（化学工艺专业论文）双底物诱导脂肪酶构象刻录的催化及吸附性能研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本文以脂肪酶为研究对象，结合分子印迹和生物印迹两种技术制备双底物刻 录脂肪酶。在制备过程中利用底物诱导酶构象，然后利用高交联度聚合物对该构 象进行刻录，最终制备出的刻录酶构象是刚性化的。本文重点研究了双底物刻录 酶在水相和有机相中的催化活性、稳定性以及有机相中吸附配体能力，并考察了 影响吸附能力的一些因素。 本文采用四种不同的功能单体( 聚乙二醇2 0 0 ( 4 0 0 ) 二( 甲基) 丙烯酸酯) 和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为聚合原料，并加入底物月桂酸和正丁醇对脂肪 酶进行活性构象诱导，再经紫外光引发聚合、抽提和干燥后，获得了四种刻录脂 肪酶聚合物。其中，选用石油醚作为抽提溶剂，单体和交联剂的质量比为2 ：1 ， 紫外光照聚合时间为4 5 s 。 本文对制备得到的双底物刻录酶进行水相和有机相中催化活性的测定。四种 双底物刻录脂肪酶在水相催化中表现出较高的活性和稳定性，其中双底物刻录酶 聚合物d a 具有最高水相催化活性( 3 7 1 0 g ) ，而且还发现含有甲基的单体聚合 时容易增大刻录脂肪酶聚合物的空间位阻，从而增大了反应时的传质阻力，造成 其催化活性比不含甲基的单体为原料聚合成的双底物刻录脂肪酶的催化活性低 ( b a a a ，d a c a ) 。四种双底物刻录脂肪酶在p h = 7 5 和温度5 0 c 6 0 时均表 现出它们各自的最大催化活性，而且在强酸、强碱和高温环境下也可保持较高的 催化活性；同样用沉淀变性剂和溶解变性剂分别浸泡2 0 d 后，它们的活性仍都保 持在初始活性的5 0 以上。这表明双底物刻录脂肪酶聚合物在有变性剂存在的环 境中也能保持较高的催化效率。有机相催化以选用月桂酸和正丁醇的正庚烷酯化 反应体系，随着温度的升高，平衡催化转化率也随之提高，同时催化活性也逐步 提高。但温度越高，平衡催化转化率和催化活性上升幅度越来越小。反应2 4 h 后，在6 0 c 时，有机相双底物刻录酶聚合物d a 的催化活性达到最大值( 2 0 9 2 u g ) 。 本文还对双底物刻录酶d a 的吸附能力做了考察。发现d a 对配体月桂酸和 正丁醇显示出了一定的吸附能力，其中还对温度、溶剂、双底物刻录酶聚合物 浙江大学硕士学位论文 d a 中的含水量以及d a 的催化活性等因素对d a 吸附性能的影响作了考察。结果 发现升温有利于双底物刻录酶d a 对配体吸附能力的上升，在5 0 下它的平衡吸 附量为3 7 5 5 ( m g 百1 ) ，但随着温度的进一步上升，吸附量增加不明显，甚至出现 吸附量下降的情况；溶剂是通过对聚合物和配体的分子作用来影响两者之间的选 择性和亲和力的；双底物刻录酶聚合物d a 中含水量的增加导致其吸附能力大大 减小；失活的双底物刻录酶聚合物d a 对配体的吸附能力明显下降：此外，双底 物刻录酶聚合物上的空穴对配体来说并不是特定对应的，许多其它酸、醇类似物 也能吸附到双底物刻录酶聚合物上。 关键词：脂肪酶；生物印迹；分子印迹；构象刻录；催化活性；吸附 l i 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ea r t i c l ei ss t u d i e di n l i p a s ea n du s et w on e wt e c h n i q u e b i o i m p r i n t i n g t e c h n i q u ea n dm o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u et op r e p a r et h ed o u b l es u b s t r a t e s r e c o r d e dl i p a s e ，l i p a s ec o n f o r m a t i o nc a nb ei n d u c e db ys u b s t r a t et ob ea na c t i v a t e d o n ei np r e p a r a t i o np r o c e s s t h e nt h ea c t i v a t e dc o n f o r m a t i o nw a sr e c o r d e du s i n gh i g h c r o s sl i n k i n gd e g r e ep o l y m e r a n dt h ef i n a le n z y m ec o n f o r m a t i o ni sr i g i d t h ed o u b l e s u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s e sc a t a l y t i cc h a r a c t e r i s t i ci nw a t e ra n do r g a n i cs o l v e n t ，a n d i t sa d s o r p t i o nc a p a c i t yw e r ei n v e s t i g a t e d t h ed i s s e r t a t i o n e m p h a s i z e so ne x p l o r i n gt h ep r o c e s so fd o u b l es u b s t r a t e s r e c o r d e dl i p a s ep r e p a r a t i o n l i p a s e ，l a u r i ea c i da n dn - b u t y la l c o h o lw e r ea d d e di n t oa c o p o l y m e rs y s t e m ，w h i c hc o n t a i n e df o u rd i f f e r e n t1 6 n d so ff u n c t i o nm o n o m e ra n d t r i m e t h y l o l p r o p a n et r i m e t h a c r y l a t e t h ep o l y m e r i z a t i o nw a so b t a i n e db yu l t r a v i o l e t i r r a d i a t i o na n dl a u r i ea c i d ，n b u t y la l c o h o lw e r ee x t r a c t e db yp e t r o l e u me t h e nt h e f u n c t i o nm o n o m e ra n dc r o s s l i n k e da g e n tw e r em i x e db yt h es c a l eo f2 ：l ( m a s ss c a l e ) a n di r r a d i a t i o nt i m ew a s4 5 s t h ed i s s e r t a t i o ns t u d i e dt h ec a t a l y t i cc h a r a c t e r i z a t i o no fd o u b l es u b s t r a t e s r e c o r d e dl i p a s e si nw a t e ra n do r g a n i cs o l v e n t t h ef o u rd o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e d l i p a s e sp r e s e n t ss o m ec a t a l y t i ca c t i v i t ya n ds t a b i l i t y t h eb e s tc a t a l y t i ca c t i v i t yw a s a t t a i n e db yd o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s ed ai nw a t e r ( 3 7 1 u g ) a n dt h er e s u l t s s h o w nt h a tt h em o n o m e rc o n t a i n i n gm e t h y lc o u l de a s i l yi n c r e a s es t e r i ch i n d r a n c eo f r e c o r d e dl i p a s ed a ，w h i c hw i l li n c r e a s et h em a s s t r a n s f e rb a r r i e r sl e a dt ot h ed e c r e a s e o ft h ec a t a l y t i ca c t i v i t y ( b a a a ，d a c a ) t h ef o u rd o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s e s p r e s e n tt h e i rt h eb e s tc a t a l y t i ca c t i v i t ya tp h - - 7 5a n da t5 0 c 6 0 c m o r e o v e r , t h e y w e r ea b l et or e t a i nh i g h e rc a t a l y t i c a c t i v i t y u n d e rt h ec i r c u m s t a n c e o fs t r o n g a c i d ( p h = 2 4 0 ) 、s t r o n ga l k a l i n e ( p h = 1 2 0 0 ) a n dh i g l lt e m p e r a t u r e ，r e s p e c t i v e l y a n d a f t e ri m m e r s i n gt h ed o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s e si n t op r e c i p i t a t i o nd e n a t u r a n t s f o r2 0d a y s ，t h ef o u rd o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s e sw e r ea b l et or e t a i na tl e a s t5 0 1 1 1 塑垩查兰堡主兰垡堡塞 o ft h e i ri n i t i a la c t i v i t i e s i ti l l u m i n a t e st h ef o u rd o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s e s c a nb ea l s ok e e ph i g h o rc a t a l y t i ca c t i v i t yi np r e c i p i t a t i o nd e n a t u r a n t s t h ea c t i v i t yi n o r g a n i cs o l v e n t ( h e p t a n e ) w a sm e a s u r e db ye s t e r i f i c a t i o no fl a u r i ca c i da n dn 。b u t y l a l c o h 0 1 w h e nr i s i n gt h et e m p e r a t u r e ，t h ea c t i v i t ya n dy i e l da l ea l s or i s i n g a f t e r c a t a l y z i n g2 4 h ，d a sb e s tc a t a l y t i ca c t i v i t y ( 2 0 9 2u g ) w a sa t t a i n e da t6 0 ci no r g a n i c s o l v e n t t h ed i s s e r t a t i o ni sa l s os t u d i e dt h ea d s o r p t i v ea b i l i t yo ft h ed o u b l es u b s t r a t e s r e c o r d e dl i p a s ed a i th a sf o u n dt h ed ah a ss o m ea d s o r p t i v ea b i l i t yt ol a u r i ca c i da n d n - b u t y la l c o h 0 1 t h ei n f l u e n c ef a c t o r si n c l u d i n gt e m p e r a t u r e ，s o l v e n t ，d a sc a t a l y t i c a c t i v i t yi ss t u d i e d w h e nr i s i n gt h et e m p e r a t u r e ，t h ea d s o r p t i o ni s a l s or i s i n g i t s e q u i l i b r i u ma d s o r p t i o na m o u n tw a s3 7 5 5 ( r a g 昏1 ) a t5 0 c t h es o l v e n ti m p a c td a s a d s o r p t i v ea b i l i t yt h r o u g hi n f l u e n c et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ep o l y m e ra n dl i g a n d t h en o n - a c t i v i t yd a sa d s o r p t i v ea l , i u t yd r o p ss i g n i f i c a n t l y m o r e o v e r , t h ec a v i t i e s c r e a t e di nt h ed o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s eb yl a u r i ea c i da n dn b u t y la l c o h o l d u r i n gi m p r i n g t i n ga l en o tu n i q u ef o rt h e s el i g a n d ad o z e n o fl a u r i ea c i da n dn b u t y l a l c o h o la n a l o g sc a nb i n dt ot h ed o u b l es u b s t r a t e sr e c o r d e dl i p a s e ， k e yw o r d s ：l i p a s e ；b i o i m p r i n g t i n g ；m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ；c o n f o r m a t i o nr e c o r d ； c a t a l y t i ca c t i v i t y ；a d s o r p t i o n 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 生物催化与脂肪酶活性中心结构 生物催化是指利用酶或有机体作为生物催化剂实现化学转化的过程。与化学 合成相比，生物催化具有如下优势：第一，在常温、常压下反应，反应条件温和； 第二，反应速度快，反应转化率高；第三，催化反应特异性强，副产物少；第四， 生物催化的产品品质高，可以避免化学催化产生对人类及其生存环境有害的物 质。因此，生物催化被看成是化学工业发展的重要方向之一。 脂肪酶( i j p a s e ，e c3 1 1 3 甘油三酰酯水解酶) 是一类特殊的酰基水解酶。 作为目前被重点研究的生物催化剂，它被广泛用于催化酯水解和醇解、酯合成、 酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应中。 脂肪酶也是一种重要的工业酶类，应用极为广泛，主要集中在食品工业、医 药和化妆品、洗涤剂工业、手性化合物制备、油脂水解、皮革生产、纸浆和造纸 上【l 】o 来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成不同，氨基酸的排列顺序也可能有很大的 差别，其分子量大都在2 9 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 0 道尔顿之间，但由于生物的同源性和进化 过程的保守性，其活性中心具有相同或相似的结构 2 l 。迄今为止，人们已经从自 然界中分离纯化了多种脂肪酶。通过氨基酸分析、基因克隆和表达，确定了酶的 氮基酸组成、等电点等物理参数。利用x 衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶 的晶体结构和催化活性中心的三元组( t r i a d ) 及氧负离子洞( o x y a n i o nh o l e ) 的氨 基酸构成和位置1 3 4 1 。 多数脂肪酶活性中心是由丝氨酸( s e 0 、天冬氨酸( a s p ) 、组氨酸( h i s ) 组成的 三元组，只有o c l ( g e o t r i c h u mc a n d i u ml i p a s e ) 和c c l ( c a n d i d ac y l i n d r a c e a l i p a s e ) 等少数脂肪酶例外，它们活性中心是由丝氨酸( s e t ) 、谷氨酸( g l u ) 和组氨 酸( h i s ) 组成，表1 1 列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数。构成脂肪酶活性 中心的三元组之间，丝氨酸通过氢键与组氨酸相连，天冬氨酸或谷氨酸也通过羟 基形成氢键与组氨酸相连。在反应过程中，三者通过与底物形成四面体中间复合 物完成催化过程1 5 】，如图1 1 所示。 浙江大学硕士学位论文 表1 1 几种脂肪酶的结构特征参数 t a b1 1s o m ek i n d so fl i p a s ea n di t sc a t a l y t i ct r i a d s 注：c c l ( c a n d i d ac y l i n d r a e e al i p a s e ) ；g c l ( g e o t r i c h u mc a n d i d u ml i p a s e ) ；r m l ( r h i z o m u c o r m i e h e il i p a s e ) ；h p l ( h u m a np a n c r e a t i cl i p a s e ) 。 h - - o 、? 3 0 图1 1 脂肪酶催化甘三酯水解过程中形成的四面体中间态 f i g1 1t h et r i g l y c e r i d et e t r a h e d r a li n t e r m e d i a t es t a t ed u r i n gt h eh y d r o l y s i sb y t h el i p a s e 脂肪酶活性中心结构的另一个特征是，它的活性位点上有一个由疏水作用和 静电作用所稳定的a 螺旋片断组成的“盖子【1 0 t 1 1 l ，这一“盖子”使得酶的活性 中心与分子表面隔开，形成由暴露憎水基包围的、由亲水基组成的脂肪酶亲电区 ( 氧负离子洞) 。这种结构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以及 活性中间体的稳定。侧链基团的化学修饰和固定化对脂肪酶催化活性的改变与 “a 螺旋盖”的重新定向排列不无关系【1 2 】。在底物( 如酸、酵或酯等) 的存在的 情况下，酶的构象发生变化，“盖子”就被打开，含活性部位的疏水基团就暴露 l酶 浙江大学硕士学位论文 出来，这样就易于与底物结合了。其原因在于，“盖子”中a 一螺旋的双亲性会影 响脂肪酶和底物在油水界面的结合能力，其双亲性的减弱将导致脂肪酶活性的 降低，“盖子”的外表面相对亲水，而其面向催化部位的内表面则相对疏水，由于 脂肪酶和油水界面的缔合作用，使盖子张开，活性部位得到暴露，这使得底物 和脂肪酶的结合能力增强，此时底物就容易进入疏水性的通道而与活性部位结 合，形成酶一底物复合物。 1 2 非水相酶催化的发展 非水相酶催化是目前酶工程研究中一个颇具基础性和应用性的研究领域。传 统的观点认为酶只在水溶液中可发挥其催化作用，在有机溶剂中会发生构象变化 而失活，然而大多数有机溶剂都不溶于水，这就大大限制了酶在有机合成中的应 用。随着人们对酶催化性质认识的逐步加深，八十年代中期，k l i b a n o vam 【1 3 , 1 4 j 等人发现，脂肪酶在近乎无水的环境下仍具有催化活性，并且稳定性还有所提高。 从此开辟了非水相酶学( n o n a q u e o u se n z y m o l o g y ) 这一崭新的研究领域，极大的拓 宽了酶的应用范围。为酶学研究注入了强大的生机和活力。目前，它已经被广泛 应用于合成、食品、精细化工甚至分析领域中1 1 4 , 1 5 , 1 6 ，体现出巨大的优势。 1 2 1 非水相酶催化的优点 与水相中的酶催化反应相比，非水相中的酶催化反应有独特的优越性。尤其 在有机合成方面。主要表现在： ( 1 )能催化在水中不能进行的反应，进行逆水解反应以合成肽或酯等； ( 2 )可以通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性。例如在有机溶 剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底 物专性、立体选择性和手性选择性等1 1 7 j ； ( 3 )引起酶变性的许多因素都与水的存在有关，因此在有机介质中有利于 提高酶的稳定性； ( 4 ) 在有机介质中大大减少了许多需要水参与的副反应； ( 5 )在有机介质中进行的酶催化反应，可以省略产物的萃取分离过程： ( 6 ) 在有机溶剂的体系中，大大减少了微生物污染的可能性： 3 浙江大学硕士学位论文 ( 7 )由于酶不溶于有机溶剂中，所以是一个非均相反应体系。酶进行固 定化处理后，将使反应体系更加简单，提高了酶的再利用。 1 2 2 非水相中酶的活性 1 2 2 1 水对酶活性的影响 这里所说的非水相酶催化，并不是说反应体系中不含有任何水分，只不过所 含水分极少。其实在非水相酶的催化过程中，水的存在是必需的，但它也起着正 反两方面的作用。 在正的方面，水对酶在非水相中保持催化活性是必需的。酶分子的构象主要 通过氢键、静电作用力、疏水作用以及范德华力等作用构成一个复杂的网络来维 持，水分子直接或间接地参与这些非共价作用力的形成和维持。其作用类似于润 滑剂和增塑剂。而在绝对无水的条件下，如果没有合适的物质来代替水执行这些 功能，酶就会失活。因此我们要解决的关键问题不是非水相酶催化是否需要水的 参与，而是需要多少水。z a k s 等人【1 8 1 的研究表明，在含水的有机溶剂中并不是 所有的水分子都与酶的催化活性有关，而只是一小部分与酶紧密结合的水分子形 成的水化层对酶的催化活性有贡献，这部分水我们把它称为“必需水”( e s s e n t i a l w a t e r ) 。他们认为水分子能够与酶分子的功能基团之间形成氢键，从而屏蔽了酶 分子上极性基团之间的静电相互作用，使酶仍然处于“柔性”状态和催化作用所 必需的构象状态。在研究中他们还发现水含量的增加直接导致了酶活性的不断增 加，乙醇氧化酶在含水量达1 0 的3 戊基乙醇中，其催化活性竟然超出水相活 性2 0 之多【1 9 1 。 在反的方面，过量的水量会使酶构象的“柔性”过大，使酶构象处于热力学 不稳定状态。而且过量的水会在酶分子周围形成水簇，或使粉末状酶积聚成团， 导致传质阻力增加，影响底物进入酶的活性部位，从而降低甚至丧失酶的催化活 性【加，2 1 1 。此外，在有水生成的可逆反应( 如酯化、酯交换) 中，水分的存在也对反 应的热力学平衡不利，影响产物收率。 因此在非水相酶反应体系中存在一个“最佳水含量”。该最佳水含量不仅取 决于酶种类的不同，也与所选用的有机溶剂有关，通常这一水含量极低。只有在 最佳水含量时，蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间才能达到最佳平衡 4 浙江大学硕士学位论文 点，酶才表现出最大活性。由于不同种酶具有不同的结构和性质，所以他们对维 持其催化活性构象所需的含水量自然也不相同。而且体系中的水量分布在酶、溶 剂和杂质中，因此对于同一种酶而言，反应体系中的最佳水含量也与有机溶剂的 种类和载体性质有关。为了排除这些因素且能定量描述水的影响，h a l l i n g 等 2 2 1 首先提出热力学水活度a w ( t h e r m o d y n a m i cw a t e ra c t i v i t ”这一概念。a 。表示了酶周 围含水层中水浓度的大小，而不是整个体系的含水量大小。h a l l i n g 等1 2 3 】在研究 中发现，米黑毛霉脂肪酶( m u c o rm i e h e il i p a s e ) 在a 。= o 5 5 时，在不同极性的溶剂 中都表现出最高的酶活性。这说明酶在不同的有机溶剂中能达到最大酶活的水活 度基本相同。常用的水活度控制方法有两种：第一种是利用饱和盐溶液气相具有 固定的a ，将酶、底物和介质在反应之前用饱和的盐溶液分别进行预平衡，反应 时再混合在一起。第二种是利用水合盐对来控制反应体系的水活度。其原理是在 水合盐的高低两种水合形式之间互相转化。当同一种盐的两种水合态的混合物维 持在某一特定温度时，就会建立一种蒸汽压平衡。因此，这种水合盐对通过在水 合盐对的高态和低态释放和吸收水分，起到了“水活度缓冲液”的作用，从而使 水活度在一衡定温度下保持不变1 2 4 2 5 1 。 1 2 2 2 有机溶剂对酶活性的影响 有机溶剂是如何影响酶催化活性是有机相中酶学所研究的一个重要问题。迄 今为止研究发现，有机溶剂主要从以下三个方面来影响酶的活性： ( 1 ) 有机溶剂直接与酶发生作用，通过破坏水分子与酶之间的各种作用力 来改变酶的活性构象，抑制或降低酶的催化活性； ( 2 ) 有机溶剂直接夺取酶分子表面的“必需水”，导致酶的失活； ( 3 ) 有机溶剂在其它组分之间形成的两相界面也会影响酶的催化活性。 在有机溶剂中酶的催化活性与有机溶剂的亲水性呈负相关性，酶通常在疏水 性溶剂中的催化活性比在亲水性溶剂中高，这是因为疏水溶剂夺取酶分子表面 “必需水”的能力比亲水性溶剂小。为了寻找能使酶发挥最高活性的有机溶剂， 人们提出了多种表达溶剂性质的参数。但最常用和最可靠的方法是用分配系数的 对数值l o g p 。l o g p 是描述有机溶剂极性大小的参数，p 值是溶剂在正辛醇和水中 的分配系数比，i c g p 越大，溶剂的疏水性越强。 l a n n cc 等1 2 6 j 总结了相关文献，发现有机溶剂的疏水性参数l o g p 和酶活性 5 浙江大学硕士学位论文 有较好的相关性，见表1 2 。 表1 2l o g p 与酶活性的相关性 t a b1 2t h er e l e v a n c eb e t w e e nl o g pa n de n z y m ec a t a l y t i ca c t i v i t y 从表1 2 中可以看出，l o g p 值介于0 4 的溶剂不宜作为酶催化反应的非水介 质溶剂。l a n n ec 等【硐人认为亲水性的溶剂化作用较强，能够剥夺酶分子表面的 必需水；疏水性的溶剂不能产生强烈的溶剂化作用，因而与酶结合的必需水得以 保留。 1 2 2 3 溶剂的p h 值对酶活性的影响 反应介质的p h 值是影响非水介质酶反应的重要因素之一。酶的催化活性和 选择性与酶的构象密切相关，p h 值可以影响酶的离子化，而离子化状态决定了 酶的构象。因此p h 值最终可影响酶的催化活性。但是对有机溶剂来说通常不存 在体系p h 值的概念，酶蛋白质中可电离基团在有机溶剂中不能电离，因此有机 相中的酶不是处于可以表现出最佳催化活性时相对应的最佳电离状态。在非水介 质中p h 值不易测定和控制，但是可以将酶先溶解在少量最适p h 值缓冲溶液中 直接冻干或从最适p h 值缓冲溶液中沉淀，大量研究表明【2 7 0 8 】脱水步骤和有机溶 剂都不会改变酶的电离状态，因此酶在有机溶剂中可以继续保持脱水前的最适电 离状态，这种现象被形象的称为“d h 记忆”【2 9 1 。 1 3 生物印迹技术 r u s s e l laj 和k l i b a n o vam i 删在对含有配体n - a c - t y r n h 2 ( 竞争性抑制剂) 的枯草杆菌蛋白酶进行活性测定的研究中提出了一种可在非水相极大地提高酶 6 浙江大学硕士学位论文 催化活性的酶修饰方法一“生物印迹”( b i o i m p r i n t i n g ) 修饰法。“生物印迹”是 一种通过配体对酶构象进行诱导，从而改变酶构象的方法，经“生物印迹”法修 饰过的酶与配体间的结合能力有很大程度的提高。r u s s e l l aj 【3 0 i 将枯草杆菌蛋白 酶从含有配体n a c t y 心m 2 ( 竞争性抑制剂) 的缓冲液中沉淀、干燥，洗脱配体后， 在有机溶剂中测得酶的活性提高了1 0 0 倍。m o s b a c h 等【孔悃生物印迹法制备了d 型的n - 乙酰氨基酸印迹的a 胰凝乳蛋白酶，在环己烷中，d 型印迹酶可催化合 成n 一乙酰d 。氨基酸乙酯，它的催化活性比未印迹酶的催化活性提高了3 倍。 d a b u l i s 等【3 2 】用【广苹果酸作配体印迹b s a 与溶菌酶，发现在真空中保存印迹酶 四周后，其与配体结合能力仍无大的变化。b r a c o 等【3 3 l 用配体l 酒石酸或对羟基 苯甲酸在异丙醚溶剂中将b s a 印迹，发现印迹后的b s a 在有机溶剂中对配体的 结合能力比未印迹过的b s a 提高了3 0 倍。这些研究表明生物印迹法能有效地提 高脂肪酶在有机溶剂中催化活性、稳定性和亲和性，已显示出巨大的发展前景。 1 3 1 生物印迹过程及基本原理 生物印迹的基本过程如下： ( 1 ) 将酶溶于含有其配体的缓冲溶液中，使配体对酶构象进行诱导； ( 2 ) 将此酶液冷冻干燥形成酶粉，使酶构象得以固定下来； ( 3 ) 用有机溶剂冲洗冻干酶粉除去配体后，将其过滤并真空干燥。 生物印迹的基本原理是基于酶在有机相中具有“分子记忆”功能，而这种功 能的形成最根本的原因就是酶在非水介质中具有“刚性”结构。酶在含有其配体 的缓冲溶液中，肽链与配体之间的氢键相互作用激发了酶活性位点上“盖子”的 打开，从而改变了酶的构象，使其处于活性构象状态。由于酶的“分子记忆”功 能，这种新的活性构象除去配体后在有机溶剂中仍可保持。正是酶在有机溶剂中 的“刚性”结构，使得印迹酶在有机催化过程中能始终保持保存着的活性构象， 提高了印迹酶的催化活性，而且通过氢键还能特异地结合该配体。生物印迹基本 原理如图1 2 所示。 7 浙江大学硕士学位论文 配体 ! 骘 酶：、一一? 酶i 、 z 二o = 。二一二、z 二二二土二- 二二j 二二二二二、 i 莓 i 鬻 磐睑 图1 2 生物印迹基本原理 f i g1 2 s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no fb i o i m p r i n t i n g 1 3 2 生物印迹过程中关键因素的选择 在生物印迹过程中有许多不确定因素，若处理不当，可能直接影响印迹酶的 催化性能。经过近些年的深入研究，人们通过选择不同的印迹配体、不同的反应 体系以及不同的冻干保护剂来优化生物印迹，最大限度地提高印迹酶的催化性 能。 1 3 2 1 配体( 模板) 的选择 由于在生物印迹过程中，配体能诱导酶构象发生改变，因此配体的选择直接 影响到印迹酶的最终活性构象。目前常用的印迹配体有底物类似物1 3 4 1 ，两性分 子1 3 5 , 3 6 1 和脂肪酸【3 7 , 3 s l 。 选择底物类似物作为印迹配体( 模板) 是最早且最基本的采用手段。由于它 能较易激发酶活性位点上“盖子”的打开，因而可使印迹酶具有较高的催化活性。 但这种印迹酶在对其它配体的选择性上能力就降低很多。 选择两性分子作为印迹配体的原理是，由于脂肪酶有特殊的结构特点，使得 脂肪酶只能在油一水界面上才能保持催化活性，用两性分子作配体，实际上是用 它代替了脂肪酶催化反应所必需的油一水界面，从而使印迹酶处于活性构象状态， 提高了酶的催化活性。 选择脂肪酸作为印迹配体的优点在于，几乎所有的脂肪酸用作印迹配体都可 8 浙江大学硕士学位论史 以增加水解酶的催化活性，脂肪酸的碳链长度影响水解酶催化活性的增加程度， 而且酶的选择性并没有受到根本的影响。因此脂肪酸已被认为是一种非常有效的 印迹配体。 1 3 2 2 冻千保护剂的选择 加入冻干保护剂是为了防止在印迹过程的冻干脱水步骤中，由于各种应力的 影响而改变酶的结构。常用的冻干保护剂有糖脂类，冠醚1 3 8 捌，这是因为它们都 含有大量的羟基官能团，形成氢键的能力很强，当印迹酶在冻干脱水时，保护剂 的这些羟基就能够代替酶表面的水羟基，使酶表面形成一层假定的水化膜，保护 氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定酶的高级结构，保持其结构与功 能的完整性。 1 4 分子印迹技术 分子印迹，又称分子烙印( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) ，是源于高分子化学、生物 化学、材料科学等学科的一门交叉学科。分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g t e c h n i q u e ，r a n 3 是指为获得在空间和结合位点上与某一分子( 模板分子、印迹分 子或烙印分子) 完全匹配的聚合物的制备技术【删。随着对于分子印迹技术研究 的不断深入，在印迹机理、制备方法以及在各个领域中应用都取得了很大的进展， 尤其是在分析化学方面的应用更是令人瞩目。 1 4 1 分子印迹技术基本原理及方法 当模扳分子与聚合物单体接触时会尽可能地同单体形成多重作用点，如果通 过聚合，把这些多重作用点固定或“冻结”下来，当模板分子除去后，聚合物中 就形成了与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用点的空穴，这样 的空穴对模板分子具有选择性。这一技术是通过以下方法实现的： ( 1 ) 功能单体和模板分子在一定条件下形成某种可逆的复合物； ( 2 )加入交联剂，使其与功能单体聚合，形成的聚合物将模板分子包埋 在内； ( 3 ) 通过一定的物理和化学方法，将模板分子从聚合物中洗脱，这样就 9 浙江大学硕士学位论文 在聚合物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配、并含有与模板分子特异 性结合的功能基的三维空穴。这样可以再次选择性地与模板分子结合，从而具有 专一识别模板分子的功能。 分子印迹过程示意图如图1 3 所示。 功能基团 功能基咝! 受受等誊 功能基团 l 裂薹 仑掣念 图1 3 非共价法分子印迹示意图 f i g1 3 s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no fn o n - c o v a l e n tm o l e c u l a ri m p r i n t i n g 1 4 2 分子印迹技术的分类 按照单体与模板分子结合方式的不同，分子印迹技术可分为共价法( 预组织 法) 和非共价法( 自组装法) 。 1 4 2 1 共价法 共价法又称预组织法，是由w u l f f 等人创立发展起来的。在此方法中，模板 分子( 印迹分子) 首先通过可逆共价键与单体结合形成单体一模板分子复合物。 然后交联聚合，聚合后再通过化学方法打开共价键除去印迹分子。共价法的优点 是单体和印迹分子的作用力强，形成的复合物稳定，但印迹过程复杂，印迹分子 也较难沈脱。共价结合作用的物质包括硼酸酯、席夫碱、缩醛( 酮) 、酯、螯合 物等。共价法主要应用于制备各种具有特异识别功能的聚合物，如糖类及其衍生 物、甘油酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、扁桃酸、芳香酮、二醛、三醛、铁 转移蛋白、联辅酶及甾醇类物质。 1 0 坠盆 浙江大学硕士学位论文 1 4 2 2 非共价法 非共价法又称自组装法，是由m o s b a c h 等人创立发展起来的。在此方法中， 模板分子( 印迹分子) 与功能单体之间自组织排列，以非共价键自发形成具有多 重作用位点的单体一模板分子复合物，经交联聚合后这种作用保存下来。常用的 非共价作用有：氢键、静电吸引、金属螯合作用、疏水作用以及范德华力等【4 2 1 。 非共价法的优点是形式多样性，分子识别过程更接近于那些天然的识别过程。此 法主要应用于下列物质的分离中：染料，二胺、维生素、氨基酸衍生物、多肽、 肾上腺素功能药物阻抑剂、茶碱、二氮杂苯、核苷酸碱基、非甾醇类抗感染药菜 普生和苄胺等1 4 3 朋】。 随着分子印迹技术研究的不断深入，共价法与非共价法各自的优缺点也显示 出来，蕊者的优劣性比较如表1 3 所列。 表1 3 共价法与非共价法的比较 t a b1 3c o v a l e n ta n dn o n - c o v a l e n tm o l e c u l a ri m p r i n t i n g 1 4 3 分子印迹聚合物的制各 分子印迹技术以目标分子为模板分子，将具有结构上互补的功能化聚合物单 体通过共价或非共价键与模扳分子结合，并加入交联剂进行聚合反应，反应完成 后将模板分子洗脱出来，形成的一种具有固定空穴大小和形状及有确定排列功能 浙江大学硕士学位论文 团的交联高聚物。这种交联高聚物即为分子印迹聚合物( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g p o l y m e r s ，m i v s ) 。分子印迹聚合物一般是通过自由基引发制备的，引发剂常选 用偶氮二异丁氰( 砧b 或者偶氮二异庚氰，文献中也有用( n 地) 2 s 2 0 8 1 4 5 加l 或者过 硫酸赫一四甲基亚乙二胺( t e m e d ) 1 4 5 朋作为引发剂的。引发剂的引发有高温热引 发和低温光引发二种形式，低温光引发具有可印迹热不稳定的化合物和改变聚合 物的物理性能以或得更好的选择性等优点。因此低温光引发应用更加广泛。 分子印迹聚合物的制备方法主要有以下三种：扩散聚合法【勰1 、悬浮聚合法 i 蚓、表面印迹【鹅1 。 1 4 3 1 扩散聚合法 此法是将模板分子、功能单体、交联剂溶于有机溶液中，然后将溶液移入水 中搅拌，乳化；最后加入引发剂交联、聚合，可直接制备粒径较均一的球形分子 印迹介质。 1 a 3 。2 悬浮聚合法 采用全氟化碳液体作为悬浮介质，代替传统的有机溶剂一水悬浮介质，从而 根除了非共价印迹中存在的不稳定的预组织合成物。 1 4 3 3 表面印迹 n o r r l o w 和d h a l 等小组f 4 9 1 分别在硅胶和聚t r i m 粒子表面嫁接印迹层获得 成功。先将模板分子与功能单体在有机溶剂中反应形成加合物，然后将此聚合物 与表面活化后的硅胶、聚t r i m 粒子和玻璃介质反应嫁接，这样获得的分子印 迹聚合物解决了传统方法中对模板分子包埋过深或过紧而无法洗脱下来的问题。 1 4 4 分子印迹过程中关键因素的选择 1 4 4 1 印迹分子的选择 目前，应用制备分子印迹聚合物的印迹分子种类很多，主要有碳水化合物、 氨基酸及其衍生物、咖啡因、药物、肌酸及肌酸酐、有机磷毒剂、杂环化合物、 除草剂、胆固醇等。 1 2 浙江大学顾士学位论文 1 4 4 2 功能单体的选择 功能单体在分子印迹过程中具有非常重要的作用。目前常用的功能单体主要 有丙烯酸或甲基丙烯酸类i 哪! 5 2 】，丙烯酰胺【5 3 爿$ 1 ， ( 二甲基氨基) 乙基甲基丙 烯酸酯f 4 5 1 ，3 一氨基丙基三乙氧基硅烷和四乙氧基硅烷共混物1 5 q 等。其中又以丙 烯酰胺和丙烯酸类功能单体最为常用，这是因为这两类功能单体在水中都可以通 过氢键作用和蛋白质表面氨基酸残基基团产生较强的非共价作用，这对整个分子 印迹过程是非常有利的。 1 4 4 3 交联剂的选择 在分子印迹聚合物制备过程中，需加入交联剂以使m i p s 获得较高的专一性。 最早使用的交联剂是二乙烯基苯，目前，最常用的交联剂是二甲基丙烯酸乙二醇 酯( e g d m a ) 【5 筇羽，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) 【5 9 1 、季戊四酵三丙烯酸 甜删等。 1 5 本文研究内容 本课题以脂肪酶为研究对象，结合分子印迹和生物印迹两种技术达到对脂肪 酶构象的“刻录”。利用月桂酸和正丁醇双底物诱导酶构象刻录，并加入交联剂 和引发剂进行紫外光聚合，聚合完毕后用石油醚洗脱配体，最后干燥就得到了所 需“双底物刻录酶聚合物”。其原理如图1 4 所示。 逊嚣丛 功娩基团配体 型l 登 吩誊 箴江墨体洗脱髫羚、 铉迈兰j 曼j 夕如兹萎兹磐 图1 4 刻录酶原理图 f i g1 4 s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f r e c o r d e dl i p a s e 1 3 浙江大学硕士学位论文 为了考察双底物刻录酶聚合物的性质，研究内容设计如下： ( 1 ) 考察双底物刻录酶聚合物在水相中的催化活性，并分别考察p h 值、 温度及变性剂这三个因素对双底物刻录酶聚合物在水相中的催化活性的影响； ( 2 ) 考察双