（食品科学专业论文）转高赖氨酸蛋白基因玉米食用安全性评价及致敏评价模式研究.pdf

摘要 随着我国转基因食品的开发和国外转基因食品的进入，消费者使用转基因食品的机会在不 断的增加。由于转基因食品可能对环境和健康造成的影响的不确定性，其安全性一直是备受世人 关注的焦点。 本论文对转赖氨酸蛋白玉米的食用安全性及致敏安全评价模型的建立进行了研究。 营养学评价是安全评价的重要组成部分，本文通过对转高赖氨酸蛋白玉米的营养成分、氨基 酸组成、蛋白组分等分析，全面分析了其营养价值及其非期望效应，为转基因食品尤其对于第二 代转基因食品的营养评价提供了依据。 为了更好地分析外源蛋白的食用安全性及致敏性，利用p e t 一3 0 a 表达载体，枉c o l i b l 2 1 中 高效表达外源高赖氨酸蛋白，利用n i - n t a 亲和层析柱纯化蛋白。通过试验，找到了表达蛋白的 最佳表达时间为3 4 h ，诱导剂t g 浓度为0 6m m o l l 及蛋白纯化最佳条件，表达蛋白的量与纯 度满足今后的安全研究需要。 对大肠杆菌表达的纯化高赖氨酸蛋白开展了一系列的食用安全性研究，包括： 利用生物信息学工具对高赖氨酸蛋白进行结构及理化性质预测，利用e x p a s y 网站提供的多 个软件对高赖氨酸蛋白进行结构及理化性质预测，并利用和程序多个b l a s t f a s t a 数据库进行搜 索比对，确定高赖氨酸蛋白与数据库中已知的致敏蛋白不具有同源性。 进行了外源蛋白的模拟胃肠液消化稳定性研究，包括胃蛋白酶稳定性试验和胰蛋白酶稳定性 试验，并经w e s t e m - b l o t 实验验证，高赖氨酸蛋白在体外模拟胃肠液中不具有消化稳定性能。 外源蛋白的食用安全性和致敏动物模型的建立。本研究将b a l b c 小鼠和b n 大鼠模型相结 合，将口服和腹腔注射相结合，利用纯化外源蛋白对b a l b c 小鼠腹腔注射，对b n 大鼠口服处 理，综合判断其毒性、免疫特性和致敏性。结果表明，高赖氨酸蛋白对b a l b c 小鼠和bn 大鼠 均不具有致敏性。 通过亚慢性毒性试验评价了转高赖氨酸玉米饲喂大鼠的安全性。分别饲喂含3 0 添加量的玉 米和昂大添加量的玉米，试验期1 3w k s 。建立了以生长性能、血液学、血清化学、尿液指标、解 剖学、组织病理等综合指标判断转基因食品安全性的亚慢性全食物饲喂动物试验模型。 建立了评价转基因植物外源基因水平转移的大鼠评价模型和大鼠的咬肌组织、肠组织、粪便 及肠道微生物的基因组的提取方法及p c r 检测体系。大鼠的亚慢性毒性试验显示，转基因玉米 以比正常水平高2 倍添加在日粮中，无论对动物健康还是对动物产品都具有生物学安全性，外源 基因没有发生水平转移。 本文通过对转基因玉米的营养评价、外源蛋白性质结构及与己知致敏源的同源性分析、稳定 性检测、食用安全性、致敏性、外源基因的水平转移等多个方面的研究证明，转高赖氨酸蛋白玉 米具有食用安全性。 关键词：转基因，高赖氨酸，食用安全评价，致敏。 a b s t r a c t a i o n gw i t ht h ed e v e l o p m e n to fg e n e t i c a l l ym o d i f i e df o o d ( g m 3i no u rc o u n t r ya n dt h e i n b u r s to ff o r e i g ng m f , t h ec h a n c et h a tc o n s u m e r sc o n s u m eg m fj si n c r e a s i n g b e c a u s e o ft l l eu n c e r t a i n t yo ft h ee 疏c to fg m fo ne n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t h ，t h ee o n c e mo f s a f e t yo f g m f i sa l w a y st h et o pf o c u so f p e o p l e b lt 1 1 i sa r t i c l e t h ef o o ds a f e t ya s s e s s m e n ta n dt h em o d e it oe v a h a t ea l l e r g e n i c i t yo f t r a n s g e n i cm a i z ei n s e r t e dw i mh i 吐l y s i n e - r i c hp r o t e i ng e n ew e r ed i s c u s s e d n u t r i t i o n a la s s e s s m e n ti sa ni m p o r t a n tp a r to fs a f e t ya s s e s s m e n t i nt h i ss t u d y , t h e n u t r i e n t ，a m i n oa c i dp r o f i l ee n dp r o t e i nf r a c t i o n so fl y s i n e r i c ht r a n s g e n i cm a i z ew e r e a n a l y z e dt oe v a l u a t ei t sn u t r i t i o n a lv a l u ea n du n i n t e n d e de f f e c to fg e n e i n s e r t i o n t 1 1 i s w o r kw a st h eb a s eo fn u t r i t i o n a la s s e s s m e n to fg m e e s p e c i a l l yt h es e c o n dg e n e r a t i o no f g m f t h el y s i n e - r i c hp r o t e i nw a se x p r e s s e db ye s c h e r i c h i ac o l iw i t hp e t - 3 0 av e c t o rt o e v a l u a t et h ef o o ds a f e t ya n da l l e r g e n i c i t y t h ee x p r e s s e dp r o t e i nw a s p u r i f i e dw i t hn i n t a h i s b i n d r e s i n t h eo p t i m u n li n d u c i n gt i m ew a s3 4hw i t l l0 6m i n e l 几球t g t h e q u a n t i t ya n dp u r l t yo fe x p r e s s e dp r o t e i nm e tt h es a f e t ya s s e s s m e n t t h e r ew e r eas e r i e so f s t u d i e so nt h ee x p r e s s e dp r o t e i na sf o l l o w i n g ： c o m p a r i n gt h es e q u e n c eh o m o l o g yo fl y s i n e - r i e hp r o t e i nt ok n o w np r o t e i n sw i t l l b i o i n f o r m a t i c st o o l sw a sc o n d u c t e d t h es t n l e t u r ea n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so f l y s i n e r i c hp r o t e i nw e r ef o r e c a s t e dw i t hd i f f e r e n tt o o l so ne ! a s yw e b s i t e a n dt h e p r o t e i nw a sa l s oc o m p a r e dt ok n o w na l l e r g e n i cp r o t e i n sw i t l lb l a s ta n df a s l a p r o g r a m si nf a m o u sp r o t e i ns e q u e n c ed a t a b a s e i ti sc o n f i r m e dt h a tt h el y s i n e - r i c hp r o t e i n h a dn os e q u e n c eh o m o l o g yw i t hk n o w na l l e r g e n i cp r o t e i n t h es t a b i l i t yo fe x p r e s s e dp r o t e i nt o p e p s i na n dp a n c r e a t i nw a sd e t e c t e di n c l u d i n g s i m u l a t e dg a s t r i cf l u i dt e s ta n ds i m u l a t e di n t e s t i n a lf l u i dt e s t t h em i x t u r ew a sa n a l y z e d t h r o u g hs d s p a g ea n dw e s t e r n - b l o tt od e t e c tt h ed i g e s t i b i l i t yo ft h ep r o t e i n i ti s d e m o n s t r a t e dt h a tt h el y s i n e - r i c hp r o t e i nh a dn os t a b i l i t yi ns t i m u l a t e dg a s t r i c i n t e s t i n a l f l u i d t h ef o o ds a f e t ya s s e s s m e n ta n da n i m a lm o d e lo fa l l e r g e n i e i t yo ff o r e i g np r o t e i nw a s a l s oc o v e r e d i nt h i sr e s e a r c h t h eb nr a ta n db l a b ，cm o u s em o d e lw e r ec o n j o i n e dw i t h o r a la d m i n i s t r a t i o na n d i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n b l a b cm i c e w e r e i n j e e t e d i n t r a p e r i t o n e a l l ya n db n r a t sw e r ea d m i n i s t e r e do r a l l yw i t he x p r e s s e dp r o t e i nt od e t e c ti t s t o x i c i t y , i m m u n i t ya n da l l e r g e n i c i t y i tw a si n d i c a t e dt h a tt h el y s i n e r i c hp r o t e i nw a s n o n a l l e r g e n i ct ot h eb l 蚰吾c m o u s ea n dt h eb n r a t t h es u b c h r o n i ct o x i c i t yo ft r a n s g e n i cm a i z ew a sa s s e s s e db yf e e d i n gr a t sf o r9 0d a y s t h e s er a t sw e r ef e di n d i v i d u a l l yw i t l la d 呵9 3 gf e e d 3 0 m a i z ea n d7 6 m a i z e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh - a n s g e n j cm a i z eh a dn oh a r m f u le r i e c t so nt h eg r o w t ha n d n n t r i t i o n a li n d i c e so fr a t s t h i sw e r kb u i l tt h ea n i m a lm o d e lo fs u b c h r o n i ct o x i c i t yo f t r a n s g e n i ef o o dw i t l lt h ep a r a m e t e r so fh a e m a t o l o g y , b i o c h e m i s t r yo fs e r u ma n du r i n e a n a t o m ya n dh i s t o p a t h o l o g y m e a n w h i l et h em o d e lo fh o r i z o n t a lg e n et r a n s f e ri nr a t sw a sf o a n d t h eg e n o m e so f m u s c l e ，i n t e s t i n e ，d e j e e t aa n di n t e s t i n a lm i c r o b eo fr a t sw e r ei s o l a t e da n di n s e r t i o ng e n e s w e r ed e t e c t e db yp c r t h er e s u l t so ft h es u b c h r o n i ct o x i c i t ys h o w e dt h a tt h ed o u b l e e x p o s u r eo ft r a n s g e n i cm a i z ew a ss a f e t yt oa n i m a lh e a l t ha n da n i m a lp r o d u c t s a n dt h e r e w e r en og e n et r a n s f e rh a p p e n e d t h e s er e s u l t so fn u t r i t i o n a la s s e s s m e n t ，t h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fi n s e r t e dp r o t e i n ， t h es e q u e n c eh o m o l o g yw i t hk n o w na l l e r g e n ，t h es t a b i l i t yt op e p s i na n dt r y p s i n ，t h ef o o d s a f e t y , a l l e r g e n i c i t ya n dh o r i z o n t a lg e n et r a n s f e rd e m o n s t r a t e dt h a tt h el y s i n e r i c hp r o t e i n w a ss a f e t yi nf o o d k e y w o r d s ：g e n e t i c a l l ym o d i f i e d ，l y s i n e - r i c h ，f o o ds a f e t ya s s e s s m e n t ，a l l e r g e n i c i t y i i l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：诬众乏 时间： 口6 年6 月枷日 f 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：傻 卅 导师签名 时间：们年乡月”日 时间：2 奶年肚f 日 呼乙 幢 中国农业大学博士论文 第一章文献综述 第一章文献综述 转基因食品( g m f ) 是指利用基因工程技术改造基因构成的食品，包括转基因植物、转基因 动物和转基因微生物( l u c c a ，e t a l ，2 0 0 2 ) 。 自首例转基因烟草于1 9 8 3 年问世以来，转基因作物以其无可比拟的优势，在短短2 0 年时间 内得到了飞跃发展，仅从1 9 9 6 年到2 0 0 5 年，全球的转基因作物种植总面积达到了9 0 0 0 万公顷， 种植面积达到了5 8 7 0 万公顷，销售额从1 9 9 5 年的7 5 0 0 万美元增加到1 9 9 9 年的2 1 - 2 3 亿美元 ( o u i n n ，e la 1 ，2 0 0 0 ；f a l c o ，e ta l ，1 9 9 5 ；d i n k i n s ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，迄今为止，全球生产的含 转基因成分的食品有近万种( a u s t i n - p h i l l i p s ，e ta l ，1 9 9 9 ) 。种植转基因作物的国家已经增加到 2 1 个。其中，转基因作物种植面积居前5 位的国家分别是美国、阿根廷、巴西、加拿大和中国， 占全世界种植面积的9 9 ( h t t p ：w w w z j a g r i g o v c n ) 。 随着转基因技术的发展，转基因作物的生态风险、可能带来的环境问题、作为食品对人体健 康影响的问题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等己引起世界性的 广泛关注。转基因产品的安全性问题已由学术观点分歧、发展到知识产权、环境问题、经济问题 甚至政治问题。尽管转基因的安全性至今仍然争论不休，尚无定论，但转基因修饰食品在增加食 物产量、改善食物品质、改善食品加工和储存特性等方面起的重要作用却不可否定( 张启发， 2 0 0 0 ) 。因此，转基因技术将成为2 1 世纪的重要支持产业。 由于转基因技术是- - 1 7 新技术，转基因食品应用于生产和消费的时间短，食品的安全性和可 靠性都有待于进一步的研究和证明。转基因食品导致一些遗传学和营养成分的非预期改变，对人 类健康和环境生态的影响还难以估计预测。在基因修饰植物迅速推出、公众存在种种疑虑的今天， 有必要对基因修饰植物向肠道微生物和哺乳动物细胞是否存在基因转移；食用基因修饰食物是否 造成食物中毒和存在潜在过敏性；以及作为标记物的抗生素抗性基因用于基因修饰植物筛选是否 安全等重大疑难问题作出具有科学依据的回答。 本章概括了转基因食品的发展概况，影响转基因食品的食用安全因素。开展对转基因食品安 全评价的必要性，转基因食品安全评价的方法和发展，以及本论文的整体构思与体系结构。 1 1 转基因食品的发展概况 自1 9 9 4 年，首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准商业化至今，国内外 已经报道的商品化的转基因作物共有1 6 类7 0 多个品种( j a m e s ，2 0 0 1 ：2 0 0 0 ；1 9 9 8 ；1 9 9 7 ；1 9 9 6 ) 。 1 1 1 转基因食品的分类及发展 转基因食品又称基因修饰食品，一般可分为以下三类：转基因植物、转基因动物和转基因微 生物食品。一般认为转基因食品主要涉及农业基因工程和食品基因工程。前者强调提高农作物产 量和改善农作物的抗虫、抗病、抗除草剂及抗旱的能力，即第一代转基因食品；而后者则强调改 善食品的营养学价值和食用风味，如营养素含量、风味品质、延长食品储藏、保存时间，以及食 品工程菌生产食品添加剂和功能因子等，即第二代转基因食品。 1 1 2 品质改良作物的发展概况 植物可以合成糖、各种有机物质如维生素、糖、淀粉、脂肪、氨基酸等。大约有8 0 0 0 0 到 1 0 0 0 0 0 种不同的物质是在植物体内合成的。包括大量营养素如蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维 素等，微最营养素如维生素和矿物质、抗营养因子如植酸酶和内在毒素及一些对人体和动物健康 有益的特有的化合物等( c o r m ，1 9 9 5 ) 。 目前培育的基因修饰植物正朝着改善农艺性状和提高营养水平方面发展。目前品质改良转 基因植物( i m p r o v e dn u t r i t i o n a lq u a l i t y ) 主要有： ( 1 ) 食品中新增营养因子如s c i e n c e 在2 0 0 0 年1 月1 4 日报道了瑞士公立研究所成功开发了富 含v i t a m i na 前体的基因重组水稻，被称之为g o l d e nr i c e ，这种水稻的开发成功将有望解决世界 许多发展中国家儿童因缺乏v i t a m i n a 而导致的致盲现象( u n d e r w o o d ，1 9 9 4 ) ； ( 2 ) 油脂的改良，d u p o n t 公司通过反义r n a 技术抑制油酸脂脱氢酶，获得含8 0 油酸的高 油酸含量大豆油；c a l g e n e 公司则开发出可替代氢化油制造人造奶油、酥油的含3 0 硬脂酸的大 豆油和芥予油： ( 3 ) 蛋白质的改良，通过基因重组技术获得高赖氨酸转基因玉米( q u i n n ，e t a l ，2 0 0 0 ) 、高赖 氨酸的油菜和大豆( f a l e o ，e la 1 ，1 9 9 5 ) 。d i n k i n s 等人通过过量表达玉米的甲硫氨酸1 5 k d 醇溶 蛋白氨基酸提高了大豆的富硫氨基酸( d i n k i n s ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。对于那些无法达到营养平衡的不 发达国家，这些改变将非常有益。 ( 4 ) 改善作物品质，一个成功例子为降低玉米中植酸酶含量吐改变对矿物质的吸收( a u s t i n ， e f a l ，1 9 9 9 ) ： ( 5 ) 改良碳水化台物，通过基因修饰可将产生工业用油的亚麻改为生产与玉米油类似的高级 食用油：开发高淀粉含量的马铃薯，且质地分布均匀，便于加工； ( 6 ) 果蔬品质的改良，除增加果蔬的贮藏期外，目前的研究已开始在提高营养品质和加工特 性上展开。如转入酵母异戊烯腺嘌呤焦磷酸( i p p ) 异构酶基因的番茄，其胡萝b 素和番茄红素 的含量增加了2 - 3 倍；利用反义技术将马铃薯多酚氧化酶( p p o ) 基因的p o t 3 2 片段插入马铃薯 中，获得抗加工褐变的转基因马铃薯。此外，可以刺激人体免疫的可直接食用的疫苗食品。 1 2 转基因食品的安全问题 1 2 1 转基因食品潜在风险 转基因食品作为人类历史上未曾有过的食品，其食用安全性一直是科学界、政府和广大消费 者关心的焦点问题。特别是1 9 9 8 年苏格兰r o w e t t 研究所的科学家p u s z t a i a 宣布食用转基因马铃 薯的老鼠生长发育异常、免疫系统受损的研究后，转基因食品的安全性问题更成为世人关注的焦 点( 罗云波，2 0 0 0 ) 。在另外一些研究中发现含有巴西坚果基因的转基因大豆，含有人体过敏因 子2 s 清蛋白：美国a v e n t i s 公司的抗虫转基因玉米“s t a r l i n k ”在商品化后，至少有“人囚食用 含该成分的食品发生过敏现象，在通过模拟人消化道的实验中发现抗虫基因c r y 9 c 的产物未被消 化，认为是可能的潜在过敏原( g u r i a n ，2 0 0 1 ) 。 在转基因食品中，人们担心的问题主要有：( 1 ) 在现行食品中利用基因修饰过程导八的供体 2 中国农业大学博：l 论文 第一覃文献综述 基因编码产生的直接后果( 如营养、毒索或致敏性作用) ；( 2 ) 在基因修饰过程中导入或修饰基 因编码改变受体基因产物水平所产生的直接后果；( 3 ) 供体基因的产物或受体基因水平改变后影 响亲本生物的代谢造成的问接后果，因为这些改变会进而产生新的食物成分或改变原有成分的水 平；( 4 ) 亲本生物在遗传修饰过程中引起的突变( 如基因编码或控制序列被中断，亦或休眠基因 被激活) 产生新的食物成分或改变原有成分的水平的后果；( 5 ) 从摄入的遗传修饰生物( g m o ) 以及由此产生的食品或食物成分中基因向肠道菌群转移的后果；( 6 ) 转基因食品发展的潜在不利 于健康的危害( 吴永宁等，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 转基因食品食用安全评价的必要性 ( 1 ) 目前的科学技术水平还不可能完全精确地预测一个基因在一个新的遗传背景中会产生什 么样的相互作用，而且转基因食品中基因的表达受环境等多种因素的影响，此外，还存在基因的 多效性、体细胞变异等问题，因此要精确地预测转基因食品可能产生的所有表型效应尚有困难。 ( 2 ) 转基因生物与常规育种所用的基因来源有很大的不同。在常规有性杂交中，由于受有性 亲和性的限制，基因来源一般局限于种内。除有性杂交外，在育种上又出现了许多新技术如物理 和化学诱变、非整倍体技术、近缘或远缘物种之间的染色体操作、体细胞变异、细胞融合等，尽 管这些技术的发展拓宽了常规育种的基因源，但它仍局限于近缘种属。 ( 3 ) 重组d n a 和转基因技术的发展，使基因可以在动物、植物、微生物之间相互转移，甚至 可以将人工设计合成的基因导入生物体中实现表达。因此转基因食品的基因来源之广是常规有性 杂交所不可比拟的。正因为如此，转基因食品中有可能出现一些我们在常规育种中不曾遇到过的 新组合、新性状，人们对于这些新组台、新性状可能影响人类健康和生态环境的认识还缺乏知识 和经验。 ( 4 ) 转基因食品的研究与生产的迅速发展，客观要求安全评价的必要性。 ( 5 ) 由于缺乏知识，缺乏对生物技术的了解公众对生物技术产品持保留态度，并提出各种安 全性疑问。因而有必要通过安全评估实践，积累足够的证据和资料来回答这些问题，向公众证明， 转基因食品的开发利用是建立在坚实的科学基础之上并在严格的管理制度监督下有效地进行 的。 ( 6 ) 随着生物技术的发展，转基因食品将进入国际市场。在国际竞争中，一些发达国家会以缺 少安全评价为借口，限制发展中国家的转基因生物及其产品进入国际市场。因此转基因食品的安 全性评价对我国的农产品出口也有十分重要的意义( 许牡丹等，2 0 0 3 ) 。 1 3 转基因食品安全评价的原则 1 3 1 实质等同性原则 为了保证转基因食品的安全性，包括美国、欧盟、日本和我国在内的许多国家以及f a o 、 w h o 等一些国际组织纷纷制订了一系列针对转基因食品安全性的管理措施( h a l f o r d ，2 0 0 0 1 m o s e l y ，2 0 0 2 ) 。其中1 9 9 3 年由o e c d ( 经济合作与发展组织) 提出的食品安全性评价的原则一 实质等同性原则( s u b s t a n t i a le q u i v a l e n c e ) ，是目前国际公认的转基因食品安全性评价的通用原则 ( o e c d ，1 9 9 3 ) 。其核心内容是：与转基因植物相对应的非转基因植物由于有长期的食用历史， 3 中国农业大学博士论文第一章文献综述 因而被认为是安全的。如果转基因植物食品在化学组成上与对应的非转基因植物食品无实质性差 异，可以认为该转基因植物食品是安全的( o e c d ，1 9 9 6 ) 。 “实质等同性”原则已成为转基因产品安全性评价的指导性原则，转基因食品和饲料在释放 和商业化前均需要在该框架体系下进行评价。 对品质改良的第二代转基因产品，如转基因羽扇豆总氨基酸含量与其亲本相近，而蛋氨酸 水平提高了1 倍( m o l v i g ，e t a l ，1 9 9 7 ) ，此时，两种羽扇豆则不因总营养成分相近而具有实质等 同性，因此，应灵活运用“实质等同性”原则进行分析和评估。 e r i c km i l l s t o n e 等( 1 9 9 9 ) 对“实质等同性”原则提出异议，他们认为“实质等同性”的概 念不清楚，容易引起误导。用最终食品的化学成分来评价食品的安全性，而不管转基因作物或转 基因食品的整个生产过程的安全性，包括人体健康安全和生态环境安全，只要某一转基因食品成 分与市场上销售的传统食品成分相似，则认为该转基因食品同传统食品一样安全，就没有必要做 毒理学、过敏性和免疫学试验。但就目前的科学水平而言，科学家还不能通过转基因食品的化学 成分准确地预测它的生化或毒理学影响。在m i l l s t o n e 等看来，“实质等同性”不应该作为对转基因 的食品安全性的唯一评价，应同时进行全面的生化、毒理学、过敏性和免疫学的试验方法来进行 安全性评价( 李荔，2 0 0 4 ) 。实质等同性是转基因食品评价的基本原则，是针对转基因食品的危 害以及关键营养素的改变与人类健康的关系，而不是针对食品的每种成分的安全性评价。在“实 质等同性”原则安全性评价的基础上，中国制定了基因修饰物风险评估框架，用以监控和指导我 国转基因作物的生产和释放。 1 3 2 预先防范的原则 虽然转基因生物及其产品尚未对环境和人类健康产生危害，但是从生物安全的角度来考虑，必 须将预先防范的原则作为风险评估的指导原则，因为转基因植物的风险有时是难于预料的。因此， 必须以科学原理为基础，采取对公众透明的方式，结合其他的评价原则，对转基冈生物及其产品 进行风险评估，防患于未然。 1 3 3 个案评价的原则 由于转基因生物及其产品中导入的基因来源、功能各不相同，受体生物及基因操作也可能不 同，因此，必须针对性的逐个进行评估，这也只目前大多数国家采取的评估原则。 1 3 4 风险效益平衡的原则 现代生物技术所产生的转基因生物及其产品可以带来巨大的经济效益，在风险评估中，需要 对转基因生物及其产品的效益和它可能给环境和人类健康带来的风险进行权衡，从而确定是否继 续开发相关产品。 1 3 5 逐步评估的原则 要求在实验室研究、中间试验、环境释放和商业化生产等几个环节上对转基因生物及其产品 进行风险评估，根据前步实验积累的相关数据和经验作为评估基础，确定是否进入下一个开发阶 4 中国农业大学博士论文第一章文献综述 段。逐步评估有3 种结果：第一，转基因生物及其产品可以进入下一阶段；第二，暂不能进入下 一阶段，需要进一步在本阶段补充必要的数据和信息；第三，转基因生物及其产品不能进入下一 阶段。 1 3 6 熟悉性原则 指要了解转基因生物及其产品的有关性状、同其他生物或环境的相互作用、预定用途等背景 知识。转基因生物及其产品的风险评估工作既可以在短时期内完成，也可能需要长期监测，这主 要取决于人们对转基因生物有关背景信息的熟悉程度。在风险评估时，必须牢记这样的概念：熟 悉并不表示所评估的转基因生物及其产品安全无害而仅意味着可以采取已知的管理程序：不熟 悉也并不表示所评估的转基因生物及其产品有害，也仅意味着在对此转基因生物及其产品熟悉之 前，需要逐步对可能的潜在风险进行评估。熟悉是一个动态的过程。 1 4 转基因食品食用安全性评价的内容 1 4 1 营养学化学组成评价 比较转基因产品与同，近基因型亲本的传统品种养分差异，包括粗蛋白质、碳水化合物、脂肪 酸、纤维素、维生素、矿物质；全面分析氨基酸、脂肪酸的组成和含量变化；测定抗营养因子含 量。外源基因的插入是否会影响农产品的营养成分，是一个评价的主要问题。对于第一代转基因 食品主要对植物的抗逆性状进行改善，营养上具备实质等同性就可以认为在营养水平安全：对于， 改善营养品质的第二代转基因食品，则需要在营养成分上做更多的分析，除对主要营养成分进行 分析外，还需要对增加的营养成分做膳食暴露量和最大允许摄入量的分析与试验( m o s e l y ，2 0 0 2 ) 。 1 4 2 转基因食品的非期望效应 到目前为止，在转基因操作中对外源基因的插入位点尚无法准确控制( m o s e l y 。2 0 0 2 ) ，对外 源基因与植物基因组之间可能存在的各种复杂的相互作用以及由此产生的各种非预期效应也了 解甚少。虽然通过对外源基因特性的分析可以在一定程度上对转基因植物可能产生的代谢特性等 方面的变化进行预测，但是对于转基因操作中外源基因插入位点的不确定性等因素引起的非预期 效应却难以准确预测( k u i p e r ，e ta l ，2 0 0 3 ) 。这些非预期效应可以引起植物的营养成分和代谢产 物的含量发生变化，甚至可能使转基因植物产生一些新的毒性物质( k u i p e r ，“a l , ，2 0 0 1 ) ，因此 转基因植物中外源基因的非预期效应是引起转基因植物食品安全性问题的主要原因之一，也是转 基因食品食用安全评价的主要内容之一。 1 4 3 生物学等价性评价 以实验动物小鼠、大鼠、畜禽、水产动物为对象进行短期或，和生长全程的饲养试验，转基因 产品应为试验日粮的主要成分，饲喂后评定动物的生长性能、肉质特性和营养物质消化率等指标， 尤其对营养成分发生改变的第二代转基因产品，因产生了明显的营养差异，强调要进行生物学等 价性的评价。 中国农业大学博七论文 第一章文献综述 1 4 4 毒理学评价内容 重点研究表达产物如蛋白质对动物的安全性，除研究蛋白质在模拟消化道的降解特性外，尚 需进行口服急性毒性试验，再视急性毒性试验结果来确定是否需要进行致突变试验、致畸试验、 亚急性与慢性毒性试验、代谢试验和致癌试验。 1 4 5 过敏性评价 若导入基因来自已知含有过敏原的生物，其编码的蛋白质是在转基因产品的食用部分表达， 则不论是常见或不常见的过敏原，均需确定该基因是否编码某种过敏原；转基因产品用于食品 时，还必须进行人的i 临床试验来确定其过敏性，如：皮肤穿刺试验等。 1 4 6 抗生素抗性基因的水平转移 转基因植物中的抗生索抗性基因是否会通过食物在肠道中水平转移至微生物，从而影响抗生 素的有效性，也是影响转基因食品食用安全的因素。目前尚无基因从植物转移至肠道微生物的证 据，也无在人类消化系统中细菌转化的研究报道。目前一般认为发生基因水平转移并表达的可能 极小，因为这一过程的发生要涉及到多个阶段，需要多种条件共同存在于消化道中，而事实上在 消化道中这些条件的实现是非常困难的( 贾士荣，1 9 9 7 ) 。 虽然由于多种原因外源基因( 目的基因和标记基因) 水平转移的可能性较小，但这种情况一旦发 生后果将非常严重，特别是用作标记基因的抗生素抗性基因，如果发生水平转移将会导致耐药菌 的增多，对人类的健康造成极大威胁，有必要对其进行安全评价，在机制方面进行研究，为外源 基因安全性评价提供系统、详尽的资料( 贾士荣，1 9 9 7 ) 。 1 5 转基因食品的过敏性评价 食物过敏是一个全世界关注的公共卫生问题，约2 的成年人和6 8 的儿童患有食物过 敏症。1 9 9 9 年国际食品法典委员会第2 3 次会议公布了常见致敏食品的清单，包括花生、大豆、 牛奶、鸡蛋、鱼类、贝类、小麦和坚果等，9 0 以上的过敏反应是由这8 大类常见致敏食品而引 起的。另外还存在其他1 6 0 类食物也可引起过敏反应。几乎所有的食物致敏原都是蛋白质，但在食 物的多种蛋白质中只有少数几种是致敏原。多数食物致敏原引起人的i 型过敏反应，症状主要为口 周红斑、唇肿、口腔疼痛、舌咽肿、恶心以及呕吐等。转基因技术选择某特定基因导入植物， 有利于提高植物的产量，改善植物的品质，增强植物的抗病、抗虫能力。然而，由于基因重组能够 使宿主植物产生新的蛋白质，这些新蛋白质有可能对人体产生包括致敏性在内的毒效应。n o r d l e e 等就发现了一种转基因大豆可以使人产生过敏反应。随着转基因农作物种植面积的逐年增加，转 基因食品的安全性引起了越来越广泛的关注。因此，在新的转基因食品商业化之前，需要对其进 行包括致敏性在内的安全性评估( 顾祖维，2 0 0 5 ：邱伟芬，2 0 0 2 ) 。 2 0 0 1 年，f a o w h o 生物技术食品致敏性联合专家咨询会$ 义( j o i n tf a o w h oe x p e r t c o n s u l t a t i o no n a l l e r g e n i c i t yo f f o o d sd e r i v e df r o mb i o t e c h n o l o g y ) 进一步发展和完善了已有评估 6 中国农业大学博士论文 第一章文献综述 程序，公布了新的转基因食品潜在致敏性树状评估策略( 周彦兵，2 0 0 1 ) 。与2 0 0 0 年公布的评估 策略相比，新的评估策略删除了皮肤穿刺试验和双盲法食物激发试验，增加了定向筛选血清学试 验和动物模型试验。在该评估策略中，首先是判断基因的来源，根据基因是否来源于已知对人体致 敏的物种而采取不同的分析步骤。 1 5 1 转入的基因来源于已知致敏物种的评估 基因是否来灏予致敏物种 f a o 砌t o2 0 0 0 年食品致敏性评估的树状分析步骤 注：卜阳性一卜阴性 首先进行氨基酸序列的相似性比较，如果证明重组蛋白质和已知致敏蛋白质间存在相似序 列，就可判定该重组蛋白质为可能致敏原，无需进行下一步试验：如果重组蛋白质和已知致敏蛋 白质问不存在相似序列，则需用对基因米源物种过敏患者的血清进行特异i g e 抗体结合试验。在 进行血清学试验时，该评估策略没有区分转入的基因是否来源于常见的致敏性物种，只要氨基酸 序列相似性比较结果为阴性，都需进行特异i g e 抗体检测试验。如果特异i g e 抗体检测试验结果 为阳性，就可判定该重组蛋白质为可能致敏原，无需进行下一步试验如果试验结果为阴性，则 需进行定向筛选血清学试验、模拟胃肠液消化试验和动物模型试验。这一决策方法一提出就得到 了农业生物技术领域的广泛采纳，也得到了w h o 的认可( w h o ，2 0 0 0 ) 。 1 5 2 转入的基因来源于非已知致敏物种的评估 首先应通过致敏原数据库比较，重组蛋白质和己知致敏原序列相似性；序列相似性比较结果 阳性，就判定该重组蛋白质为可能致敏原，无需进行下一步试验；序列相似性比较结果阴性，需 7 中国农业大学博士论文第一章文献综述 进行重组蛋白质与含基因来源相关特异i g e 抗体的血清间的结合试验定向筛选血清学试 验，如果定向筛选血清学试验阴性，则需进行模拟胃肠液消化试验和动物模型试验。 1 5 3 转基因食品过敏性评价的方法 m e t c a l f ee la 1 ( 1 9 9 6 ) 建议，蛋白的表达水平是评价转基因食品过敏性要考虑的一个主要因 素。转基因食品中外源蛋白的致敏性评价是转基因食品安全评价的重要组成部分( t a y l o r ，2 0 0 1 ) 。 但目前没有单一的一种方法可以完全预测外源蛋白的潜在致敏性( t a y l o r ，2 0 0 2 ) 。 转基因食品的过敏评价一般采用综合、分步、及个例分析的方法( f a o w h o ，2 0 0 1 ) 。 f a o w h o 建议，在进行致敏性分析时，应考虑：基因来源，特别要注意是否来自已知过敏原。 相对分子量：大多数的致敏原的相对分子量介于1 0 0 0 d - 4 0 0 0 1 ) 之间。序列同源性。热稳 定性。消化稳定性。在食物中的分布情况。上述方法为外源蛋白的致敏性评价提供了有价值 的信息，但没有一项指标与待测蛋白的致敏反应有直接的联系，当以上所得结果为阴性时，待测 蛋白仍可能是一种致敏原；如果得到阳性结果，仍需进一步试验来证实新蛋白质的潜在致敏性 ( e p a ，2 0 0 0 ) 。因此，确定蛋白质致敏性的最直接方法就是建立一种广泛接受的动物模型并对其 进行证实( 贾旭东，2 0 0 5 ) 。 1 6 本研究的目的与研究内容 1 6 1 研究的目的、意义 随着我国转基因食品的开发和国外转基因食品的进入，消费者使用转基因的机会在不断的增 加。由于转基因食品可能对环境和健康造成的影响的不确定性，其安全性一直是备受世人关注的 焦点。玉米在我国国民经济中占有重要地位，它不仅是我国的主要粮食作物之一，而且作为饲料 原料的主要来源，是人类和家畜的重要蛋白质来源。转基因玉米的食用安全性和营养质量特性对 今后的开发利用有重要的影响，同时，其评估模型的建立对于今后评价以品质改良为主的第二代 转基因食品的评价有重要的参考意义。开展转基因食品的安全性评价，是保障生物技术在农业和 食品领域中可持续发展的重要手段，同时在保障人类健康和环境安全、提供科学决策的依据、促 进国际贸易和维护国家权益等方面也有着非常重要的意义。 1 6 2 本论文的研究内容 1 外源基因的插入是否会影响农产品的营养成分 ( 1 ) 转基因玉米重要营养成分分析，包括水份、蛋白质、脂肪、粗纤维、灰分、碳水化合物、 重要矿物质( n a 、m g 、c a 、p 、k 、c u 、z n 、m n 、f e ) 、氨基酸；维生