l ，p h 7 0 固体加1 5 9 l 琼脂粉 0 2 5 4 0 ( w v ) 2 0 9 5 9 0 5 9 o 1 8 6 9 0 9 5 9 感受态大肠杆菌制备： 从新活化的s o b m g 固体平板上挑取d h 5 。单菌落于5 0m ls o b m g 液体培 养液中，3 7 c ，剧烈振荡培养，至o d 6 呻卸3 时，将细菌转移到一个无菌、 冰预冷的8 0i i l i 离心管中，冰上放置1 0 r n i n ，使培养物冷却到0 c 。5 0 0 0r p m ， 4 c ，离心6r a i n ，尽量倒清培养液；加入3 0m l 预冷的c c m b 8 0 溶液悬浮 菌体；冰上放2 0m i l l ；5 0 0 0r p m ，4 * 0 ，离心6r a i n ，小心倒去上清液，1 1 2 原培养体积的c c m b s 0 重新悬浮菌体。1 0 0 叫管分装后直接用于转化或用 液氮速冻后，7 09 c 储存。在无菌e p p e n d o f 管中分别加d h 5 。感受态细胞悬 液和质粒d n a ( 或连接产物) ，轻轻混匀，冰浴3 0r a i n ，4 2 c 热激4 5s e e ， 立即冰置1 2m i l l ，加入等体积无抗l b 培养基，3 7 c 摇床温育4 5m i n 。如 需通过a 互补筛选，可加4 0 x - g a l 后再涂布于相应的选择性培养基上， 3 7 倒置培养1 2 1 6h 至出现菌落。 c c m b 8 0 溶液 k a e ( 1 m ，p n9 o ) 1 4 无水c a c l 2 重蒸甘油 d d h 2 0 定容至1 l 最后加入 m n c l 2 4 i - 1 2 0 m g c l 2 6 h 2 0 用盐酸调节p h 至6 4 l b 培养基 蛋白胨( p e p t o n e ) 酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) n a c l d d h 2 0 定容至1 l ，p h6 8 7 2 固体加1 5g l 琼脂粉 y e b 培养基 蛋白胨 酵母提取物 牛肉浸膏 m g s 0 4 蔗糖 d d h 2 0 定容至1 l ，p h 7 2 固体加1 5 9 l 琼脂粉 m s 培养基 母液1 ：1 0 x 大量元素( 1 l ) k n 0 3 n h 4 n 0 3 m g s 0 4 7 i - 1 2 0 8 9 1 9 1 0 0 m l 4 9 2 9 1 0 9 5 9 1 0 9 5 9 l g 3 9 0 2 4 9 ，g 1 9 9 1 6 5 9 3 7 9 母液2 - 1 0 x 钙盐( i l ) c a c h 2 h 2 0 4 4 9 母液3 ：1 0 钾盐( 1 l ) k h 2 p 0 4 1 7 9 母液4 ：1 0 0 x 微量元素( 1 l ) m n s 0 4 4 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 h a b o a k i n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 c o c l 2 6 h 2 0 母液5 ：1 0 0 x 维生素( 5 0 0 m 1 ) 甘氨酸 盐酸硫胺素 盐酸吡哆素 烟酸 肌醇 母液6 ：2 0 0 铁盐( 5 0 0 m 1 ) n a 2 一e d t a f e s 0 4 7 h 2 0 2 2 3 0 m g 8 6 0 r a g 6 2 0 r a g 8 3m g 2 5 m g 2 5 m g 2 5 m g 2 0 0 r a g 4 0 m g 5 0 m g 5 0 m g 1 0 0 0 0 m g 3 7 3 0 m g 2 7 8 0 m g 配制1l m s 培养基时分别加入母液1 、2 、3 各1 0 0 m l ，母液4 、5 各l om l 和 5m l 母液6 ，另加入3 蔗糖p h5 8 。( 固体培养基加o 7 的琼脂) 2 1 4 实验仪器 p 1 1 0 0 型扩增仪( m jr e s e a r c h ) d y c z v - 2 8 d 型电泳槽( 北京六一仪器厂) d y y - 6 c 型电泳仪( 北京六一仪器厂) u n u e r s a l1 6 r 型1 8 ，0 0 0 r p m 高速冷冻离心机( 德国h e t f i c h 公司) 移液器( e p p e n d o r f ) 4 c 冰箱( h a l e r ) ，一2 0 c 冰箱( h a i e r ) 7 0 c 冰箱( t h e r m o ) 微波炉( n a i e r ) j y 2 0 0 0 1 基因导入仪( 宁波新芝科器研究所) 洁净工作台( 上海博迅有限公司医疗设备厂) d n p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海精宏实验设备有限公司) d d h z 3 0 0 恒温振荡器( 江苏太仓市试验设备厂) 解剖镜( m o t i c ) s t s 2 型脱色摇床( 上海琪特分析仪器有限公司) 电子天平( s h n 讧a d z u ) d h - $ 2 4 型离心机( e p p e n d o r f ) y x q l s si i 压力蒸汽灭菌锅( 上海博迅有限公司医疗设备厂) f m7 0 a 制冰机( g r a n t ) s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器( 上海亚荣生化仪器厂) 2 2 实验方法 2 2 1 植物基因组d m0 t a l 3 提取方法 拟南芥基因组d n a 采用c t a b 方法提取。 ( 1 ) 取适量样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约 7 0 m g - - 1 0 0m g 磨碎的样品转入1 5 m l 的e p p e n d o r f ：旨 ( 2 ) 视材料量的多少，加入6 0 0 - - 7 0 0 u l 已预热的c t a b ，轻轻混匀后，6 5 c 水浴保温4 5 分钟； 1 7 ( 3 ) 在管中加入等体氯仿异戊醇( v v - 2 4 1 ) ( 6 0 0 - - - 7 0 0 u 1 ) ，上下颠倒充 分混匀，抽提5 分钟； ( 4 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心6 分钟，吸取上清到一新的e p p e n d o r f 管中； ( 5 ) 加入与上清等体积酚氯仿，上下颠倒充分混匀，抽提5 8 分钟； ( 6 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心6 分钟，吸取上清到一新的e p p e n d o r f 管中i ( 7 ) 在沉淀中加入等体积异丙醇，放置8 1 0 分钟后； ( 6 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心8 分钟，倒掉上清，用7 0 乙醇洗两次； ( 7 ) 室温晾干； ( 8 ) 加5 0 m t e r3 7 c 处理1 小时，加4 5 0 1 t l 水； (