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兰州大学硕士学位论文 d n a 指纹技术在近交系小鼠遗传检测中的应用研究 中文摘要 目的：探讨d n a 指纹技术在近交系小鼠遗传检测中的应用价值，建立可反映近 交系小鼠更多遗传概貌的特异、精确、稳定的遗传检测方法。 方法：采用人工合成生物素标记寡核苷酸探针( c - r g a t ) 4 用s o u n t h e m 杂交法对 c 5 7 b l 6 j 、b a l a c 、d b a 1 、d b a j 2 四种近交系小鼠及d b a 2 d b a 1 f l 代小鼠进行 d n a 指纹图分析；同时用国家标准生化位点检测方法检测四个近交系小鼠及d b a 2 d b a 1 f 1 代小鼠的c a r - 2 、e s - 1 、e s - 3 、c , p i l 、h b b 、i d h o l 、t r f 、c e 2 、e s 一1 0 、 m o d - 1 、p g m - l 、g p d 一1 、a k p 一1 等生化位点，并对两种方法进行比较。 结果：在所检测的四个近交系小鼠品系及d b 2 d b a 1f l 代小鼠中，品系内不 同个体的d n a 指纹图谱带型基本一致，不同品系小鼠的带型差别明显。对d n a 指纹 图谱带型聚类分析的结果，品系内小鼠的带型相似系数很高，c 5 7 b l 6 j 、d b a 2 、b a l a c 分别为1 、0 9 5 2 4 、1 。而不同品系小鼠间的带型相似系数较低。生化位点分析表明四个 近交系小鼠品系均无遗传改变。研究表明d n a 指纹图具有良好的多态性，不仅可以分 辨生化位点标记分析法能够区分的不同品系的近交系小鼠，也能够分辨生化位点标记分 析法不能区分的遗传发生改变的小鼠。且作者用同一方法重复同一基因组d n a 的指纹 图时，获得相同的实验结果。 结论：用人工合成的寡核苷酸为探针的d n a 指纹技术检测遗传变异灵敏度高， 稳定性好，并可检测出个体或品系间的遗传距离，在近交系小鼠的遗传质量检测中有广 阔的应用前景。 关键词：近交系小鼠；遗传质量检测；d n a 指纹；生化位点标记 兰州大学硕士学位论文 s t u d y o n a p p l i c a t i o n o fd n a f i n g e r p r i n t i n g i nt h e h e r e d i t ym o n i t o r i n g o fi n b r e dm i c e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h ea i mo f t h es t u d yi st oe x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo ft h ed n a f i n g e r p r i n t i n g a n a l y s i si nt i l eg e n e t i cm o n i t o r i n go fi n b r e dm o u s es t r a i n s ，i no r d e rt os e tu pt h ee x a c t r e l i a b l e ，s p e c i f i ca n d c o n v e n i e n tm e t h o do f t h e h e r e d i t ym o n i t o r i n go f i n b r e d m i c e ， m e t h o d s ：d n a f i n g e r p r i n t i n g so ff o u ri n b r e ds t r a i nm i c e c s t b l 6 j ，b a l a c ，d b a 1 d b a 2a n dd b a 2 d b a i f im i c ew e r ea n a l y z e dw i t hs o u t h e r nh y b r i d i z a t i o n b yu s i n g b i o t i nl a b e l e d ( g g a t ) 4o l i g o n u c l e o t i d ep r o b e t h e g e n e t i cq u a l i t yo f t h e s ei n b r e ds t r a i n sw a s a l s om o n i t o r e da n d c o m p a r e ds i m u l t a n e o u s l yw i t h t h et r a d i t i o n a lm e t h o d ，b i o c h e m i c a lm a r k a n a l y z e db i o c h e m i c a ls i t ei n c l u d e dc a r - 2 ，e s - 1 ，e s - 3 ，g p i l ，h b b ，i d h 一1 ，t r f , c e - 2 ，e s 1 0 ， m o d 一1 ，p g m 一1 ，o p d - 1a n da k p 一1 r e s u l t s ：t h ed n a f i n g e r p r i n t i n gp a t t e r n so fi n d i v i d u a l sf r o mt h es a m es t r a i nw e r e i d e n t i c a l ，b u tt h o s eo fi n d i v i d u a l sf r o md i f f e r e n ts t r a i n sw e r ed i s s i m i l a r c l u s t e r i n ga n a l y s i s i n d i c a t e dt h a ts i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t sa m o n gi n d i v i d u a l sw i t h i ns t r a i n so f c 5 7 b l 6 j 、d b a 2 、 b a l a ew e r e1 , 0 9 5 2 4a n d1 , r e s p e c t i v e l y a n dt h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t sa m o n g i n d i v i d u a l s f r o md i f f e r e n ts t r a i n sw e r e e x t r e m e l yl o w t h ea n a l y s i so fb i o c h e m i c a lm a r kd i dn o ti n d i c a t e i i 兰州大学硕士学位论文 a n y a l t e r a t i o ni na l ls t r a i n s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a td n a f i n g e r p r i n t i n gm a pw a s p o l y m o r p h i c i tc o u l d d e t e c td i f f e r e n ts o r t so f i n b r e dm i c e d i s t i n g u i s h a b l e o ri n d i s t i n g u i s h a b l e w i t hb i o c h e m i c a lm a r k e r a n a l y s i s t h es a m e r e s u l tw a so b t a i n e dw i t h r e p e a t i n gd e t e r m i n a t i o n o f o n e s a m p l eo fg e n o m e d n a c o n c l u s i o n ：i ti sh i i g h l ys t a b l ea n ds e n s i t i v et h a tg e n e t i cv a r i a t i o nm o n i t o r i n gb yd n a f i n g e r p r i n t i n ga n a l y s i su s i n gs y n t h e s i z e dn o n i s o t o p i e a l l yl a b e l e do l i g o n u c l e o f l d ep r o b e l h e g e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e ni n d i v i d u a la n ds n a i n sc o u l db ea l s od e t e c t e d a n di ti sap o w e r f u l m e t h o di nh e r e d i t y q u a l i t ym o n i t o r i n go f i a b r e dm o u s e s t r a i n s k e y w o r d s ：i n b r e d m i c e ；h e r e d i t yq u a i 时m o n i t o r y ；d n af i n g e r p r i n t i n g ；b i o c h e m i c a lm a r k 1 1 i 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导f 独立进行 研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成 果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰 州大学。本人完全了解兰少i 1 大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学 校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本 人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：鼻垒竺竺叁鸯师签名 日期：如订r t 孑 缈 兰州大学硕士学位论文 月u西 近交系小鼠是以连续2 0 代同胞兄妹交配的繁殖方式培育出的实验动物，具有等位 基因高度纯合、遗传背景单一、个体间差异小、对实验的反应性一致等特点，且每一个 近交品系都有各自独特的生物学特性，适于不同的研究需要，因此近交系小鼠越来越受 到广大生命科学工作者的重视。 近交系小鼠的遗传品质因素对科学实验研究数据准确性、可靠性有重要的影响，如 果在实验中使用了遗传性状发生改变了的近交系小鼠，不仅会导致实验失败，甚至得出 错误的结论，因此必须加强对近交系小鼠遗传质量的检测“。 长期以来，应用于近交系小鼠遗传质量检测的方法主要有：皮肤移植法、毛色基因 检测、下颌骨测量法及生化位点检测技术等。1 。皮肤移植法虽较简单，但周期长，准确 度差，且不能用于实验中的回顾性分析；毛色基因检测只能对少量与毛色有关的基因纯 合与否进行检测，不能反映近交系的遗传概貌，难以检出其它位点的突变，而下颌骨测 量法较为繁琐且易受主观因素影响，需要对多个个体的数据进行统计分析，对单个可疑 突变个体不易准确判断；免疫标志检测和生化位点检测都是用有限的基因表达产物一蛋 白质成份这种表型特征来推测近交系动物基因的纯合与否，生化位点由于方法简便且灵 敏度与形态特征相比相对较高，是目前最常用的近交系动物遗传质量检测方法，但由于 这些方法反映的遗传概貌有限，对可能影响实验结果的遗传变异，如生理功能、免疫反 应、药物反应等方面的变异不一定能检出，作为方法学有其局限性，因此研究和建立能 够反映更多遗传概貌，更加准确可靠的近交系小鼠遗传质量检测方法是非常必要的。随 着分子生物学技术的发展，人们就开始研究建立分子水平的近交系小鼠遗传质量检测方 法。已有研究表明，分子生物学方法比常规方法能更全面地反映近交系小鼠的遗传概貌 。”。二十世纪7 0 年代术出现的限制性内切酶和重组d n a 技术使人们对遗传标志的研究 转向d n a 分子本身。由于各种遗传信息都蕴藏在d n a 分子中，生物个体问的差异，就本 质而言是d n a 分子的差异，因此d n a 被认为是最可靠的遗传标志，某些d n a 序列的差异 可通过限制性酶切片断长度的改变来反映，此即限制性片断长度多态性( ( - e s t rj c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp 0 1 y m o r p h i s m s ，r f l p ) 其产生是由于点突变、d n a 重排( 组) 、插入 兰州大学硕士学位论文 或缺失引起的“”。随着对r f l p 研究的深入，人们发现了基因组中最有变异性的一类序 歹0 一高变异d n a 序列。1 9 8 0 年，w y m a n 和w h i t e 描述了第一个多等位性的具有高度多态 性的人类d n a 标志，不久在a 一球蛋白基因群中发现了其他3 个标志”1 。1 9 8 2 年，8 e l l 等”证实：这些高度多态性区域串联着重复的短序列单位，重复单位数日的差异导致了 这种高度的可变性，由于这些结构特征，人们称这些区域为小卫星( m j n is a t e l l i t e ) 或高度可变区域( h y p e r v a r i a b l e ) 或可变数目的串联重复( v a r i a b l en u m b e ro ft a n d e m r e p e a t s ) 。t 9 8 5 年j e f f r e y s 等“用肌红蛋白基因内含子中的串联重复序列( 重复单位 为3 3 b p ) 作探针，从人的基因文库中筛选出8 个含有串联重复序列的熏组克隆。序列分 析表明，这8 个小卫星重复单位的长度和序列不完全相同，但都有相同的核心序列( c o r e s e q u e n c e ) 。他们先后用两个多核心小卫星( p o l yc o r em i n i s a t e l l i t e ) 3 3 。6 和3 3 】5 探针进行s o u t h e r n 杂交，在低严谨条件下杂交得到了包含l o 多条带的杂交图谱，不同 个体杂交图谱上带的位置就像人的指纹一样千差万别，j e f f r e y 称之为d n a 指纹( d n a f i n g e r p r i n t ) 。“，它能同时检测到基因组d n a 上的多个位点，又有极丰富的多态性。 目前，用分子生物学方法进行近交系动物遗传检测的研究主要集中在限制性片断长 度多态性、随机扩增多态性d n a 技术、扩增片断长度多态性技术、d n a 芯片生物技术、 小卫星及微卫星d n a 标记技术等。 限制性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) 是 指不同的基因组序列中有相应特异性限制性核酸内切酶切割位点，经酶切、电泳就可以 显示出d n a 序列中与探针同源的酶切片断和长度多态性。该技术是由b o t s t e i n “”等首先 提出的第一个o n a 分子标记技术，研究得知，不同的限制性内切酶识别并切割基因组d n a 分子中的特定位点，一旦这些位点的碱基序列发生变化则不再被其相应的酶所识别，同 时非酶切位点也许由于碱基的变化丽产生出一个新的识别序列，这样不同的d n a 分子由 于酶切位点分布的不同而导致了基因型间限制性片断长度的差异“。因此只要选用的限 制性内切酶得当，用任何一个与某生物的d n a 具有同源性的d n a 片断作探针，都可能检 测到该生物体d n a 限制性酶切片断长度多态性。但究竟哪种探针有较好的多态性和稳定 性尚无定论。 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 技术是 j w i l lj a m s “”等和j w e l s h “”等研究小组提出的一项d n a 多态分析技术，建立，讶期，根 据引物不同将其分为两种，一种为w i l l i a m s 首先定名的随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 技 2 兰州大学硕士学位论文 术；另一种是w e l s h 建立的任意引物一p c r ( a r b i t r a r yp r i m e r p c r ，a p p c r ) ，两者除所 用引物不同外，并无本质区别。r a p d 多用于人工随机合成的9 - l o b p 的引物，而a p p c r 一般用长于2 0 b p “任意选取”的引物。r a p d 技术是阻p c r 为基础，以所研究的基凶组 d n a 为膜板进行p c r 扩增，若引物在膜板d n a 两条链上有互补结合位点，且引物结合位 点相距在一定长度内，就可扩增出d n a 片断。多个随机引物可使检测区域扩大到整个基 因组，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，e b ( 溴乙锭) 染色或放射自显影而检测多态性。这 些d n a 片断的多态性反映了基因组d n a 相应区域的多态性，其优点是操作相对简单，检 测样本d n a 的需要量低，可在被检对象遗传背景不清的情况下进行快速分析，理论上可 在无限多的基因位点中检测出遗传变异等“”。但是由于r a p d 的多态性是随机的，只是 一种遗传差异性的显性标记，不能用来鉴定杂合予，而且对实验条件非常敏感，不同j 家的试剂，不同实验室所检测到的指纹图带型可能出现较大的差别，实验结果的重复性 和可靠性较差“”1 。 扩增片断长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a f l p ) 技术是 以与可变数串联重复序列( v a r i a b l en u m b e rt a n d e mr e p e a t s ，v n t r ) 侧翼序列互补的 寡核苷酸链为引物，扩增出模板d n a 中核心序列为高度重复序列的d n a 片断。它是1 9 9 2 年z a b e a u 等“”创建的一种选择性扩增限制性片断的d n a 分析方法。由于高度可变重复 序列( 包括微卫星与小卫星，2 - 6 b p 为重复单元经1 0 5 0 次拷贝串联重复的微卫星 ( m i c r o s a t e l l i t e ) ，由较大的蘑复单元构成的为小卫星( m i n i s a t e l l i t e ) ) 具有高度 多态性和杂合性，提供的多态信息含量商“”圳，能够检出d n a 样品简单细微差别。但该 方法检测的是单个位点的等位基因，在近交系的遗传检测中其缺点是需作多个位点，即 多次p c r 扩增才能鉴别出不同品系近交系动物，而且只有在对检测位点侧翼序列的一级 结构十分清楚的条件f 才能进行检测。如果近交系动物发生突变的位点不在所检测的重 复序列中，则无法区分出突变的动物。 d n a 芯片生物技术是一种以杂交测序基本理论为基础的新型生物技术，它的产生背 景是人类基因组序列日益明朗，迫切需要一种高效、准确的遗传分析系统来确定各个基 因的功能，人类第一块d n a 芯片诞生于1 9 9 6 年。d n a 芯片是根据待测的基因片断，确定 可以预知杂交的探针序列，将大量已知的探针固定支持物上，根据探针来源，d n a 芯片 有两种：一科l 是采用显微光蚀刻技术或压电打印技术在芯片特定位置原位合成寡核瞽酸 探针的芯片，另种是将克隆基因或p c r 扩增产物作为探针显微打印到芯片上的微集芯 兰州大学硕士学位论文 片。d n a 芯片技术一般先提取基因组( d n a 或r n a ) ，然后用固相p c r 系统对靶序列进彳亍 高效、特异的扩增，最后将扩增产物用荧光( 或生物索、同位素) 进行标记。靶基因准 备好以后，让它与d n a 芯片上探针序列进行杂交，这一操作在d n a 芯片自动孵育装置中 进行，由其自动控制时间、温度及反映缓冲液配比。一般进行基因表达检测实验室要求 低温、时间长、盐浓度较高，用于突变检测实验室要求高温、时间长、赫浓度低，这一 过程数十秒完成o ”，杂交完毕，漂洗掉未杂交分予，然后在激光共聚焦荧光扫描显微镜 下对d n aj 笛片表面的每个位点进行检测。d n a 芯片一般用于测序、基因表达、疾病诊断， 也可以用于基因型及多态性检测。基因芯片单核苷酸多态性( s n p ) 标记物定位试验， 可以检测单个碱基的变异，确定基因多态性，获得指纹图谱，用于连锁分析啪1 。d n a 芯 片技术作为一种新兴的生物技术，其高效高速性将给生命科学带来深远影响，但由于其 尚处于发展阶段。因此其造价、探针的密度与纯度还有待完善。 小卫星和微卫星指纹技术是近年来发展起来的一种多态性遗传标记技术。w y m a n 等 ”认为在人体基因组中含有高交区( h y p e rv a r i a b l er e g i o n s h v r s ) ，并证明这些高变 区是一些串联重复序列，j e f f r e y s 等汹1 发现重复序列中重复单位的核心序列是相似的。 串联重复序列由两种类型组成，即小卫星d n a 和微卫星d n a 。小卫星d n a 是一些重复单 位在1 卜6 0 b p ，重复次数在成百以上，总长度由几百至几千个碱基组成的串联重复序列， 主要分布与染色体近端粒区和着丝粒区，而微卫星是以卜6 b p 的段核苷酸序列为核心单 位，长度小于l o o b p 的小片断，它广泛随机地分布于真核生物基因组中，在d n a 序列中， 平均每6 b p 就可能出现一个。w i n t e r 等。“报道，除着丝粒和端粒区域外，微卫星几乎广 泛地分布于染色体所有区域，在哺乳动物中，几乎每个基因都存在一个微卫星标i 己。小 卫星与微卫星均遵循孟德尔共显性遗传方式。微卫星标记按其核心序列碱基数可分为 单、二、三、四、五、六核菅酸微卫星，其中( a c t g ) n 型微卫星最多，人类基因组 d n a 中，平均每3 0 k b 就可能出现( a c ) n ，绵羊平均6 5 k b 。“。w e b e r 等。3 3 根据微卫星自 身结构又将微卫星分为完全、不完全、复合微卫星，完全微卫星由不中断的重复单位串 联而成，不完全微卫星是指重复单位间有3 个以下的非重复碱基间隔，且两间隔问重复 单位连续重复数不低于3 ，复合微卫星由几类串联重复单位构成，中间有3 个以下碱基 问隔，且两间隔间重复单位连续重复数不低于5 。 关于小卫星和微卫星的产生，多数学者认为是d n a 复制或修复时，滑动链与互补链 碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失，因而在不同个体或不同种群间产生 兰州大学硕士学位论文 长度多态性1 。小卫星d n a 一般与r f l p 技术结合以获得小卫星d n a 指纹图谱，即用小 卫星d n a 作探针进行s o u t h e r n 杂交，与r f l p 相比，一个小卫星探针一次能检测到1 0 - 2 0 个高度多态的位点，已在人、动物、植物中鉴定出了许多小卫星序列，是非常有用的遗 传识别和亲缘关系鉴别的标记物，已广泛应用于群体遗传学”畜禽遗传育种分析1 “、 细胞系鉴别“”及法医个体识别m 1 等许多方面。但小卫星d n a 指纹的缺点限制了它的应用， 一方面，它在染色体上分布不均匀，不利于连锁分析，再就是小卫星探针比较长，难以 获取，而且数量有限。微卫星d n a 既可用来作探针获得指纹图谱，也可咀通过p c r 方法 进行微卫星位点多态性分析。a 1 i 等o “”人工合成简单重复序列( g a t a ) 。，( g a c a ) 。 等作为探针，与人的基因组酶切片段进行s o u t h e r n 杂交，获得了具有个体特异性的d n a 指纹图谱，龚炎长用( t g ) 。探针分析了六个猪品种的遗传变异关系，在羊的研究方面， 用作微卫星的探针有( g t ) ；、( c a e a ) ；等。研究发现微卫星由侧翼序列将核心序列特异 地定位于染色体，该侧翼序列在物种问具有较高的同源性，因此，可以根据微卫星两端 的侧翼序列设计引物，进行p e r 扩增以获得微卫星d n a 指纹图谱。由于微卫星核心序列 分布于结构基因侧翼或内含子中，因此，它承受的选择压力较小，在物种进化过程中积 累了丰富的变异，从而决定了微卫星的多态性较高，加上该技术稳定可靠，操作程序相 对简化，因此被认为是一种很有应用价值的遗传标记技术。 d n a 指纹技术一般通过下列流程图来完成： 采集样品( 血液、体液或组织) 0 提取基因组d n a 0 用限制性内切酶消化基因组d n a 通过琼脂糖凝胶电泳将不同大小的d n a 片断分开 + 将凝胶中的d n a 片断转移并固定在硝酸纤维膜或尼龙膜上 标记特定的d n a 指纹探针并与固定在膜上的d n a 片断杂交 染色或放射自显影 士 d n a 图谱分析 兰州大学硕士学位论文 d n a 指纹技术最初仅用于一些基础性的遗传分析“，如亲子鉴定、个体识别等， 现在d n a 指纹技术己成为重要的应用广泛的分子标记技术鼢8 1 。由于d n a 指纹技术能确 切的检测出实验动物的遗传变化，结果可信度强，判定直观，稳定性好，特异性高，而 且简单、易于操作，这一技术已被应用于近交系小鼠的遗传质量检测。 从目前的研究来看，在近交系小鼠d n a 指纹图检测中应用最多的微卫星探针是人源 3 3 6 、3 3 1 5 、寡核苷酸探针及其它探针等。究竟哪种探针能在不同品系的近交系小鼠 的d n a 指纹图中杂交出更多的图带，表现出其多态性，或从不同品系的近交系小鼠本身 的基因组中分离筛选出更合适的探针仍需进一步的探讨和研究。筛选合适的探引，建立 各种各类不同近交系实验动物d n a 指纹标准图谱是值得研究的课题。随着分子生物学技 术的不断发展，d n a 指纹图分析技术将为不同来源和不同复杂度基因组的分析提供一个 有力的工具，其高效可靠的特点将使它在基因组研究中有广阔的应用前景。 综上分析可知，微卫星d n a 指纹技术是应用于近交系小鼠遗传质量检测最有发展前 途的的方法。因此我们用人工合成的生物素标记寡核苷酸探针( g g a t ) ，对按遗传检测 规范抽取的小鼠个体的d n a 指纹图谱进行了分析，并与作为国家标准的生化位点检测方 法进行了比较，以期建立特异、精确、稳定的近交系小鼠遗传检测方法。 6 兰州大学硕士学位论文 材料与方法 1 标本采集和样品制备 1 1 实验动物 d b a 1 近交系小鼠：购自上海研究所动物室； c 5 7 b l 6 j 、b a l a c 、d b a 2 近交系小鼠：购自兰州大学实验动物中心； d b a 2 x d b a 1 f 1 ：本实验室繁殖： 所有动物不做性别和年龄要求，脱颈椎处死后，采集肝组织备用。 l 。2 主要试刹与仪器 生物素标记的( g g a t ) 4 探针购自宝生公司，h 醒i i i 酶为基因公司产品，碱性磷酸标 记的链亲和素、带正电荷的尼龙膜为宝信生物公司产品，生化位点试剂盒购自中国药品 生物制品检定所。d y y i i i - 1 2 b 型三恒多用电泳仪，4 0 0 0 型凝胶成像定量分析系统。 1 3 基因组d n a 的提取 选c ”b l 6 j 、b a l a c 、d b a 1 、d b a 2 及d b a 2 x d b a i f i 代动物，脱颈椎处死后 分别取肝组织5 0 m g 加入蒸馏水预冷的匀浆器中。匀浆时加入5 0 0 m l s e 缓冲液( 0 15 m o l l 氯化钠，0 1 m o l l7 , - - 胺四乙酸( e d t a ) ，p h8 0 ) ，其中含5 0 1 1 l1 0 。二烷基硫酸钠 ( s d s ) 和5 灿蛋白酶k ( 2 0 m g m 1 ) 。匀浆后在5 0 。c 消化3 5 小时或3 7 。c 孵育过夜。孵 育完成后，与冰上冷却，反应混合物用5 0 0 u l 饱和酚抽提，离心1 0 分钟，吸取上层水 相，用5 0 0 此酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提，4 c 下1 5 0 0 0 r m 离心1 0 分钟，吸取上 层水相，重复酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提一次，再用5 0 c i u l 氯仿抽提一次。同上 离心居吸取上层水相，加入2 5 倍体积的预冷无水乙醇。轻轻混匀后，4 下1 5 0 0 0 r m 离心1 0 分钟后，倒出液相，用8 0 乙醇洗涤三次，室温挥发除去d n a 沉淀中的乙醇。用 适量蒸馏水或t e ( 5 0 m m o l lt r i s c l ，l o m m o l le d t a ) 缓冲液溶解，冷冻保存。 1 4 血浆 用抗凝毛细管进行眼眶采血，3 5 0 0 r m i n ，离心5 m i n ，分离血浆和血球，吸储血浆放入 l m l 小试管中备用。 1 5 溶血素 在取出血浆的红细胞内加入蒸馏水( 1 ：4 v v ) ，震荡l m i n ，成为红色透明液体，即为 7 兰州大学硕士学位论文 溶血索。放入小试管中备用。 1 6 组织匀浆上清液 用颈椎脱臼法处死动物，剖腹，取肾脏1 只，肝脏l 叶。分别加入适量预冷蒸馏水， 蒸馏水与组织的比例一般为2 ：1 ( v w ) 。分别用组织匀浆器匀浆。匀浆液置低温高速离 心机中，以1 6 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i n 。用吸管吸取上清液存入小试管中备用。所有制备的 样品都要在低温冰箱中保存，保存期不得超过一个月，要尽量使用新鲜样品。 2s o u t h e r n 杂交 2 1 酶切酶切采用2 0 曲反应体系，含h a e i i i 酶3 0 u ，3 7 。c 酶切3 5 小时。 2 2 电泳酶切结束后加入1 1 0 体积的醋酸钠( 3 0 m o l l ，p h5 2 ) 和2 5 倍体积的无水 乙醇，低温保存3 0 分钟后，4 c 1 5 0 0 0 r m 离心1 0 分钟；弃上清，8 0 乙醇洗两遍。d n a 沉淀干燥后溶于l o 儿蒸馏水，加入l o 加样缓冲液到o 8 琼脂糖凝胶上，在1 t a e 缓冲液( 5 0 m m o l lr i d s 醋酸2 m m o l le d t a ) 巾1 v c m 电压电泳8 小时，以九噬菌 体的h i n d i i i 消化物为分子量标准。电泳结束后将凝胶在o 5 u g m l 溴乙锭( e b ) 中染色 2 0 分钟，在紫外灯下观察，记录。 2 3 转膜电泳后的凝胶在o 2 5 m o l lh c l 中脱嘌呤7 分钟，在变性液( o 5 m o u ln a o h ， 1 5 m o l l n a c l ) 中变性3 0 分钟，再在中和液( 3 m o l l n a c l ，0 5 m o l l t r i s c i ，p h7 4 ) 中中和3 0 分钟。然后在2 0 s s c ( 3 m o l l n a c i ，o _ 3m o l l 柠檬酸三钠，p h7 o ) 缓冲 液中用虹吸法转印到尼龙膜上。转膜结束后将尼龙膜在2 s s c 中漂洗一边后用滤纸吸 干，在8 0 烘烤2 小时或在2 5 7 n m 紫外灯下照3 分钟，将d n a 固定在尼龙膜上。 2 4 杂交将尼龙膜装入杂交袋中，加入预杂交液( 5 s s c ，i s d s ，p h 7 0 ，0 ，5 牛血清白 蛋( b s a ) ) ，4 3 。c 水浴预杂交1 0 m i n 。然后在同样温度、同样缓冲液中，加入适量生物 素标记的( g g a t ) 4 探针杂交4 5 r a i n 。杂交后尼龙膜在洗膜液( 1 s s c ，0 1 s d s ，p h7 0 ，) 中3 8 。c 温和搅拌洗膜1 0 分钟，然后在1x s s c 中室温下温和搅拌洗膜1 0 分钟。将尼龙 膜放入一新的杂交袋中，加入3 0 m g m lb s a ，室温封闭1 5 m i n 。倒出封闭液，加入5 m l 含i u g m l 链亲和素一碱性磷酸酶标记偶联物( s a a p ) 的3 b s a ，室温孵育1 3 m i n 。 弃去上述反应液，用洗膜缓冲液( 5 0 m m o l l i r i s c l ( p h7 4 ) ，2 0 0 m m o l ln a c i ，6 t w e e n - 2 0 ) 洗三次，每次5 m i n ，然后将尼龙膜装入另一新的杂交袋中，加入1 0 m l 氮兰 四唑( n b t ) 5 一澳一4 一氯3 吲哚一磷( b i c p ) 酸底物工作液( o 1 m o l l n a c l ，o 1m o l l t r i s c 1 ( p h9 5 ) ，5 0 m m o l lm g c l 2 ，7 5 u g m ln b t ，3 3 0 u g m lb c i p ) ，室温下避光显色1 5 r a i n 至2 h ，显色适度后水冲终止反应。 8 兰州大学硕士学位论文 2 5 统计分析所制作的d n a 指纹图带通过凝胶分析系统a a b 软件进行分析。 3 生化位点检测 将乙酸纤维膜轻轻浸入相应的电泳缓冲液中，浸入时应避免膜上出现气泡。将浸透 的膜取出用滤纸吸千，乙酸纤维膜面朝上平放在点样板上，以点样器取预制在样品槽内 的编号样品，在膜上点样，一次点样量为0 3 l ，为增加膜上的样品量，可重复点样， 但不能超过三次( o 9 p , l ) 。点好样的膜放在电泳槽纸桥上盖上电泳槽，按各位点所需 条件电泳。 3 1 酪酶1 ( e s t e r a s e 1e s l ) 3 1 1 样品：血清 3 1 2 试剂： 3 1 2 1 缓冲液：磷酸缓冲液( p h 7 o ) 0 5 m o l l n a 2 h p 0 4 6 1 m l 0 5 m o l l k h 2 p o d 3 9 m l 蒸馏水加至1 0 0 0 m l 3 1 2 2 染色液： 2 b 乙酸萘酯丙酮溶液 o 5 m l f a s tb l u er rs a l t5 0 m l 0 0 5 m 磷酸缓冲液p h 7 09 5 m l 过滤后使用 2 琼脂( 热)3 m l 3 1 3 电泳条件：电压1 4 0 v , 时间3 0 m i n 。移动方向：由负极到正极。 3 1 4 染色方法：将显色液新鲜混合，加入2 热( 4 0 5 0 ( 2 ) 琼脂，迅速混匀，均匀倒置 在6 x 8 的玻璃板上，制成酶显色板。电泳结束后取出膜，将点样面贴在酶显色板上。 将膜与酶显色板问的气泡排尽，将带膜显色板移至3 7 c 温箱保温，直至酶区带清晰显现， 取出已显色的膜浸入7 的冰醋酸漂洗液中，中止反应。 3 2 转铁蛋白( t r a n s f e r r i n1 h ) 3 2 i 样品：血清 3 2 2 试剂： 3 2 2 1 缓冲液：t r i s g l y c i n e ( p h 8 5 ) t r i s 3 0 0 9 9 兰州大学硕士学位论文 o l y e i n 蒸馏水 3 2 2 2 染色液： 丽春红s 三氯乙酸 磺基水杨酸 蒸馏水 3 2 3 电泳条件： 3 2 4 染色方法： 1 4 4 0 9 1 0 0 0 m l 0 4 0 9 6 0 0 9 6 0 0 9 2 0 0 m l 电压2 0 0 v , 时间4 0 r a i n 。移动方向：由负极至正极 电泳后将膜浸入丽春红s 染色液中，酶区带清晰显现后取出，在7 醋酸漂沈液中 漂洗两次。 3 3 血红蚤白一b 链( h e m o g l o b i np - c h a i nh b b ) c h r 7 3 3 1 样晶：溶血素内加入t 4 体积的烷化剂，0 1 3 血 3 3 2 试剂： 3 3 2 1 缓冲液： i r i s - g l y c i n e ( p h 8 5 ) t r i s 3 0 0 9 g l y c i n 14 4 0 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 3 。3 2 2 染色液： 丽春红- s 0 4 0 9 三氯乙酸 6 o o g 磺基水杨酸 6 0 0 9 蒸馏水2 0 0 r a l 3 3 3 电泳条件：电压2 4 0 v ，时间4 0 m i n 。移动方向：由正极到负极。 3 。3 。4 染色方法： 电泳后将膜浸入丽春红一s 染色液中，酶区带显示清晰后取出，在7 乙酸漂洗液中 漂洗两次。 3 4 葡萄糖磷酸异构酶一1 ( 醇u e o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s e - 1 ，g p i l ) c h r 7 3 4 1 样品：溶血素，o 3 1 a l 。 1 0 兰州大学硕士学位论文 3 。4 2 试剂： 3 4 2 1 缓冲液：t r i s - g l y c i n e ( p h8 5 ) t r i s 3 0 0 9 g l y c i n e 1 4 。4 0 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 3 4 2 2 显色液： 0 2 m o l lt r i s h c l ( p h 8 ，o 、2 m l 0 2 5 m o l lm g ( c 2 h 2 0 2 ) 215 0 u l 1 0 果糖一6 一磷酸 l5 0 乩 1 m t t1 5 0 u l 1 t p n 1 5 0 1 x l 0 2 5 p m s15 0 l 葡萄糖6 。磷酸脱氢酶 5 i u 2 琼脂( 热)3 m l 3 4 3 电泳条件：电压2 0 0 v , 时间3 0 m i n 。移动方向：由正极至负极。 3 , 4 。4 染色方法： 将显色液新鲜混合，加入2 热( 4 0 5 0 ) 琼脂，迅速混匀，均匀倒最在6 * s e m 的玻璃板上，制成酶显色板。电泳结束后取出膜，将点样面贴在酶显色板上。将膜与酶 显色板间的气泡排尽，将带膜显色板移至3 7 温箱保温，赢至酶区带清晰显现，取出已 显色的膜浸入7 的醋酸漂洗液中，终止反应。 3 5 碳酸酐酶- 2 ( c a r b o n i ca n h y d r a s e 一2c a r 2 ) 3 5 1 样品：溶血素 3 5 2 试剂： 3 5 2 1 缓冲液：n a c 2 h 3 0 z - e d t a ( p h 5 钔 n a c 2 h 3 0 2 17 0 1 g e d t a 2 4 8 9 蒸馏水加至! 0 0 0 m l 3 5 2 2 染色液： 丽春红一s 0 4 0 9 兰州大学硕士学位论文 三氯乙酸 6 ，o o g 磺基水杨酸 6 0 0 9 蒸馏水2 0 0 m l 3 5 3 电泳条件：电压2 4 0 v ，时间4 0 m i n 。移动方向：由难极到负极。 3 5 4 染色方法： 电泳后将膜浸入丽春红一s 染色液中，酶区带显示清晰后取出，在7 乙酸漂洗液中漂 洗两次。 3 6 碱性磷酸酶- 1 ( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e - 1a k p l ) 3 6 1 样品：肾匀浆 3 6 2 试剂： 3 6 2 1 缓冲液： i r i s c i t r a t e ( p h ：8 3 ) t r i s 1 6 6 4 9 c i t r a t ea c i d 4 2 0 9 蒸馏水加至1 0 0 0 m l 3 6 2 2 染色液： o 2 m o l i ，t r i s h c l ( p h ：8 o 、 2 m l 1 3 - n a p h t h y la c i dp h o s p h a t e 10 m g 坚固蓝r r 盐 1 0 m g 0 ：2 m o l l m n c l 20 i m l 3 6 3 电泳条件：电压2 0 0 v , 时间3 0 m i n 。移动方向：由负极至正极。 3 6 4 染色方法： 将显色液新鲜混合，加2 热( 4 0 5 0 。c ) 琼脂等量，迅速混匀，均匀倒置在6 8 c m 的玻璃板上，制成酶显色板。电泳结束后取出膜，将点样面贴在酶显色板上。将膜与酶 显色板间的气泡排尽，将带膜显色板移至3 7 c 温箱保温，直至酶区带清晰显现，取出已 显色的膜浸入7 的醋酸漂洗液中，终止反应。 3 7 磷酸葡萄糖转位酶- 1 ( p h o s p h o g l c o m u l a s e - 1p g m l ) 3 7 。1 样品：肾匀浆 3 7 2 试剂： 3 7 2 1 缓冲液：t