（微生物学专业论文）钝顶螺旋藻表达载体的构建及转化研究.pdf

摘要 本文研究螺旋藻对刀豆氨酸( c s ) 和不同抗生素的耐受性和敏感性；提取螺旋藻抗 c s 突变株a 9 c 的基因组d n a 转化野生藻株a 9 ，获得同源转化螺旋藻的参数组合； 构建含有螺旋藻a 9 启动子的外源质粒载体p 2 1 5 t s p p ，并将其转入螺旋藻a 9 ，实现 绿色荧光蛋白g f p 在螺旋藻细胞内的稳定表达。本研究初步建立了一套螺旋藻遗传 转化操作系统，可为螺旋藻转基因操作提供重要技术参考。 c h l 、s t r 对螺旋藻均有很强的抑制作用，在液体培养条件下，1 0 岭- m l 卅的c h l 、 3 1 x g m l “的s t r 对螺旋藻有完全的致死作用；固体培养条件下，1 2 9 9 m l 。的c h l 、4 9 9 m l q 的s t r 可完全抑制螺旋藻在固体平板上的生长。a m p 对螺旋藻有较强抑制作用，液体 培养时a m p 对螺旋藻的m i c 为1 0 0 t x g m l ；固体培养时a m p 对螺旋藻的m i c 约为 2 0 0 t g m l 。螺旋藻对k m 很不敏感，在6 0 0 9 9 t m l _ k m 的液体培养基中，螺旋藻的生 长完全不受抑制。c h l 、s t r 和a m p 均适合作为螺旋藻的抗性筛选标记，筛选浓度分 别为：1 2 9 9 m l 一、4 t x g m l 、2 0 0 t g m l 。 将螺旋藻抗c s 突变株a 9 c 的基因组d n a 作为材料转化野生藻株a 9 ，以 3 0 t g m l 1 的c s 作为筛选压力，获得了转化藻株，得到了一些同源转化的参数：在低 于最适生长温度的条件下( 2 4 ) 培养螺旋藻；转化前用2 m m o l l 。的e d t a 预处理2 4 h ； 利用超声波对螺旋藻进行处理，功率为3 0 0 w ，处理时间为7 0 s ；采用自然转化方法， 冰浴处理，避光条件下液体培养后涂平板，筛选转化子。 本实验以构建的携带g y p 基因的质粒p 2 1 5 t s p p 和出发质粒p 2 1 5 t 作为载体，分别 采用冰浴法和p e g 融合法转化螺旋藻a 9 藻株，成功实现了g y p 基因在螺旋藻株中的 表达。比较了用不同质粒在相同条件下转化a 9 藻株的转化率，数据显示p 2 1 5 t s p p 可以比p 2 1 5 t 极显著提高转化率( c c = 0 0 1 ) ，初步证明采用螺旋藻的启动子构建质粒 可以提高转化效果；比较了相同质粒用不同方法转化a 9 藻株的转化率，数据显示采 用适当浓度的p e g 可以有效的提高转化率。经过反复实验证明，采用1 的p e g 浓 度作用3 0 m i n 可以获得较高转化率( 1 0 5 ) 。对转化藻株进行荧光检测，藻丝段在 3 9 0 n m 蓝光激发下发出绿色荧光，证实g y p 基因在转化藻株中得到有效表达。连续观 察转化藻株荧光发光情况发现，转化藻株转接3 次后均可观察到绿色荧光，证明了 咖基因成功实现了在螺旋藻细胞内的稳定表达。 关键词： 螺旋藻 载体构建g y p 基因p e g 法转化率绿色荧光 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，t h et o l e r a n c ea n ds e n s i t i v i t i e so fs p i r u l i n at od i f f e r e n ta n t i b i o t i c sa n d l - - c a n a v a n i n es u l p h a t e ( c s ) w a se x p o u n d e d i nt h ee x p e r i m e n t ，w ee x t r a c t e dd n aa n t i - c s m u t a n ta 9 ca n dt r a n s f o r m e di ti n t oa 9s t r a i n ，t h e nw ea c c e p t e ds o m ep a r a m e t e r st o t r a n s f o r ms p i r u l i n a a l s o ，w ec o n s t r u c t e dt h ef o r e i g nv e c t o rp 215 t s p pw h i c hc o n t a i n s s p i r u l i n ap r o m o t e ra 9 ，a n dt r a n s f o r m e di t i n t os p i r u l i n ap r o m o t e ra 9 t h u s ，g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l ya n ds t a b l yi ns p i r u l i n a t h i sr e s e a r c h e s t a b l i s h e das y s t e mf o rg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n o p e r a t i o no fs p i r u l i n a ，a n dp r o v i d e d i m p o r t a n tr e f e r e n c et ot r a n s g e n et e c h n o l o g yo fs p i r u l i n a s p i r u l i n aw a se x t r e m e l ys e n s i t i v et oa n t i b i o t i c ss u c ha sc h la n ds t r t h el e t h a l c o n c e n t r a t i o no fc h la n ds t rw e r e1 o l x g m l a n d3 1 x g 。m l 。1i nl i q u i dc u l t i v a t i n ga n d 1 2 1 x g m l a n d4 p , g m l 。i ns o l i dc u l t i v a t i n gr e s p e c t i v e l y t h es p i r u l i n aw a sr e l a t i v e l y s e n s i t i v et oa m p t h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o fa m pw a slo o p , g m l 。i n l i q u i ds i t u a t i o na n d2 0 0 j x g m l i ns o l i ds i t u a t i o n b u t6 0 0 l r t g m l 1k ms h o w e dn oi n h i b i t i o n o nt h eg r o w t ho fa 9s t r a i n c h l ，s t ra n da m p m i g h tb es u i t a b l es e l e c t i o ng e n e t i cm a r k e r s f o rt h es p i r u l i n a ，a n dt h es e l e c t i o nc o n c e n t r a t i o n sw e r e1 2 i t g 。m l 、4 1 x g m l 。1 、2 0 0 1 x g m l 。1 r e s p e c t i v e l y ， e x t r a c t e dd n ao fa 9 cs t r a i nw h i c hi st h ea n t i c sm u t a n to fa 9s t r a i n ，s c r e e n e db y 3 0 1 x g m l c s ，t h e nt r a n s f o r m e di ti n t oa 9s t r a i n ，w ea c c e p t e dat r a n s f o r m a n ta n ds o m e p a r a m e t e r st ot r a n s f o r ms p i r u l i n a ：c u l t u r e da 9s t r a i na t2 4 。ca n dt r e a t e dw i t h2m m o l l 。1 e d t af o r2 4 hb e f o r et r a n s f o r m a t i o n ；u s e du l t r a s o n i ct r e a t m e n tw i t hp o w e ro f30 0 wf o r7 0 s ， u s e dn a t u r a lm e t h o d st os c r e e nt r a n s f o r m a n t s i nt h i se x p e r i m e n t ，b o t ho fo r i g i n a lp l a s m i dp 2 15 ta n dn e wc o n s t r u c t e dp l a s m i d p 2 15 t - s p pw h i c hc o n t a i n s 舴g e n ew e r eu s e da sv e c t o r s ，u s e dd i f f e r e n tm e t h o do fi c eb a t h a n dp e gf u s i o nm e t h o ds e p a r a t e l yt ot r a n s f o r ms p i r u l i n aa 9s t r a i n s ，t h e 肋g e n ew e r e e x p r e s s e di ns p i r u l i n as u c c e s s f u l l y w ec o m p a r e dt h et r a n s f o r m a t i o nr a t eo fd i f f e r e n t p l a s m i du n d e rt h es a l t l ec o n d i t i o n sa n dm e t h o d s t h ed a t as h o w st h a t ，c o m p a r e dw i t h p 2 15 t ，p 215 t s p pc a l ls i g n i f i c a n t l yi m p r o v et r a n s f o r m a t i o nr a t e ( a = o o1 ) t h i sp r o v e dt h a t u s es p i r u l i n ap r o m o t e rt oc o n s t r u c tv e c t o r sc a ni m p r o v et h et r a n s f o r m a t i o nr a t e w ea l s o c o m p a r e dt h et r a n s f o r m a t i o nr a t eo fd i f f e r e n tm e t h o d s t h ed a t as h o w st h a tu s e1 p e g c o n c e n t r a t i o ni n3 0 m i nc a no b t a i nah i g h e rt r a n s f o r m a t i o nr a t e ( 1 0 5 ) o b s e r v e db y f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ew i t h3 9 0 n ma ss t i m u l a t i o n l i g h t ，p a r t so ft h et r a n s f o r m a n t f i l a m e n t sp r e s e n t e ds t a b l eg r e e nf l u o r e s c e n c e ，a n dt h ef o r e i g n 曲g e n eh a sb e e ne f f e c t i v e l y e x p r e s s e di nsp l a t e n s i s k e yw o r d s ：s p i r u l i n ap l a t e n s i s v e c t o rc o n s t r u c t i o n 加g e n e p e gm e t h o d g r e e nf l u o r e s c e n c e t r a n s f o r m a t i o nr a t i o i i i 缩写词 a m p c a t c h l c s c t a b e b e d t a g f p g u s k b k m m i c o d p c r p e g r n a s e s d s s t r t a e t e 本文常用英文缩写词 英文全称 中文全称 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 c h l o r a m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e 氯霉素乙酰转移酶 c h l o r a m p h e n i c o l 氯霉素 l - c a n a b a n i n es u l p h a t e刀豆氨酸 c e “l t r i m e t h ya m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三甲基溴化铵 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 1 3 - g l u c u r o n i d a s e d 一葡萄糖酸苷酶 k i l ob a s ep a i r s干碱基对 k a n a m y c i n 卡那霉素 m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n最低抑制浓度 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 r i b o n u c l e a s e核糖核酸酶 s o d i u md e d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 s t r e p t o m y c i n 链霉素 t r i s a c e t i ca c i de l e c t r o p h o s i sb u f f e r醋酸电泳缓冲液 r if f s & e d t ab u f f e rt e 缓冲液 v i 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安 徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文作者签名： 士叁 签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文 件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 。 学位论文作者签名：凇 签字日期：年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名：坦 签字e l 期：夕缉歹月，矿日 电话： 邮编： 文献综述 1 螺旋藻简介 螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) ( 科学出版社，1 9 9 6 ，第2 版，细菌名称新定名为节 螺蓝菌) 是一种主要分布于热带、亚热带地区淡水及盐碱性湖泊中的可进行产氧光合 作用的多细胞丝状原核生物，又称为蓝细菌，属蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 、颤藻目 ( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤藻科( o s c i a l l a t o r i a c e a e ) 、螺旋藻属( s p i r u l i n a ) 。螺旋藻藻体蓝绿色， 呈不分枝的螺旋形，故名螺旋藻。螺旋藻的细胞结构很简单，个体成多细胞丝状，一 般其丝状体呈螺旋状，细胞间横壁清晰，这是螺旋藻属的特征。经透射电镜观察证实， 其细胞核区无核膜、核仁，细胞质内无线粒体、叶绿体、高尔基体等细胞器分化：细 胞壁很薄，而且与细胞质密贴在一起不易分开，导致螺旋藻几乎不发生质壁分离现象： 细胞壁外由胶质鞘覆盖，包被细胞及整个丝状体，胶质鞘的主要成分是果胶质，它具 有保护水分、降低蒸发、抵抗干燥的作用，还具有一定的抗紫外线辐射的能力【l 】。 螺旋藻是一种原始的低等植物，也是地球上最早进行光合作用的生物之一，根据 化石分析己在地球上已生存3 5 亿年之久【2 】，就其生长特性而言螺旋藻喜光、喜高温 ( 2 6 3 5 。c ) ，喜碱( p h9 1 1 ) ，有的湖水p h 高达1 1 仍有螺旋藻生长；从生态环境来看， 它的分布很广，主要生长在热带、亚热带的盐碱湖中，土壤、沼泽、淡水、海水和温 泉中也有发现1 3 】。目前，螺旋藻在世界上共有3 6 - - - , 3 8 个种【4 】，其中多数为淡水种类， 分布于海洋或碱性湖泊中的仅有4 种。迄今为止，国内外工厂化大规模养殖的种类主 要是钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和盐泽螺旋藻三种。 螺旋藻富含多种蛋白质、多种维生素、矿物质及多种生物活性物质，且因为细胞 壁薄、纤维素含量低，容易消化吸收，各种营养全面等特点，反映了它作为人类天然 食品和药物来源的巨大潜力。近年来，螺旋藻更以其极高的营养价值和独特的医疗保 健功能，逐渐受到世界许多国家和国际组织的重视，联合国粮农组织( f a o ) 誉之为“明 天最理想的食品”；世晃卫生组织( w h o ) 称螺旋藻为“2 l 世纪最理想保健品”；1 9 9 3 年 在摩洛哥召丌的首次世界螺旋藻大会上，螺旋藻被一致公认为“人类最佳保健食品”。 2 螺旋藻分子遗传学的研究进展 微藻养殖始于2 0 世纪4 0 年代，目前大规模培养的微藻有螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) 、小球藻( c h l o r e l l as p ) 和杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) ，在微藻的大规模养殖 中尚存在一些问题：如通过藻种的改良提高微藻产品质量，即提高有经济价值的生物 活性物质的含量，或者将有用的外源基因转移到微藻中，让微藻生产转基因药物等。 这些任务的解决就是微藻遗传学和微藻生物工程的重要任务。 由于蓝藻是藻类中最原始的门类，并且兼具植物及细菌的一些特性，开发蓝藻作 为基因工程受体越来越受到人们的关注。蓝藻作为外源基因表达受体具有以下优点： ( 1 ) 与高等植物相比，其遗传背景简单，除了裸露的染色体d n a 外，不含叶绿体和线 粒体d n a ，便于基因分析和检测外源d n a ；( 2 ) 细胞壁主要由肽聚糖组成，无高等植 物坚硬的细胞壁纤维素成分，便于外源d n a 的转化：( 3 ) 培养条件简单，成本低廉， 只需光、c 0 2 、无机盐、适当温度就可以获得正常生长，适于连续、静止等多种方式 培养；( 4 ) 与常用的基因工程受体，如与大肠杆菌和酵母菌相比，其细胞体积较大， 能耐受高浓度( 总蛋白的2 5 ) 的单一蛋白，而在e c o l i 中仅为5 ，内源蛋白更新速 度低，对外源蛋白质的容纳量较高；( 5 ) 多数种类含有内源质粒，为构建穿梭质粒载 体提供了极好的条件：( 6 ) 蓝藻富含人体和动物所必需的氨基酸和生理活性物质或前 体，并且多数是无毒的，是食物及药物的重要来源，为基因工程产物直接食用提供了 可能。 近年来，蓝藻分子遗传学研究飞速发展，在基因组学研究、功能基因克隆、光合 作用和固氮代谢的分子调控机理，以及转基因工程研究等方面取得了大量研究成果。 但是有关蓝藻的分子遗传学研究仅存在于少数几个种，如聚球藻( s y e n c h o c o c c u ss p 。) 、 集胞藻( s y n e c h o c y s t i ss p ) a n 鱼腥藻( a n a b a e n as p ) 等；而以螺旋藻为实验材料进行的分 子遗传学研究成果非常少。v a c h h a n i 和v o n s h a k l 5 j 曾将造成这种情况的原因总结为以 下几点：( 1 ) 纯培养的实验材料种类非常少；( 2 ) 螺旋藻在琼胶平板上存在滑行运动， 不易于纯系克隆的分离；( 3 ) 尚未建立起稳定高效的螺旋藻基因转化系统。 2 1 螺旋藻基因克隆的研究 目前已克隆和测序的螺旋藻基因有近3 0 个( 表1 ) 。克隆这些基因一般采用4 种方 法：( 1 ) 异源探针杂交，从基因文库中分离筛选基因。采用该方法成功地克隆了谷氨 酞胺合成酶【8 j 、伊异丙基苹果酸脱氢酶【l8 j 等的基因序列；( 2 ) 通过突变株表型互补的方 法进行基因克隆，如乙酰羟酸合成酶【2 0 1 和腺苷酸环化酶 4 6 , 4 8 , 5 0 】基因就是使用这种方法 得到的；( 3 ) 根据己知的高保守性基因序列设计引物，通过p c r 方法扩增目的基因。 八氢番茄红素合成酶基因【2 8 】和别藻蓝蛋白基因克隆【4 1 , 4 2 , 4 3 】使用的就是p c r 方法。( 4 ) 通过目的基因自身表达的一些容易筛选或检测的蛋白质来鉴定。 一些研究者在螺旋藻的分子分类中也作了许多探索性的研究工作。茅云翔【5 5 j 等测 定了节旋藻属3 个品系和螺旋藻属1 个品系的全长1 6 sr r n a 基因和1 6 s 一2 3 sr r n a 转录单元内间隔区序y u ( i t s ) ，分析了已知的节旋藻、螺旋藻和相关品系的相应序列 的同源性，构建了系统发育树，并评价了这两段d n a 序列在节旋藻、螺旋藻种属分 类和种质鉴定中的意义。李晋楠i s 7 等用1 0 6 条随机引物对7 株钝项螺旋藻进行r a p d 分析，首次将r a p d 分子标记技术用于螺旋藻的分类，为在d n a 水平建立螺旋藻分 类与新品种( 系) 鉴定提供了理论与技术依据。 2 表l 螺旋藻已克隆的部分基因 t a b l e1c o i n e dg e n e so fs p i r u l i n a 箍吲名称 序歹径陆号参考义献 核酮糖l ，5 二磷酸羧化酶基因 一 【7 】 谷氨酰胺合成酶基因 【8 】 3 2 k d a 类囊体膜蛋白和藻蓝蛋白a , 1 3 弧基基因 - 【9 】 翻译延长因子 【1 0 】 s t r 操纵子：核糖体蛋自s 7 噩基( r p s b ) ，s 1 2 基因x 1 5 6 4 6 【1 l ，1 2 ，1 3 】 r r p s g ) ，和翻译延长：因子e f g 基因f l u s ) 和e f t u 基因( t u 0 核糖体蛋 | s 2 幕因( r p s b ) 和延长因子e f 1 s 基因( t s o x 5 3 6 5 1 【1 4 ，1 5 】 核糖体蛋白s 1 0 基l _ b ( r p s l 0 ) 和延长因子t u 基因( t u l ) z 2 1 6 7 6 【1 6 ，1 7 】 8 异丙基苹果酸脱氢酶基因( 1 e u b ) m 7 5 9 0 3 【1 8 ，1 9 1 乙酰羟酸合成酶基因( 两种同功酶基因i l v x ，i l v y )m 7 5 9 0 6 ，m 7 5 9 0 7t 2 0 ，2 1 ，2 2 ，2 3 】 丝氨酸酯酶粜i 大】( e s t b ) $ 7 0 4 1 9 【2 4 ，2 5 】 a t p 合成酶y 暴 z 4 6 7 9 9 f 2 6 ，2 7 】 八氯番笳红索合成酶皋凶( c a b ) a b 0 0 1 2 8 4 2 8 ，2 9 】 ( 3 r ) 羟基豆蔻酰基载体蛋白脱氢酶( f a b z ) l 亩j 源基因 u 4 1 8 2 1 【3 0 】 d e l t a - 1 2 去饱和酶基因( d e s a ) x 8 6 7 3 6 【3l 】 d e l t a - 6 去饱和酶基因( d e s d ) x 8 7 0 9 4【3 2 ，3 3 】 d e l t a 9 去饱和酶基冈( d e s c ) a j 0 0 2 0 6 5 f 3 4 】 d e l t a - 9 酰皋酯去饱和酶基j 鲴( d e s c ) a f 0 0 2 2 5 2 【3 5 ，3 6 重组虽白荣阗( r e c a ) u 3 3 9 2 4 3 7 1 凛蓝坐 jb 亚基基因( c p c b ) 和g t 亚基幕因( c p c a ) y 0 9 0 7 4 ，a j 4 0 11 6 6 【3 8 ，3 9 】 a j 4 0 11 8 2 ，a j 4 0 11 8 4 藻蓝生 jc p e 操纵子：杆状连接体多肽c p c h ，c p c l a f l 6 4 1 3 9 【4 0 1 和c p c d 别藻蓝篮白菜l 捌a p c a , a p c b ，a p c c x 9 5 8 9 8 【4 l 】 别藻i f i ：蛋亡j 基冈a p c a ，a p c b ，d 8 6 1 7 9 【4 2 】 别藻蓝蛋白綦因a p c a , a p c b ， 4 3 】 d n a 结合庇答调节蛋白r p a b 基因 a f l3 5 3 9 2 4 4 ，4 5 】 腺苷酸环化酶基冈c y a a d 4 9 5 3 0 4 6 ，4 7 1 腺廿酸环化酶綦f 矧c y a c d 4 9 6 9 2 【4 8 ，4 9 腺苷酸环化酶綦因c y a g d 4 9 5 3 1 【5 0 ，5 1 】 16 s r d n a 2 3 s r d n a t d n a l , t d n a n 。x 7 5 0 4 4 ，x 7 0 7 6 9 a f 3 2 9 3 9 3 ， 【5 2 ，5 3 5 4 ，5 5 ，5 6 】 ， a f 3 2 9 3 9 2 ，a f 3 2 9 3 9 1 2 2 外源质粒载体的选择构建研究 载体的构建是藻类基因工程的关键所在，是影响外源基因表达，稳定性和表达效 果的重要因素。目前，构建微藻基因工程载体的思路有三种：一是对具有质粒的微藻， 利用微藻自身质粒的复制起点，以及个别质粒能与染色体同源重组的特点，嵌入细菌 选择标记，构建穿梭载体，以实现外源基因在微藻中的游离表达或整合表达；二是对 3， 不具质粒的蓝藻，利用其自身的染色体片段和细菌选择标记，以实现同源重组和整合 表达；三是对不具质粒的真核微藻构建同源整合载体，或利用病毒作为定向整合载体 【5 8 】 0 应用于蓝藻基因转移的载体主要为穿梭载体( s h u t t l ev e c t o r ) ，它不仅含有大肠杆 菌源质粒的复制起始位点，而且也含有蓝藻质粒的复制起始位点，因此它既能转化大 肠杆菌，又能转化蓝藻。h o n d e l 5 9 1 首次成功地将编码a p 抗性的t n 9 0 1 转座子与 a n i d u l a n sr e 小质粒p d u 2 4 构成穿梭质粒，并在a n i d u l a n s 中表达抗性。此后许多学 者在穿梭质粒方面作了一系列卓有成效的研究。孙军【6 0 】等通过三亲结合转移法将小鼠 金属硫蛋白的一e d n a 转入固氮丝状体蓝藻鱼腥藻( a n a b a e n as p ) 7 1 2 0 中，并成功表 达，这是国际上哺乳动物基因转入蓝藻并获表达的首例报道；闵红涛【6 l 】等用溶菌酶处 理单细胞蓝藻s y n e c h o c o c c u cp c c 6 3 0 1 细胞诱导人工感受态，并采用直接转化法获得 阳性藻落，且转化频率比通过生理感受态进行转化得到的转化频率要高；任黎【6 2 】等通 过三亲结合法将人肝金属硫蛋白_ i a 基因转入鱼腥藻中并获得表达；闰艳春【6 3 】等采用 同样的方法将抗性库蚊酯酶基因b 1 的e d n a 转入单细胞集球藻s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 中得到表达。以上研究者通过穿梭载体转化受体并获得基因工程藻，已显 示巨大的应用潜力，但是穿梭载体在受体内往往容易丢失，导致目的基因表达的不稳 定，使得不可避免的会出现藻种退化等问题，蓝藻基因整合平台系统的建立是克服穿 梭质粒表达载体在受体内不能稳定维持的根本措施。 载体进入宿主后一般以两种方式可维持其稳定存在：一是通过自主复制，二是与 宿主染色体整合。构建载体时一般首先考虑采用可自主复制的内源性质粒作为基础质 粒。但螺旋藻内有内源性质粒的报道非常少，秦松等畔】报道从螺旋藻品系o u q d s 6 和o u q d s 3 中分别分离出2 4 0 k b 和1 7 8 k b 的c c cd n a ；h i r o y u k ik o j i m a 6 5 j 报道在 节旋藻中发现巨大质粒，但这些结果均无法被证实。现在研究人员普遍认为节旋藻没 有内源性质粒，而且也未发现其它蓝藻质粒可在螺旋藻细胞内自我复制，因此载体与 螺旋藻染色体整合是实现外源基因稳定维持的重要途径。外源质粒载体可以通过转座 整合或同源重组的方式与螺旋藻染色体整合。近年来对螺旋藻转座整合的研究在不断 地探索之中。k o j i m a 等【6 5 】在钝项螺旋藻f s 中分离得到两个染色体外线性d n a 片段， 分别为1 1 l o b p 的f s 1 和3 3 5 b p 的f s 2 ，并利用该片段构建了基因工程载体p f 3 1 p r l x 。 k a w a t a 6 6 】采用启动子筛选质粒p k _ k 2 3 2 8 获得螺旋藻自身启动子，将c a t 基因整合 进螺旋藻染色体d n a 中表达。 实现同源重组整合要求载体上必须有与宿主染色体同源的d n a 片段，目前构 建的螺旋藻基因工程载体所采用的同源片段大多是随机片段。日本h i r o y u k ik o j i m a t 6 0 】 研究小组使用一段3 8 k b 的随机片段构建了螺旋藻基因工程载体p s l p r l x ；k a w a t a 掣d 7 】曾在线性化的大肠杆菌质粒载体p h s g 3 9 7 两端连接上宿主d n a 片段构建同源 4 重组载体；茅云翔等【6 】分别用节旋藻染色体随机片段和1 6 sr r n a 作为同源重组平台 构建了系列同源重组载体。 2 3 螺旋藻胞内核酸酶活性抑制方法的研究 原核细胞内的高活性限制性内切酶可高效地降解外源d n a ，具有防御和保护的 作用。k a w a m u r a 等【6 8 】报道在钝顶节旋藻亚种s i a m e s e 中发现了三种限制性核酸内切 酶：t r a g u t 6 9 】等从s p i r u l i n ap l a t e n s i sp a c i f i c a 品系中发现了s p ai 、s p ai i 、s p a l i i 、s p a n 四种限制性内切酶，它们分别是t t h i i ii 、p v u i i 、p i i 、h i n d l i i 的同裂酶。本实验 室也证实钝顶螺旋藻细胞内至少同时存在3 种以上的核酸酶s p a p i i 、s p a p i i i 、s p a p i v ， 它们分别是p v u i 、p i i 、h i n d l i i 的同裂酶1 7 。这些酶在3 7 均保持较高的内切酶活 性，使得外源d n a 难以在螺旋藻细胞内稳定存在，为螺旋藻的遗传转化造成重大障 碍。 、 要避免螺旋藻细胞内高活性限制性内切酶对外源基因的降解，必须抑制限制性 内切酶的活性或是筛选出限制性内切酶缺陷菌株。c a o 掣7 l 】研究了温度、m 9 2 + 、e d t a 浓度和洗涤对钝顶节旋藻胞外和胞内核酸酶的影响，结果表明受测试藻株具有非常高 的胞外和胞内核酸酶的活性，足以阻碍外源基因导入细胞。他们发现用无m 9 2 + 的 z a r r o u k 培养基培养螺旋藻，能大大降低其胞内和胞外核酸酶的活性；茅云翔等【7 3 】用 e d t a 预培养的方法显著抑制了螺旋藻胞内核酸酶的活性，并通过电转化法实现了氯 霉素抗性基因在螺旋藻细胞内的表达。柯珍恋等【7 4 j 发现用2 m m o l l d 的e d t a 处理 1 6 h 或低于2 8 c 培养均可降低螺旋藻内核酸酶的活性；本实验室胡晓倩【7 0 】、张海生【7 5 】 实验证明，采用2 m m o l l 以的e d t a 可明显抑制螺旋藻胞内核酸酶的活性，从而有利 于外源基因在藻细胞内的转化和整合表达。 2 4 抗生素筛选标记的选择研究 基因工程中筛选和鉴定转基因细胞的方法是共转化选择标记基因，选择标记基因 表达产物使转基因细胞产生对选择试剂的抗性，这样选择培养基会使未转化细胞受到 抑制甚至死亡，而转化细胞则不受选择试剂影响，能正常生长、发育、分化，从而把 转化体选择出来【7 6 。目前在蓝藻遗传转化中曾经用的选择试剂有氯霉素( c 1 1 1 ) 【7 7 ，7 8 1 、 氨苄青霉素( a m p ) 【7 9 ，8 0 1 、链霉素( s t r ) 【8 1 1 、红霉素( e m ) 圈和新霉素( n m ) 【8 3 】。k a w a t a 等 和c h e e v a d h a n a r a k 等在研究节旋藻的转化时用c h l 作为选择试剂【8 4 1 。曹吉祥等曾 报道节旋藻对c h l 和一种除草剂( l p h o s p h i n o t h r i c i n ，p p t ) 敏感。王高歌等【8 6 】于2 0 0 1 年用电转化法将带有c a t 基因片段的同源重组质粒导入节旋藻s 6 中，用氯霉素 z a r r o u k 固体平板筛选出了抗性转化子。徐虹等【8 7 】以g 4 1 8 作为筛选标记，将质粒 p e u t i s i 超声波转化螺旋藻，筛选到转化藻株，并证实了外源胸腺素仅基因可以在 螺旋藻中得到有效表达。本实验室曹媛媛等【8 8 】通过诱变及反复的验证，获得了两株稳 定的抗氨基酸类似物突变株，分别为抗f p a 突变株a 9 f 和抗c s 突变株a 9 c ，为遗传 5 操作研究提供了携带重要有效遗传标记的材料。 从转化载体所使用的报告基因分析，多数研究小组使用抗生素抗性作为筛选标 记，并且首选c a t 基因( 抗氯霉素) 作为筛选标记。但是由于不同螺旋藻藻株中抗性水 平和抗生素种类相差较大【8 9 】，以及抗生素在培养基内还存在被降解失活效价降低等诸 多问题，增加了研究的复杂程度，因此需要选择更为新颖方便的报告基因。 2 5 报告基因的选择研究及g f p 在藻类遗传转化中的应用 报告基因( r e p o r t e rg e n e ) 是指其表达产物易被检测，且易与内源性背景蛋白相区 别的基因。报告基因应用广泛，从基因表达的时间、空间控制到受体的功能鉴定、药 物筛选以及到基因运送系统等都有涉及。选择报告基因的准则包括：( 1 ) 报告分子应 不存在于宿主中或易于和内源性基因相区别；( 2 ) 应该有一个简单、快速、灵敏及经 济的分析方法来检测报告分子；( 3 ) 报告分子的分析结果应具有很宽的线形范围，以 便分析启动子活性的幅度变化；( 4 ) 报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生 理活动。 常用的报告基因【9 0 j 有：( 1 ) 氯霉素乙酰转移酶基因( c h l o r a m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e ，c a o ，最早用于监测细胞基因的转录活性。它是一种原核生物蛋白合酶抑 制剂，可使乙酰基从乙酰辅酶a 转移到氯霉素的3 羟基位。这种酶性质稳定，而且 在哺乳动物细胞中没有内源性表达。( 2 ) 1 3 半乳糖苷酶基l 玉i d a c z ) ，是一种细菌酶，广 泛用于监测和校正转染效率。其分析简单且无需使用放射性同位素。( 3 ) 岱葡萄糖苷酶 基因( g u s 基因) ，是一种水解酶，可催化各种类型的p 葡糖苷酸裂解。大肠杆菌的p 葡糖苷酸酶( g u s ) 十分稳定，底物可溶，利于操作，可以用荧光分光光度计或组织化 学法检测，在植物基因工程中有广泛的应用【9 。( 4 ) 分泌性碱性磷酸酶基因( s e c r e t e d a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，s e a p ) ，是胎盘碱性磷酸酶的一种突变形式。此酶最大的优点是 表达后可以从细胞内分泌到细胞外，易于在培养基中检测到。( 5 ) 荧光素酶基因，是 一类能催化底物，如荧光素或腔肠素，发生氧化并发射荧光的酶。最常用的是细菌荧 光素酶、萤火虫荧光素酶和最近发现的花虫荧光素酶。( 6 ) 绿色荧光蛋白基因( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，e j p ) ，是从维多利亚生物发光水母中分离出来的一种酶，无需辅 助因子或底物参与，在3 9 5 n m 近紫外光或4 7 0 n m 蓝色光激发后可发出5 1 0 n m 的绿色 荧光。无需裂解细胞即能够检测活体组织和细胞的基因表达。目前已有多种突变体问 世，如蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白等。 在藻类基因工程中，于道展，秦松等一z 】用基因枪将s v 4 0 启动子驱动下的b 半乳 糖苷酶基因导入大型经济海藻裙带菜不同部位的组织切块中，4 8 小时后染色检测， 在假根、孢子叶和叶片中均检测到了l a c z 瞬间表达。吕玉民等【9 3 】用基因枪法将b a r 基因导入杜氏盐藻，研究发现杜氏盐藻碳酸酐酶( c a b 基因启动子可驱动b a r 基因在 杜氏盐藻中瞬时表达，而双拷贝碳酸酐酶( d c a l ) 基因启动子可驱动b a r 基因在杜氏盐 6 藻中稳定表达。潘卫东等【9 4 】以绿色荧光蛋白为报告基因，将报告基因插入莱茵衣藻叶 绿体a t p a 启动子与r b c l 终止子之间，构建载体p s p 7 1 a t p a e g f p ，用基因枪法转入 杜氏盐藻叶绿体中，通过荧光显微镜观察e g f p 基因在a t p a 启动子控制下的表达， 以验证a t p a 启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性。 绿色荧光蛋白基因( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，劝) 是s h i m o m u r a 等于19 6 2 年在研 究水母生物荧光现象时首先报道的【9 5 j ，是酸性、球状蛋白。水母g f p 是分子量为2 7 3 0 k d 含2 3 8 个氨基酸的蛋白质，结构非常稳定【9 6 】；其生色基团由蛋白质分子多肽链 第6 5 6 7 位氨基酸s e r - t y r - g l y 链内环化加氧形成对羟基咪唑环酮，和周围其它三个 氨基酸形成六肽生色团【9 7 , 9 8 j ，当受到3 9 5 n m 近紫外光或4 7 0 n m 蓝色光激发后，在 c a 2 + 激活下能发出5 1 0 n m 的绿色荧光。 枥基因作为报告基因具有以下几种优点：( 1 ) 检测方便，只需荧光显微镜或激发 光源；( 2 ) 材料无需前处理，可以活体观察；( 3 ) 不需任何反应底物或辅助因子；( 4 ) 由 于植物和藻类不含g f p ，不会出现假阳性结果。此外，g f p 蛋白作为免疫反应的二 抗标记可使抗原的检测变得简单易行；作为分子探针可替代荧光染料以避免染料扩散 造成的定位不准；与细胞器特异性多肽融合大大促进了亚细胞定位研究工作【州。张明 等【1 0 0 】探讨了绿色荧光蛋白作为报告基因用于蛋白质转运系统研究的可行性，结果表 明水母绿色荧光蛋白在t a t 信号肽和t a t 转运酶的共同作用下，以折叠形式转运至周 质空间；通过荧光定量分析表明信号肽保守序列中的双精氨酸是保证绿色荧光蛋白转 运及转运效率所必需的。 由于上述优点，使得以励基因作为报告基因广泛地应用于植物基因工程研究中。 v a i n 掣1 0 l 】用基因枪法转化水稻未成熟胚，通过愈伤组织再生得到转基因植株，在根 部及暗中培养地黄化幼苗中有明显地绿色荧光出现。p a n g 等【1 0 2 】用植物内含子插入加 基因中以增强其表达并连接于强启动子之后，通过组织培养得到转基因再生植株，使 g f p 蛋白在绿色叶片中得到表达。近年来，咖基因也开始应用于一些藻类基因工程 研究中。2 0 0 3 年，李杰等【1