（生态学专业论文）拟南芥rcd1和sto基因在uvb信号转导中的功能.pdf

r c d la n ds t oi nu v bs i g n a l i n g l e i - a n g m a j o r ： e c o l o g y c o l l e g e ： s c h o o lo fl i f es c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f s h a o s h a nl i s u b m i t t e dd a t e ：0 5 2 5 2 0l0 摘要 拟南芥r c d l 和s t o 基因在u v b 信号转导中的功能 摘要 u v b 辐射作为一种重要的外界信号调控植物的光形态建成，影响植物的 生长、发育和代谢，然而对于u v b 信号转导途径的了解却非常有限。为了进 一步阐明植物u v b 信号途径，我们研究了r c d l 和s t o 基因在u v b 信号转 导中的功能。拟南芥r c d l j 突变体在u v b 辐射处理后d n a 损伤量比野生型 少，而紫外吸收化合物的积累量比野生型多。此外，r c d l j 叶片中与光修复有 关的基因p h r i 表达量比野生型高。这些结果表明r c d l j 突变体对u v b 辐射 具有一定的耐受性。进一步的研究发现r c d l j 突变体在u v b 辐射环境中下胚 轴比野生型短，表明r c d l j 对u v b 辐射的响应比野生型强。u v 。b 辐射处理 后，c o p l 介导的u v b 响应基因( 如：c h s ，e l i p ，g p x 7 等) 的表达量均比 野生型高，但u v r 8 介导的，h y 5 不依赖的u v b 响应基因( 如：w r k y ) 的 表达量和野生型无显著差别。这一结果表明，r c d l 可能参与c o p i 调控的 u v b 信号转导过程。然而r c d l 基因却不受u v b 辐射调控。 已有研究发现，r c d l 蛋白在体外与s t o 蛋白相互作用。本研究发现， s t o 基因的转录和翻译均受到u v b 辐射调控，s t o 基因的表达受到u v b 辐 射的快速调控，在1h 时就达到最高；其蛋白的表达量则在u v b 处理4h 后显 著增加。为了进一步阐明s t o 基因在u v b 信号中的功能，我们构建了3 5 s s t o 超表达植株。s t o 突变体在u v b 辐射环境中下胚轴比野生型短，花色素苷 积累量比野生型高；而3 5 s s t o 超表达植株下胚轴比野生型长，花色素苷积累 量比野生型低。这表明s t o 基因是u v b 信号转导中的负调控因子。免疫共沉 淀结果发现，s t o 蛋白与c o p i 蛋白在体内的相互作用具有u v b 依赖性。s t o 突变体和3 5 s s t o 超表达植株能抑制c o p l 4 突变体在u v b 辐射下短下胚轴和 低花色素苷积累量的表型，表明s t o 在u v b 信号中处于c o p l 的下游。免疫 共沉淀结果同样表明s t o 可以和h y 5 相互作用。u v b 辐射下，3 5 s s t o 的长 摘要 下胚轴表型不依赖与砂5 2 1 5 ；而b y 5 2 1 5s t o 双突变体的表型与野生型相似， 表明s t o 和日巧在u v b 信号中的功能具有拮抗作用。s t o 抑制u v b 辐射诱 导的h y 5 蛋白的积累，体内转录激活实验也证明s t o 是u v b 诱导h y 5 转录 激活活性的负调控因子。虽然已有的研究表明s t o 是光信号中的负调控因子， 但我们的结果表明s t o 在u v b 信号中的功能不受已知的光受体调控，因为s t o 突变体在u v - b 辐射下短下胚轴的表型不能被光受体突变体p h y a p h y b ， p h o t l p h o t 2 和c r y l c r y 2 抑制。 此外，s t o 突变体还有一些u v b 特异性表型。s t o 在u v b 环境中主根的长 度明显比野生型短，而在其他光下却无明显差异。s t o 根成熟区细胞长度短于野 生型，表明s t o 基因是u v b 抑制根细胞生长的负调控因子。但s t o 基因却是 u v b 诱导叶绿素降解中的正调控因子。s t o 突变体在u v b 辐射下叶绿素含量 比野生型高，3 5 s s t o 超表达植株则比野生型低。在其他光下它们之间的叶绿 素含量无显著差别。 对r c d l j 和s t o 突变体的遗传鉴定发现，u v b 辐射条件下它们的下胚轴长 度相似，而3 5 s s t o 可以抑制r c d l j 突变体的表型，表明s t o 在u v b 信号转 导中位于r c d l 的下游。 关键词：r c d l ，s t o ，u v b 辐射，信号转导，拟南芥，基因表达 a b s t r a c t f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no f a r a b i d o p s i s r c d la n ds t oi nu v bs i g n a l i n g a b s t r a c t u v - br a d i a t i o ni sa l li m p o r t a n te n v i r o n m e n t a ls i g n a lt h a ti n i t i a t e sd i v e r s e r e s p o n s e s s u c ha sm e t a b o l i s ma n d d e v e l o p m e n t i n p l a n t s p h y t o c h r o m e - ， c r y p t o c h r o m e a n dp h o t o t r o p i n s e n s i n gs y s t e m si np l a n t sh a sb e e nw e l ld o c u m e n t e d h o w e v e r ，t h eu v - bs i g n a l i n gi np l a n t si sn o ty e tw e l lk n o w n t h ef u n c t i o no f a r a b i d o p s i sr c d la n ds t oi n u v - bs i g n a l i n gw a si n v e s t i g a t e di nt h ep r e s e n t r e s e a r c h t h er e d l - lm u t a n te x h i b i t sl e s sa c c u m u l a t i o no ft td i m e r sa n dh i g h e r a c c u m u l a t i o no ff l a v o n o i d su n d e rs u p p l e m e n t a r yu v - br a d i a t i o n t h ee x p r e s s i o no f p h r l ，i n v o l v e di nl i g h t - m e d i a t e dd n ad a m a g er e p a i r , i sh i g h e rt h a nw i l d 够p c a n t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h er c d l 1m u t a n ti st o l e r a n tt ou v br a d i a t i o n t h er c d l j m u t a n ts h o w i n gl e s sh y p o c o t y ll e n g t hb yu v - bs u g g e s t e dm o r es e v e r er e s p o n s eo f r e d l 一jt 0u v - br a d i a t i o n t h ee x p r e s s i o no fh y 5i si n c r e a s e di nt h em u t a n ta f t e r u v - br a d i a t i o n e x p r e s s i o no ft h eg e n e sa tt h ed o w n s t r e a mo fu v - bs i g n a l i n g r e v e a l st h a tc o p l 一r e g u l a t e dg e n e sh a v ea ne l e v a t e de x p r e s s i o ni nr e d l 1m u t a n t u n d e ru v - b ，w h i l ee x p r e s s i o no fu v r 8 一r e g u l a t e da n dh y 5 一i n d e p e n d e n tg e n e si sn o t c h a n g e d b a s e do nt h e s er e s u l t s ，i t i sd e d u c e dt h a tr c d li si n v o l v e di nu v - b s i g n a l i n g h o w e v e r , t h em r n a l e v e lo fr c d li sn o ts i g n i f i c a n t l yc h a n g e db yu v b p r e v i o u sr e s e a r c hi n d i c a t e dt h a ts t op r o t e i ni si n t e r a c t i n gw i t hr c d 1i nv i t r o h e r e ，w ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no fs t oi sr e g u l a t e db yu v b ，谢t l lt h ep e a l 【o f m r n al e v e la t1ha f t e ru v - bt r e a t m e n t ；w h i l et h ep r o t e i nl e v e li sa c c u m u l a t e da t4h t of u r t h e re l u c i d a t et h ef u n c t i o no fs t oi nu v bs i g n a l i n g ，w ee s t a b l i s h e dt h es t o o v e r e x p r e s s i o nl i n e s - 3 5 s s t o t h es t om u t a n te x h i b i t si n c r e a s e dh y p o c o t y lg r o w t h i n h i b i t i o na n da n t h o c y a n i na c c u m u l a t i o n ，w h i l e3 5 s s t oe x h i b i t sd e c r e a s e d h y p o c o t y lg r o w t hi n h i b i t i o na n da n t h o c y a n i na c c u m u l a t i o n ，s u g g e s t i n gas i g n i f i c a n t r o l ef o rs t oa sn e g a t i v er e g u l a t o ri nu v bs i g n a l i n g 。c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n r e v e a l st h a ts t op r o t e i ni n t e r a c t sw i t hc o p1i nu v - bd e p e n d e n tm a n n e r t h es t o a n d3 5 s s t oc o u l ds u p p r e s sc o p l 4u n d e ru v bi ne p i s t a t i ca n a l y s i s ，i n d i c a t i n gs t o i sd o w n s t r e a mo fc o p li nu v bs i g n a l i n g o nt h eo t h e rh a n d ，s t oa l s oi n t e r a c t s a b s t r a c t 、撕t hh y 5 nv i v o t h el o n gh y p o c o t y lp h e n o t y p eo f3 5s s t oi si n d e p e n d e n to fh y 5 2 1 5 ，w h i l et h ep h e n o t y p eo fs t oh y 5 - 2 1 5i ss i m i l a rt ow i l dt y p e t h e s er e s u l t si n d i c a t e t h a ts t oa c t sa n t a g o n i s t i c a l l yw i t hh y 5i nu v bs i g n a l i n g t h eh y 5p r o t e i n a c c u m u l a t i o ni ss t r o n g l yi n h i b i t e di n3 5 s s t o ，r e v e a l i n gt h a ts t os u p p r e s s e su v b i n d u c e dh y 5a c c u m u l a t i o n m e a n w h i l e ，nv i v ot r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o na c t i v i t y a s s a ys u g g e s t st h a ts t oa c t sa san e g a t i v er e g u l a t o ri nu v bi n d u c e dh y 5 t r a n s c r i p t i o na c t i v i t y t h o u g ht h ep r e v i o u ss t u d yr e v e a l e ds t oi si n v o l v e di nl i g h t s i g n a l i n g ，w ef o u n dt h a ts t o f u n c t i o ni nu v bs i g n a l i n gi sm e c h a n i c a l l ys e p a r a t e d f r o mi t sf u n c t i o ni nl i g h ts i g n a l i n g t h es h o r th y p o c o t y lp h e n o t y p eo fs t ou n d e ru v b i sn o ts u p p r e s s e db yp h y a p h y b , p h o t l p h o t 2a n dc r y i c r y 2 ，s u g g e s t i n gt h es t o f u n c t i o ni nu v bs i g n a l i n gi sn o tr e g u l a t e db ya n yk n o w n p h o t o r e c e p t o r s w eo b s e r v e ds e v e r a lu v - bs p e c i f i cp h e n o t y p e so fs t om u t a n t t h ep r i m a r yr o o t e l o n g a t i o no fs t oi ss e v e r e l ys u p p r e s s e db yu v - b ，b u ti tw a sn o ts u p p r e s s e db yo t h e r l i g h tc o n d i t i o n s t h el e n g t ho ft h ec e l li ns t or o o tm a t u r a t i o nz o n ei ss i g n i f i c a n t l y s h o r t e rt h a nw i l dt y p e ，i n d i c a t i n gt h a ts t oa c t sn e g a t i v e l yi nu v bi n d u c e dr o o tc e l l e l o n g a t i o ni n h i b i t i o n h o w e v e r ，s t of u n c t i o n sa sap o s i t i v er e g u l a t o r 砸u v b i n d u c e dc h l o r o p h y l lb i o s y n t h e s i si n h i b i t i o n s t oe x h i b i t sl o w e rc h l o r o p h y l lc o n t e n t t h a nw i l dt y p cu n d e ru v - b ，w h i l e3 5 s - s t oh a sah i g h e rc h l o r o p h y l lc o n t e n t h o w e v e r , t h e s ed i f f e r e n c e sa r en o to b s e r v e du n d e ro t h e rl i g h tc o n d i t i o n s i th a sb e e nr e p o r t e dt h a ts t op r o t e i ni s i n t e r a c t i n gw i t hr c d 1 nv i t r o o u r g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tr e d l 一_ a n ds t om u t a n t sh a v es i m i l a rh y p o c o t y ll e n g t h u n d e ru v br a d i a t i o n ，w h i l e3 5 s - s t oc o u l d s u p p r e s sr c d l jp h e n o t y p e t h e s e e v i d e n c e ss u g g e s t e dt h a ts t oi sd o w n s t r e a mo fr c d li nu v - b s i g n a l i n g k e y w o r d ：a r a b i d o p s i s ，g e n ee x p r e s s i o n ，r c d1 ，s t o ，u v - br a d i a t i o n ，s i g n a l i n g i v 目录 摘要 目录 a b s t r a c t 目录 1 前言 v 1 1 植物对u v b 辐射的响应2 1 2u v b 辐射诱导的光形态建成反应及信号通路3 1 2 1u v b 辐射诱导光形态建成信号途径的生物化学研究5 1 2 2u v - b 辐射诱导光形态建成信号途径的遗传学研究5 1 2 3h y 5 和c o p i 是u v b 信号通路中的正调节因子。6 1 2 4u v b 信号特异性调节因子u v r 8 8 2 拟南芥r c d l j 突变体中u v b 响应基因的表达差异 ：1 2 2 1 材料与方法1 2 2 1 1 实验材料1 2 2 1 2 实验方法1 3 2 2 实验结果18 2 2 1 拟南芥r c d l ，突变体对u v b 辐射有耐受性。l8 2 2 2u v b 处理后r c d l j 突变体中光修复能力高于“暗修复”2 2 2 2 3r c d l ，突变体中u v - b 诱导的c o p l 调节的基因表达量增加2 4 2 2 4r c d j 基因的表达不受u v b 辐射影响。2 8 2 3 讨论2 9 3 拟南芥s t o c a 因参与u v b 信号转导的功能研究3 l 3 1 材料与方法3l 3 1 1 实验材料。3l 3 1 2 实验办法3 l 3 2 实验结果4 7 3 2 1p b e g f p s t o 衷达_ 找体的构建及拟肖芥过表达株系的获得4 7 3 2 2 9 m 基因参与u v b 抑制下胚轴伸长和花色素苷积累的响应4 8 3 2 3s t o 转录和翻译均受u v b 辐射调控5 l 3 2 4u v b 诱导的c h s 并d h y 5 基凶表达受s t o 调控。5 3 v 华南师范大学博十学位论文 3 2 5s t o 蛋白在体外与u v r 8 蛋白不发生相互作用5 4 3 2 6s t o 蛋白与c o p i 蛋白在体内相互作用具自u v b 依赖性5 5 3 2 7u v b 辐射下3 5 s s t o 和s t o 抑$ 1 j c o p l 4 的表型5 7 3 2 8s t o 蛋白和h y 5 蛋白在体内相互作用6 0 3 2 9u v - b 辐射下3 5 s s t o 的表型不依赖于h y s - 2 1 s 而h y 5 - 2 1 5 可抑制s f 0 的表型6 l 3 2 10s t o 抑制u v b 辐射诱导h y 5 蛋白积累及其转录活性6 4 3 2 1 lu v b 辐射下s t o 短下胚轴的表型不依赖于已知的光受体。6 6 3 2 1 2s t o 基因影响拟南芥u v b 辐射下主根的伸长6 7 3 2 1 3s t o 基因参与u v b 辐射抑制根和下胚轴细胞伸长过程6 8 3 2 1 4s t o 基因影响u v b 辐射诱导的叶绿素合成7 0 3 2 1 5u v b 辐射下3 5 s s t o 抑f 嗣j r e d l j 的表型7 l 3 3 讨论- 7 2 3 3 1s t o 在u v - b 信号中的功能独立于已知的光受体7 3 3 3 2u v - b 信号中s t o 与c o p l 、h y 5 的功能关系7 3 3 3 3s t o 参- 与t r v b 抑制细胞伸长与h f r l 基因有关7 6 3 3 4s t o 是u v b 抑制叶绿素合成的正调控因子。7 7 3 3 5u v b 信号中s t o 位于r c d l 的下游7 8 4 结论 8 1 参考文献。一。观 缩略词表 9 1 攻读博士学位期间已发表和待发表的论文一。9 2 致谢 9 3 刖舌 1 前言 随着人类工业生产的迅速发展，向大气中排放的污染物也越来越多。其中 氯氟烃类( c h l o r o f l u o r o c a r b o n s ，c f c s ) 、氯碳类( c h l o r o c a r b o n s ，c c s ) 和有机 溴类( o r g a n o b r o m i d e s ，o b s ) 化合物的增多，导致大气平流层中臭氧逐渐耗 损，使得到达地面上的太阳紫外辐射( 主要是2 8 0 3 1 5m n ，u v b ) 增强 ( b l u m t h a l e ra n da m b a c h ，1 9 9 0 ；l u b i na n dj e n s e n , 1 9 9 5 ) 。过去的几十年中，每当 冬末春初之际，南极上空的臭氧层都会减少7 0 。全臭氧绘图仪( t o t a lo z o n e m a p p i n gs p e c t r o m e t e r , t o m s ) 数据表明，南极上空的臭氧空洞面积是美国陆地 面积的三倍，2 0 0 0 年已达2 8 3 万平方公里( n e w si nb r i e f , 2 0 0 0 ) 。2 0 0 6 年1 0 月 2 0 日，有美国宇航局提供的数据显示，南极上空的臭氧空洞已达到创纪录的 1 0 6 0 万平方英里。据预测，由于臭氧层耗损，到达地面上的紫外辐射还会逐渐 增强。 u v b 辐射增强对生物圈造成了广泛的影响。u v b 是太阳光谱中能量最强 的波段，可以引起细胞内的生物大分子如d n a 、r n a 和蛋白质造成潜在的损 伤，并能产生活性氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ，影响各种细胞过 程( a j 6 r n , 1 9 9 6 ；j o r d a n ，1 9 9 6 ；r o z e m ae ta 1 ，1 9 9 7 ；j a n s e ne ta 1 ，1 9 9 8 ；b r o s c h 6a n d s t r i d ，2 0 0 3 ；f r o h n m e y e ra n ds t a i g e r , 2 0 0 3 ) 。生物个体在长期的进化过程中形成各 种机制，保护植物免受u v b 辐射的伤害( r o z e m a e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。其中高等植物中 最重要的一种保护机制是在叶肉组织中积累紫外吸收化合物。这些化合物能够 像防晒剂一样，减少u v - b 辐射进入叶肉细胞内( j o r d a n , 1 9 9 6 ；r o z e m ae ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。缺乏这种保护机制的植物易受到u v b 辐射的伤害( l ie ta 1 ，1 9 9 3 ； s t a p l e t o na n dw a l b o t ，1 9 9 4 ；l a n d r ye ta 1 ，1 9 9 5 ) 。另外一些保护机制也是必不可 少的，如形成角质化的蜡质层和表皮毛( l i a k o p o u l o se ta 1 ，2 0 0 6 ) ，以及提高细胞 内抗氧化系统活性( j a n s e ne ta 1 ，19 9 8 ；b r o s c h 6a n ds t r i d ，2 0 0 3 ) 。植物的d n a 损 伤修复机制和其它物种的比较相似，都包含由d n a 光修复酶介导的光复活作 用( p h o t o r e a c t i v a t i o n ) ( b r i t t , 2 0 0 4 ) 。植物体的紫外防护和修复系统是非常有效 的，因为在自然环境中生长的植物很少能观察到有紫外伤害。除了对生物个体 华南师范大学博士学位论文 的直接影响外，它还给生态系统功能中的各种过程带来显著的伤害( p a u la n d g w y n n j o n e s ，2 0 0 3 ；a n d r a d ye ta 1 ，2 0 0 5 ；c a l d w e l le ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 u v b 辐射不仅仅具有简单的伤害作用，同时它还可以作为一种环境信号 调控多种生物个体发育( b j 6 m ，1 9 9 6 ；r o z e m ae ta 1 ，1 9 9 7 ；j a n s e ne ta 1 ，1 9 9 8 ； b r o s c h 6a n ds t r i d ，2 0 0 3 ；f r o h n m e y e ra n ds t a i g e r , 2 0 0 3 ；p a u la n dg w y n n j o n e s ， 2 0 0 3 ；u l ma n dn a g y ，2 0 0 5 ) 。在植物中，u v b 辐射可诱导与紫外防护和损伤修 复相关基因的表达( b r o s c ma n ds t r i d ，2 0 0 3 ；f r o h n m e y e ra n ds t a i g e r , 2 0 0 3 ；u l m a n dn a g y ，2 0 0 5 ) ，提高了植物在自然环境下的存活率。u v b 辐射改变了植物生 化组成，影响形态结构并可帮助植物抵御害虫和病原的侵害( j a n s e n ，2 0 0 2 ； f r o h n m e y e ra n ds t a i g e r , 2 0 0 3 ；c a l d w e l le ta 1 ，2 0 0 7 ) 。由于植物对u v b 辐射响应 调节的广泛作用，理解和认识u v b 辐射感知和信号转导的机制是十分重要 的。 。 1 1 植物对u v b 辐射的响应 u v b 辐射对植物的影响已有大量的研究。这些包括不同的植物或不同的 发育时期，包括大田、温室或人工气候箱内的各种u v b 处理，也包括不同的 u v b 光源及处理时间。从这些大量的研究中，可以总结出以下4 项规律： 首先，u v b 辐射对植物有广泛的影响。u v b 辐射影响各种发育过程，并 改变植物的形态建成。总体而言，u v b 显著抑制植物生长和叶片的伸长，但 却促进分支( r o z e m ae ta 1 ，19 9 7 ；j a n s e n ，2 0 0 2 ；f r o h n m e y e ra n ds t a i g e r ，2 0 0 3 ； c a l d w e l le ta 1 ，2 0 0 7 ) 。此外，u v b 改变植物的代谢( l o g e m a n ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 并促 进包括紫外吸收化合物在内的各种次生代谢物质的合成( r o z e m ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 尽管某些次生代谢可能帮助植物抵御害虫，但u v b 辐射改变代谢过程的重要 意义还尚未了解。 其次，植物对u v b 辐射响应的特性是依赖于u v b 处理时的辐照度、处 理时间以及光源的波长( f r o h n m e y e ra n ds t a i g e r ，2 0 0 3 ；u l ma n dn a g y ，2 0 0 5 ) 。高 辐照度或短波长的u v b 处理造成植物逆境响应并可能造成细胞坏死。有大量 的文献报道，u v b 辐射能引起d n a ，蛋白和细胞膜质膜的损伤，抑制蛋白的 合成和光合作用( j o r d a n ，1 9 9 6 ；b j 6 me ta 1 ，1 9 9 7 ；c a s a t ia n dw a i b o t ，2 0 0 4 ) 。大部 i i l i 吾 分的损伤性作用都是在人工控制下的高于环境中的u v b 辐射处理后观察到 的，这些u v b 辐射的辐照度以及光质与自然环境中的有很大的区别。与此相 反，低剂量的u v b 辐射足以启动植物的调节响应。低剂量u v b 辐射可抑制 茎的伸长，刺激子叶张开，促进黄酮类物质的积累和一系列基因的表达变化 ( k i me ta 1 ，19 9 8 ；f r o h n m e y e re ta 1 ，19 9 9 ；b o c c a l a n d r oe ta 1 ，2 0 01 ；s u e s s l i na n d f r o h n m e y e r ，2 0 0 3 ；u l me ta 1 ，2 0 0 4 ；b r o w na n dj e n k i n s ，2 0 0 8 ) 。这些调节响应并非 胁迫响应，而可以看作自然界中的光形态建成反应，与光敏色素 ( p h y t o c h r o m e s ) 、隐花色素( c r y p t o c h r o m e s ) 和向光素( p h o t o t r o p i n s ) 调节 的响应非常相似。 再次，适应u v b 辐射能力的不同导致植物对u v b 响应的不同。同一物 种的不同基因型对u v b 辐射响应和耐受性均不相同。而对于同一基因型的植 物而言，处理前的锻炼时间也决定了它们对u v b 辐射的响应能力( c o r r e i ae ta 1 ， 1 9 9 9 ；h i d e m aa n dk u m a g a i ，2 0 0 6 ；k a l b i n aa n ds t r i d ，2 0 0 6 b ) 。生长在无u v b 辐 射环境下的植物在接受第一次u v b 处理后会受到明显的伤害。生长在附加 u v b 辐射环境中的植物，会持续表达一些基因保护它们免受其它胁迫的损伤 ( c a s a t ia n dw a l b o t , 2 0 0 3 ；u l me ta 1 ，2 0 0 4 ；b r o w ne ta 1 ，2 0 0 5 ；k i l i a ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。+ 随着适应时间的增加，植物对u v b 响应的强度会降低甚至消失( k a l b i ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。一旦完全适应，这些保护基因的表达就会处于适应性水平( h e c t o r se ta 1 ， 2 0 0 7 ) 。 最后，其它环境因素的作用会影响植物对u v b 的响应，同样u v b 辐射也 会影响植物对其它环境因素的响应( c a l d w e l le ta 1 ，2 0 0 7 ) 。此外，u v b 响应途 径也与其它光响应途径相互交错，形成一个复杂的信号通路网络( b o c c a l a n d r oc t a 1 ，2 0 0 1 ；w a d ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。然而，u v b 辐射与其它环境因素之间相互作用影 响的分子机理还并未了解清楚。 1 2u v b 辐射诱导的光形态建成反应及信号通路 u v b 辐射能引起多种表型响应，包括抑制下胚轴伸长和诱导积累紫外保护 色素( u l ma n dn a g y ，2 0 0 5 ) 。这些表型响应是由多条信号通路控制的，但这些通 路彳 或低 剂量( o 1w m - s ) 的u v b 辐射( 0 4w r n 2 ) 处理5h 。 2 1 2 2 黄酮类化合物含量检测 经u v b 处理后的拟南芥幼苗称重5 0m g ，迅速放入液氮中研磨，将粉末加 入2 0 0l a l 提取液( 7 9 乙醇和l 乙酸，体积比) 中8 5 。( 2 抽提3 0m i n 。然后用 浸泡1 5 乙酸的层析滤纸分离黄酮类化合物。把在u v a 光源下显示为紫色的 条带切下，用1m l5 0 乙醇洗脱后，用分光光度计检测3 6 0n m 处的吸光值 ( k u c e r ae ta 1 。2 0 0 3 ) 。 2 1 2 3 下胚轴长度检测 取3 0 拟南芥株幼苗放在透明塑料薄膜上，通过扫描仪输入电脑，利用 l m a g e j 软件测量下胚轴的长度。 2 1 2 4 单细胞凝胶电泳检测u v b 诱导的环丁烷嘧啶二聚体 普通玻璃载玻片预处理：垂直浸入溶化的l 正常熔点琼脂糖( n m p a ) 中，取出后水平放置干燥过夜。2 0 “l 细胞核悬液，和2 0 “l1 低熔点琼脂糖 ( l m p a ) ( s i g m a , 美国) 于3 7 。c 混合并充分混匀，滴加到预处理的载玻片 上。于4 0 c 水平静置3 0m i n 后，将载玻片放入裂解液( 2 5mn a c i ，1 0 0m m e d t a ，1 0m m t r i s h c i ，p h1 0 ，1 t r i t o nx 1 0 0 ) 中避光裂解1h ( 4 0 c ) 。 1 4 拟南芥r c d l ，突变体中u v b 响应基w 的差异表达 用蒸馏水冲洗玻片后分别转入含有或不含有t 4e n d o n u c l e a s ev ( e p i c e n t e r ，美 国) 的缓冲液中，并于3 7 0 c 温育3 0m i n 。随后，玻片放入4 0 c 预冷的碱性电 泳缓冲液( 1 0 0m mn a o h ，1m me d t a ，p h 1 3 ) ，浸泡2 0r a i n 使d n a 变性 解旋。d n a 变性解旋后，在4 0 c 下电泳2 0m i n ( 1 9v ，3 0 0m a ) 。电泳完 毕，用0 4m t r i s 缓冲液( p h7 5 ) 中和3 次后放入预冷的无水乙醇中5m i n 。 自然干燥后，加2 0 “l 荧光染料s y b rg o l d ( 1 ：1 0 0 0 0 ，m o l e c u l a rp r o b e ，美 国) 染色5r a i n ，在荧光显微镜( 8 0 i ，n i k o n , 日本) 下观察并拍照。每个处理组 随机选取3 0 个彗星图像，并用c a s p 软件进行定量分析，并以o t m 值( o l i v e t a i lm o m e n t ) 评价细胞内d n a 的损伤程度。 环丁烷嘧啶二聚体积累量= o t m ( + t 4e n d ov ) 一o t m ( - t 4e n d ov ) 其中，o 喇( + t 4e n d ov ) 表示经t 4e n d o n u c l e a s ev 处理的样品的o t m 值，o t m ( - t 4e n d ov ) 表示同一样品没有经i 4e n d o n u c l e a s ev 处理的o t m 值。 2 1 2 5r n a 提取及e d n a 的合成 叶片r n a 提取采用t r i z o l ( i n v i t r o g e n ，美国) 法，并用d n a s ei ( r n a s e f r e e ，p r o m e g a ，美国) 去除基因组d n a 污染。 ( 1 ) 新鲜根尖用d e p c 水清洗后，加入3 5 0p lt r i z o l 中，使用电动研磨器 在冰浴研磨5m i l l ，加入6 0 0l a lt r i z o l 充分混匀； ( 2 ) 加入2 0 0l a l 氯仿，振荡1 5s ，静置2m i n ； ( 3 ) 4 0 c ，1 2 0 0 0 xg 离心1 5m i n ，取上清； ( 4 ) 加入5 0 0m l 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置1 0m i l l ； ( 5 ) 4 。c ，1 2 0 0 0 xg 离心1 0m i n ，弃上清； ( 6 ) 加入lm l7 5 乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 0 c ，7 5 0 0 xg 离心5m i n ，弃上 清； ( 7 ) 沉淀晾干，加入5 0 “1d e p c 水溶解，此即提取的r n a 样品，置于 8 0 0 c 中保存、备用。 ( 8 ) 取上述r n a 溶液8i x l ，加入含有lp lr q ir n a s e f r e ed n a s e1 0 x r e a c t i o nb u f f e r 和ll a lr q lr n a s e - f r e ed n a s e 的反应液中，3 7 0 c