（运动人体科学专业论文）不同磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究.pdf

摘要 1 研究目的 本文主要研究磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能的影响，分别补充大豆磷脂 和肝磷脂，用以观察不同磷脂补充对小鼠心肌线粒体功能影响的不同。 2 研究方法 以雄性昆明种小鼠为研究对象，将5 0 只小鼠随机分为5 组，分别对其进行为期2 周的补剂补充，记录饲养过程中小鼠体重的日变化，然后进行一次性力竭游泳运动，严 格记录力竭的时间。运动后即刻眼球取血处死，迅速取出小鼠心脏，提取心肌线粒体进 行指标的检测，检测n 0 、c a p 和a t p 含量。 3 研究结果 ( 1 ) 运动对照组小鼠心肌线粒体n 0 含量显著高于安静对照组，各磷脂补充组小鼠 心肌线粒体n 0 含量显著低于运动对照组。 ( 2 ) 运动对照组小鼠心肌线粒体游离c a 2 + 含量显著低于安静对照组，各磷脂补充组 显著高于运动对照组。 ( 3 ) 运动对照组小鼠心肌线粒体a t p 含量显著低于安静对照组，各磷脂补充组显著 高于运动对照组。 ( 4 ) 两磷脂补充组的n o 、游离c a 争、a t p 含量均未出现显著性差异，肝磷脂补充组 的n 0 、游离c a p 、a t p 含量均高于大豆磷脂补充组，但均不具有统计学意义。 ( 5 ) 磷脂补充组小鼠体重日变化与其余组相比并未出现显著性增长，饮食量也并未 出现显著性增加。 ( 6 ) 两磷脂补充组小鼠平均力竭游泳时间长于运动对照组，肝磷脂补充组小鼠游泳 力竭时间略长于大豆磷脂补充组，但两组相比不具有显著性差异。 4 研究结论 ( 1 ) 力竭运动使小鼠心肌线粒体中的n o 升高、游离c a 2 + 降低和a t p 降低，三个指 标均发生了显著改变。 ( 2 ) 肝磷脂和大豆磷脂的补充，削弱了力竭运动对n 0 、游离c a 斗和a t p 三个指标的 影响。 ( 3 ) 两磷脂相比，肝磷脂对各指标的影响明显强于大豆磷脂，但不具有显著性差异。 ( 4 ) 磷脂补充明显延长了小鼠的游泳力竭时间，暗示磷脂补充能提高运动能力。 ( 5 ) 磷脂补充不会引起小鼠体重和饮食量的明显增加。 关键词：磷脂；线粒体：n o ；游离钙离子；a t p a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sa r t i c l ew a st od i s c u s st h ee f f e c to ft h es o y b e a na n d 1 i v e r p h o s p h o l i p i d s s u p p l e m e n t s t ot h ef u n c t i o no fr a t s h e a r t m i t o c h o n d r i a l m e t h o d sm a l ek u n m i n gr a t sw e r es e p a r a t e di n t of i v eg r o u p s ，a n d d i f f e r e n ts u p p l e m e n t sh a db e e nt a k e nf o rt w ow e e k s d u r i n gt h i st i m e ，t h eb o d y w e i g h t so fe a c hr a tw e r er e c o r d e de v e r y d a y t h e ne x h a u s t e ds w i m m i n ge x e r c is ew a s t a k e n ，t h et i m eo fs w i m m i n ge x e r c i s ew e r er e c o r d e ds t r i c t l y a f t e rt h er a t s w e r ek i l l e d ，t h er a t s h e a r t sw e r es e p a r a t e d ，a n dt h ec o n t e n to fn o 、c a 争a n da t p w e r em e a s u r e d r e s u i t s ：( 1 ) t h ec o n t e n to fn ow a sh i g h e ri ne ct h a ns c ，b u ti tw a s1 0 w e r i ns e 、l ea n dl lt h a ne c ( 2 ) t h ec o n t e n to fc a 争w a sl o w e ri ne ct h a ns c b u t i tw a sh i g h e ri ns e 、l ea n dl lt h a ne c ( 3 ) t h ec o n t e n to fa t pw a sl o w e ri ne c t h a ns c ，b u ti tw a sh i g h e ri ns e 、l ea n dl lt h a ne c ( 4 ) t h e r ew a sn os i g n if i c a n t d i v e r s i t yb e t w e e ns e 、l ea n dl li nn o 、c f + a n da t pe x p r e s s i o n 。b u tl ea n dl l w a sh i g h e rt h a ns e ( 5 ) p h o s p h o l i p i d ss u p p l e m e n t sd i d n ti n c r e a s et h er a t s w e i g h t a n dt h eq u a n t i t yo f d a i l yi n g e s t i o ns i g n i f i c a n t l y ，( 6 )e v e r y p h o s p h o li p id ss u p p le m e n tg r o u p st o o k1o n g e rti m et ob ee x h a u s te dt h a ne cg r o u p ， l ea n dl lw a sl o n g e rt h a ns e ，b u tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i v e r s i t yi ns e 、 l ea n dl l c o n e i u s i o n s ：( 1 ) e x h a u s t e de x e r c i s ei n c r e a s e dt h ec o n t e n to fn o 、c a 弘a n da t p s i g n i f i c a n t l y ( 2 ) s o y b e a np h o s p h o li p i ds u p p i e m e n ta n di i v e rp h o s p h 0 1 i p i d s u p p l e m e n tr e d u c e de x h a u s t e de x e r c i s e si n f l u e n c eo nn o 、c a a n da t p ( 3 ) c o m p a r e dw it hs o y b e a np h o s p h o li p id ，liv e rp h o s p h o li p idh a db e t t e re f f e c t ，b u t d i d n tm a k es i g n i f i c a n td i v e r s i t y ，( 4 ) p h o s p h o l i p i d ss u p p l e m e n t sc o u l dp r o l o n g t h ee x h a u s t i n gt i m ei ns w i m m i n g ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tp h o s p h o li p i d ss u p p l e m e n t s c o u l di m p r o v et h ee x e r c i s ea b i l i t y ( 5 ) p h o s p h o l i p i d s s u p p i e m e n t sd i d n t i n c r e a s et h er a t s w e i g h ts i g n i f i e a n t l ya n dc a u s et oe a tt o om u c h k e yw o r d s ：p h o s p h oi ipid ：m i t o c h o n d riai ：n o ：c a 2 + ：a t p 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名：熊垒蕉 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：亟丝叁指导教师签名：董：主查丝 签名日期：砌t 7 r年巧月巧日 不同磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究 1 前言 1 1 选题意义 现有研究表明心肌线粒体是心肌细胞内源性n 0 产生的主要来源。n 0 含量的增多会影 响心肌线粒体电子的传递和呼吸功能，导致线粒体功能障碍。线粒体亦是细胞生成0 。一4 ( 超 氧阴离子) 的主要场所，在线粒体中n 0 极易与0 1 一结合生成o n 0 0 一( 过氧亚硝酸根) ，o n 0 0 一 是造成线粒体损伤的主要原因，有研究证明，o n 0 0 可破坏线粒体c a 2 + 转运“2 f ，线粒体c a “+ 的j 下常转运对细胞浆c a 斗浓度及细胞功能有明显影响。有关工作已证明：力竭运动后， 大鼠心肌线粒体c a 2 + 转运发生明显变化1 ，而这种变化是由线粒体内膜通透性改变引起 的，而且这种通透性的变化是由于线粒体内； l - c a p 浓度差所造成的1 。大量生物学和医学 实验表明，细胞c a p 代谢异常是引起肌肉结构和机能变化从而导致疲劳产生的重要因素 之一哺1 。李雷3 等研究发现：细胞c a 斗浓度的变化使机体产生不同程度的应激和损伤，线 粒体是能量产生的重要部位，长时间力竭运动中，c a 2 + 转运能力可能是运动性疲劳更为 敏感的指标。如果线粒体内c a 斗含量过高，既会破坏线粒体膜的流动性，又会抑制线粒 体氧化磷酸化过程，使a t p 生成受阻，进而影响运动能力。线粒体是产生a t p 的重要部位， 如果线粒体损伤严重，势必会影响a t p 生成的量，从而影响运动能力。本文主要研究磷 脂补充在提高运动能力上的作用。进而为磷脂能否作为一种运动营养补剂提供参考。 磷脂是动、植物细胞中细胞膜、核膜及各种细胞器膜的基本成分，对生物膜的流动 性、通透性和完整性起着重要的作用。力竭运动后，c a 2 + 转运会发生改变，而这种变化 正是由膜的通透性变化引起的，进而影响运动能力，故通过磷脂的补充来观察磷脂对于 运动能力的提高是否有作用。 1 2 研究内容 本实验主要是为了观察肝磷脂和大豆磷脂对细胞损伤的修复作用的不同。具体的研 究内容主要分为两部分： 内容一：磷脂的提取和制备。 肝磷脂提取和制备：肝磷脂的提取方法由辽宁师范大学生命科学学院提供，此提取 方法已成功应用于2 0 0 5 年国家自然科学基金资助项目。 大豆磷脂的提取和制备：直接采用市面所售的成品：h a r v a r d - k a n g 大豆磷脂软胶囊，其 提取方法已经过反复的实验验证。 不同磁脂补充对力竭运动小鼠，d 肌线粒体功能影响的研究 内容二：动物实验。 动物的饲养：小鼠进行适应性饲养2 天，以使小鼠适应实验室环境。然后给小鼠进 行分组，随机分为五组：安静对照组、运动对照组、大豆磷脂运动组、肝磷脂运动组和 肝磷脂运动+ 限食组。灌胃饲养天数两周，并观察小鼠体重和摄食的变化情况。灌胃两 周后一次性力竭运动后处死，提取出小鼠的心脏，对其称重、标号，迅速投入液氮中速 冻，待测。提取心肌线粒体，测定心肌线粒体n 0 、c a p 署1 3 a t p 含量，探讨不同磷脂补充对 小鼠心肌线粒体各指标的不同影响。 1 3 研究假设 1 3 1 力竭运动后小鼠心肌线粒体中n o 含量增多，游离c a - + 和a t p 含量降低。 1 3 2 磷脂具有修复线粒体膜的作用，故磷脂补充组和安静对照组小鼠心肌线粒体n 0 含量应低于运动对照组，而游离c a 2 + 和a t p 含量均应高于运动对照组。 1 3 3 磷脂能够起到提高运动能力的作用，故补充后能明显提高小鼠力竭时间。 1 3 4肝磷脂属动物性，较大豆磷脂更易被吸收利用，故假设肝磷脂对于提高运动能 力上效果优于大豆磷脂。 2 f ；问磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究 2 文献综述 众所周知，对运动员而言，大运动量、大强度的训练能够提高运动成绩，然而过度 运动则会导致机体受损，尤其是运动性心肌损伤。以前的研究表明，力竭性运动可以诱 发机体心肌损伤盯，剐，心肌损伤后其微观结构必然发生改变，尤其表现在心肌线粒体结构 与功能的改变。线粒体一般呈粒状或杆状，有内外两层封闭的膜构成，其中内膜对于能 量转换起主要作用，氧化磷酸化的电子传递链位于内膜，内膜上的标志酶为细胞色素c 氧化酶。线粒体不仅是细胞的重要结构，是三羧酸循环以及进行氧化磷酸化合成高能磷 酸化合物的场所，是机体的重要能量来源，而且还是机体内源性自由基的主要产生部位 之一。心肌线粒体的主要功能是把心肌细胞质中的代谢物通过氧化磷酸化高效率地生成 a t p 。正常生理状态下，人体8 0 以上的能量由线粒体氧化磷酸化供应。细胞生命活动所 需能量的9 5 也是由线粒体提供的，心肌纤维所含的线粒体在所有组织中是最丰富的旧。 故观察运动后心肌线粒体诸指标的变化对运动后心肌损伤的发现和防治具有重要意义。 心肌损伤发生时，心肌线粒体同时也发生损伤0 1 。目前国内外有关一次性力竭运动 对线粒体影响的研究主要集中在以下几方面：1 ) 力竭运动导致的自由基生成增加对线 粒体的影响；2 ) 力竭运动对线粒体c a 2 + 浓度的影响；3 ) 力竭运动对呼吸链及线粒体氧 化磷酸化功能的影响；4 ) 力竭运动对膜上功能性酶n a + 一k + 一a t p 酶和c a ”- m g “ - a t p 酶的影 响。 2 1 力竭运动导致的自由基生成增加对线粒体的影响 自由基是指具有未配对电子的原子、离子或分子等物质。当机体运动训练负荷过大 时，就可引起心肌自由基增多，在正常的生理状态下，机体产生的少量自由基可通过相 互碰撞而消失或被体内的酶促防御系统，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及非酶促防御 系统女i v i t e 、v i t c 等清除1 ，这时机体就不会受到损伤。但当自由基的生成超过机体的 清除能力，就会使膜发生脂质过氧化反应，从而影响膜的结构和功能。m d a 是自由基与 不饱和脂肪酸反应生成的代谢产物，常被用来间接反映机体的自由基生成的多少，故通 过测定m d a 含量可以反映自由基的生成情况。许豪文，胡红梅在1 9 9 8 年用大鼠进行游泳 运动至力竭时引起的自由基积累对线粒体正常生理功能的影响的实验2 l ，结果证实了， 大鼠游泳至力竭时，心肌线粒体丙二醛( m d a ) 含量显著升高( p o 0 1 ) ，说明线粒体内鲁 由基生成和清除失衡，自由基在体内积累，即运动性内源自由基增生。提示自由基会攻 j i 同磷脂补充对力竭运动小鼠心圳l 线粒体功能影响的研究 击线粒体膜，使膜的完整性受到一定程度损伤，结果是导致线粒体损伤，进而功能下降， 机体产生疲劳。还可以用s o d 的活性来反映自由基的生成情况，因为s o d 活性的高低可以 反映机体抗氧化能力的强弱。张韵等在2 0 0 0 年的研究显示，大鼠力竭游泳运动后心肌线 粒体s o d 活性显著下降3 ，与以往的研究基本一致。力竭运动后心肌线粒体自由基产生 和清除之间的平衡受到破坏，说明心肌组织清除自由基能力的下降是引起心肌线粒体损 伤的原因之一。力竭运动可导致机体自由基和脂质过氧化水平升高的事实得到广泛证实 n 1 7 。目前大量的研究表明：黄嘌呤氧化酶活性降低、线粒体呼吸链电子传递受阻和自 由基防御系统损伤n 扣列是自由基生成增多的机制。研究表明氧自由基过多还易引发多种 心血管疾病如心肌缺血再灌注时会造成抗氧化保护机制的改变，而且国内外的研究还证 实，缺血和再灌注的心肌对磷脂脂质体的摄取显著增加，提示补充膜磷脂可能是治疗心 肌缺血，防治再灌注损伤的有效途径之一瞳7 | 。 2 2 力竭运动对线粒体c a 2 + 浓度的影响 钙是线粒体膜通透性转运通道中不可缺少的转运体，曾有报道，在内源性自由基等 因素的影响下，心肌线粒体c a 2 + 转运失调可能首先发生。在长时间力竭运动中，c a 小转运 可能是运动性疲劳更为敏感的指标汹3 。c a p 的主要作用有：1 ) 可以通过呼吸链刺激活性 氧的产生；2 ) 可以结合到线粒体膜蛋白上，导致其构型发生变化，有利于活性氧攻击膜 蛋白巯基1 ；3 ) 可激活磷脂酶a 2 ，磷脂酶a 2 活性增加又可导致线粒体通透性转运的可 能性增加，且线粒体通透性转运又可使跨膜电位耗散，从而导致细胞凋亡o 。c a 转运失 调引起的线粒体膜磷脂酶a 2 活性增加，磷脂酶a 2 活性增加又反过来影响c a 的转运这种 相互作用可能是造成运动性疲劳及损伤的一个重要原因。”：。有许多研究表明3 4 1 ，大强 度运动时总是伴随着心肌细胞内钙浓度的变化，而这种c a p 转运发生的紊乱是由于线粒 体内膜的通透性发生改变引发的，提示钙可能是影响运动能力的因素之一，而且这种通 透性的变化是由于线粒体内外c a 2 + 浓度所造成的引。线粒体对细胞内c a p 浓度起重要的调 节作用，如果胞浆内c a 廿浓度增高，会激活线粒体膜上的膜磷脂酶a 2 ，使日订列腺素和白 三烯生成增加从而造成心肌损伤，故当胞浆内c a 2 + 增加时，线粒体就会主动摄取c a p ， 但如果线粒体内c a 2 + 含量过高，既会破坏线粒体膜的流动性，又会抑制线粒体氧化磷酸 化过程，使a t p 生成受阻，进而影响运动能力。有许多研究表明 3 2 - 3 4 机体进行大强度运 动时总是伴随着心肌细胞内钙浓度的变化，说明钙浓度的变化可能是影响运动能力的因 素之一。在j 下常情况下，线粒体内c a 争浓度是细胞内总c a 浓度的万分之一，如景膨浆二。 4 f ；同磷脂补充对力竭运动小鼠心缈【线粒体功能影响的硝究 浓度升高，就会导致线粒体摄取c a 2 + 增多，田野m 。报道了力竭运动后骨骼肌线粒体钙含 量显著增加。张钧、许豪文等在2 0 0 0 年发表的不同强度运动对大鼠心肌线粒体功能的影 响的文章中指出船7 | ，力竭运动后心肌线粒体游离钙含量显著下降，力竭运动后2 4 h 游离 钙含量最高，其可能机制为：( 1 ) 力竭运动后线粒体摄钙能力下降。( 2 ) 力竭运动可使线 粒体钙释放能力加强。( 3 ) 运动可导致线粒体无机磷( p i ) 增加，使游离钙和p i 结合形成 磷酸钙沉淀增加，使线粒体中游离钙浓度下降。王文信等御用s d 大鼠做力竭性游泳运动 也报道了力竭运动后心肌线粒体游离钙浓度下降，总钙浓度显著增加的实验结果。故线 粒体内高密度钙赫堆积常作为细胞不可逆损害指征之一9 ，即线粒体和细胞内钙异常增 加程度常做为细胞损伤指征之一o 。早在1 9 7 8 年，t a t e h 羽就报道了大鼠力竭性游泳后 骨骼肌线粒体总钙显著增加。1 9 9 0 年，d u a n h 3 1 报道了大鼠下坡跑后骨骼肌线粒体总钙增 加。 2 3 力竭运动对呼吸链及线粒体氧化磷酸化功能的影响 呼吸链( r e s p i r a t o r yc h a i n ) 是由一系列的递氢体( h y d r o g e nt r a n s f e r ) 和递电子体 ( e l e c t r o nt r a n s f e r ) 按一定的顺序排列所组成的连续反应体系，它将代谢物脱下的成 对氢原子交给氧生成水，同时有a t p 生成。线粒体内膜呼吸链由四个酶复合体( i ，i i ， m ，) 、细胞色素c 、辅酶q 等组成。酶复合体i ，n ，1 ，在能量代谢中起着重要作用， 如果它们的活性发生改变必将影响能量代谢，且它们的功能变化直接或间接地反映线粒 体的呼吸功能变化。线粒体呼吸链包括n a d h 氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链，实际上呼 吸链的作用代表着线粒体最基本的功能，因为最终有a t p 生成，而线粒体又是a t p 生成的 直接场所。线粒体是细胞进行有氧代谢合成a t p 的主要场所，主要由线粒体内膜呼吸链 完成。氧化磷酸化是细胞中重要的生化过程，是细胞呼吸的最终代谢途径，位于糖酵解 和三羧酸循环之后，是产生a t p 的主要步骤。这一过程可看作电子传递过程中偶联a d p 磷 酸化，生成a t p 。有氧代谢供能是耐力性运动的主要供能系统，是长时间大强度运动的 主要能量来源。运动方式不同对呼吸链的影响也各不相同。李洁，汪浩h 4 1 以雄性w i s t e r 大鼠为实验对象的研究显示大强度运动和中等强度运动均会引起大鼠心肌线粒体电子 传递链酶复合体活性不同程度的变化，且大强度运动主要影响f a d h ：电子传递链酶复合体 的活性，而中等强度运动主要影n i 匈n a d h 电子传递链酶复合体的活性。力竭运动后线糙体 呼吸链复合体i 活性降低己在大鼠肝脏、心肌和骨骼肌中观察到h 新。也有研究证实，心 肌线粒体膜磷脂含量及呼吸链细胞色素c 氧化酶活性降低h 等，提示运动性疲荨三绞 ：三 s 不l 叫磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究 体呼吸链损害有关。d a v i e s 报道了线粒体以琥珀酸为底物的呼吸控制比( r c r ) 改变仃。的 报道。 2 4 力竭运动对膜上功能性酶n a + 一k + - a t p 酶和c a 2 + _ m 9 2 + - a 丁p 酶的影响 n a + - k + - a t p 酶和c a 争一m 9 2 - a t p 酶是膜上调节n a + 、k + 、c a 争和m g 斗浓度的关键酶。n a + 、k + 、 c a 少和m g p 等离子浓度维持在一定水平对线粒体正常功能的行使有重要的作用，如果 n a + - k + - a t p 酶和c a 2 + - m 9 2 * - a t p 酶下降，势必影响线粒体的正常功能。钠和钾对于细胞内外 离子浓度的维持起重要作用，钙是维持细胞功能不可缺少的重要因素，镁对心血管系统 疾病的防治作用也同益受到重视n 川。心肌线粒体的c a 2 + - a t p 酶和m 9 2 + - a t p 酶通过分解a t p 供能，对调节细胞内钙稳态有重要作用。力竭运动导致心肌线粒体c a ”一a t p 酶和m 9 2 + - a t p 酶活性下降，可能与线粒体膜损伤、线粒体能量代谢障碍和m 矿对其保护作用减弱有关。 有研究发现h 引，胞浆m 9 2 + 的丢失是心肌缺血的早期变化，随后出现n a + 、c a 2 + 超载和k + 含量 的下降。高浓度的m g “+ 对心肌线粒体c a ：4 - a t p 酶和m 9 2 + - a t p 酶活性有保护作用。大量的研 究表明力竭运动后心肌线粒体膜会受到损伤，这些离子浓度的维持对线粒体j 下常功能的 发挥具有重要的作用。魏源报道嘞3 大鼠进行递增负荷力竭运动后红肌线粒体n a l k + - a t p 酶活性有降低趋势，周锦琳报道晴n 大鼠在中等强度运动致疲劳后，骨骼肌线粒体c a 2 + - a t p 酶活性显著下降。刘建华等通过建立大鼠过度训练模型，探讨了过度训练对大鼠心肌线 粒体膜上功能酶活性的影响瞄圳的研究发现，过度训练后线粒体膜上n a + - k + - a t p 酶和 c a “+ - m g p - a t p 酶活性均显著下降。 综上所述，近几年的研究结果显示一次性力竭性运动会导致心肌线粒体损伤，这种 损伤的指标主要表现在：自由基生成过多时就会使膜发生脂质过氧化反应，从而影响膜 的结构和功能；线粒体n c a p 含量过高，既会破坏线粒体膜的流动性，又会抑制线粒体 氧化磷酸化过程，使a t p 生成受阻，进而影响运动能力；呼吸链及线粒体氧化磷酸化功 能受阻，进而影响a t p 的生成而影响运动能力；线粒体膜上n a + - k + - a t p 酶和c a 2 + - m 9 2 + - a t p 酶活性均显著下降。 线粒体对维持细胞功能具有重要的作用，磷脂是各种膜的主要组成成分，本文主要 研究通过肝磷脂和大豆磷脂的补充，观察两种磷脂对小鼠运动能力的影响的不同。 6 , , l ：l a j 磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究 3 研究内容磷脂的提取和制备 3 1 肝磷脂的提取 选取新鲜猪肝( 由大连础明集团提供) ，去除筋膜，剪碎，称重，取2 5 0 9 处理好的 猪肝，于组织匀浆器中充分匀浆，制得组织匀浆液。再加入4 0 0 r e 甲醇、8 0 0 m l 三氯甲 烷( 俗称氯仿) 和l o o m l 双蒸水，混匀，保鲜膜封口，于室温静置1 2 h ，使其充分萃取 分层。1 2 h 后混合物分成3 层，最下层为磷脂氯仿相，吸取磷脂氯仿相，过滤其中的杂 质，旋转蒸发仪蒸干获得磷脂、油脂和胆固醇混合物。取出混合物按质量体积比l ：3 加入丙酮，混匀，此时混合物中的油脂和胆固醇会被丙酮中和，再用氮气将丙酮相吹出， 反复多次得到纯净的磷脂即肝磷脂。 3 2 肝磷脂溶液的制备 将提取的肝磷脂加入双蒸水，超声裂解( j y 9 2 一i i 超声波细胞粉碎机，超声功率为 2 0 0 w ) ，制成浓度为1 8 m g m l 的肝磷脂悬浊液。 3 3 大豆磷脂的提取和制备 直接购买市场上销售较好的h a r v a r d - k a n g 大豆磷脂软胶囊，由美国l y ( u s a ) i n t li n c 提供技术支持，珠海市富海生物科技有限公司生产，磷脂含量为4 9 o g l o o g 。去 除大豆磷脂外面的胶囊，用丙酮去除蛋白质和脂肪等成分，加入双蒸水超生裂解( 方法 同肝磷脂处理方法) ，制成浓度为1 8 m g m 的大豆磷脂悬浊液。 3 4 磷脂的鉴定 此两种磷脂溶液已经过辽宁师范大学生命科学学院的鉴定，提取出的磷脂脂质体直 径均小于l o o n m ，满足动物的灌胃溶液要求晴3 1 。 4 研究内容二动物实验 4 1 实验对象与分组 由大连医科大学实验动物中心提供的5 0 只体重为2 0 - - 一3 0 9 、断乳1 0 天的雄性昆明种 小鼠，卫生等级为国家二级。饲养温度控制在2 3 + 2 ，相对湿度为4 0 , - 一6 0 ，自由 进食、饮水。 小鼠在适应性饲养1 周后，随机分为5 组，分笼饲养，每组1 0 只：安静对照组( s i l e n c e c o n t r o l ，s c 组) 、运动对照组( e x e r c i s ec o n t r o l ，e c 组) 、大豆磷脂运动组( s o y b e a n 不f 川磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究 p h o s p h o i p i d e x e r c i s e ，s e 组) 、肝磷脂运动组( 1 i v e rp h o s p h o i p i d e x e r c i s e ， l e 组) 、肝磷脂运动+ 限食组( 当日饮食量为安静对照组前一同饮食量，1 i v e r p h o s p h o l i p i d 1 i m i t ，l l 组) 。 除s c 组外，其他四组均于每同早7 ：0 0 与晚7 ：0 0 各灌胃一次。灌胃药量小鼠体质 量= i g k g b w d 。s e 组、l e 组和l l 组小鼠的灌胃溶液分别是前述内容中制备的1 8 m g m l 的磷脂悬浊液，e c 组于同一时间灌胃生理盐水。 4 2 运动模型 本实验设计采用一次性力竭游泳运动方案： e c 组、s e 组、l e 组和l l 组小鼠于饲养2 周后进行一次性力竭游泳运动，运动方式为 无负重游泳运动。运动- f i _ i i l 2 , , 时各组小鼠均禁食。 泳槽规格为1 o 5 o 5 对，水深4 0 c m ，水温3 0 - 4 - _ 2 。 力竭标准：小鼠游泳动作不协调，出现挣扎状，且下沉后1 0s 不浮出水面为力竭 标准。 4 3 测试样本的采集与处理 4 3 1 测试样本的采集 观察小鼠的饲养天数为两周，最后一天晚上禁食，第二天除空白组外均游泳至力竭， 严格记录力竭的时间。处死方式为眼球取血。 小鼠心肌样本的采集：小鼠处死后迅速取出心脏，置于冰生理盐水中挤出心脏中残 留的少量血液，去除心肌中的血管、结缔组织等，滤纸滤干，铝箔包好后标记( 以上过 程均在4 以下进行) ，迅速投入液氮中保存，待测。 4 3 2 测试样本的处理 肌肉匀浆方法腩们：小鼠心脏取出后在0 4 。c 放置l o m i n 后，称取l o o m g 的心肌，将样 本移至预冷的匀浆介质( 匀浆介质为0 8 6 的冷生理盐水) 中剪碎，组织：匀浆介质比 为l ：1 9 ( g m 1 ) 。取制得的5 的组织匀浆以2 0 0 0 r m i n 离一b l o m i n ，取上清液以 1 0 0 0 0 r m i n ( 低温高速离心机) 离。山1 5 m i n ，去除上清液，沉淀物为线粒体。将分离的线 粒体进行吹打悬浮于1 o m l 的匀浆介质中，制得线粒体悬浊液。以上过程均在0 4 。c 进 行。 4 4 指标的测试与方法 不l 司磷脂补充对力竭运动小鼠一山脚l 线粒体功能影响的研歹 4 4 1 心肌线粒体蛋白定量 方法：蛋白定量用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，操作严格按试剂盒说明书进行。仪 器为c a - 9 5 8 h 半自动生化分析仪。 4 4 2 心肌线粒体n o 舍量测定 方法：采用硝酸还原酶法( c a - 9 5 8 h 半自动生化分析仪) 。操作严格按试剂盒说明书 进行。 4 4 3 心肌线粒体游离c a ”测定 方法：f u r a - 2 荧光探针法( 同本岛津r f - 5 4 0 荧光分光光度计) 。 原理：f u r a 一2 a m 能够直接进入线粒体内，进入后a m ( 乙酰氧化甲酯) 被线粒体内的 非特异性酯酶水解成f u r a 一2 ，f u r a 一2 能与线粒体能游离c a 2 + 结合，结合的产物能够被特 定波长的紫外线激发而产生荧光，进而可以计算出游离c a 2 + 的含量。 操作步骤：将线粒体用孵育介质负载，以f u r a - 2 a m 为c a 2 + 荧光指示剂，参照 m c c o r m a r k 的方法腩茸稍加改进，用r 本岛津荧光分光光度计测定游离c a 斗的浓度，设定激 光光栅5 n m ，发射光栅1 0 n m ，发射波长5 0 5 n m ，以3 0 0 4 2 0 n m 激发光谱扫描，峰值在3 4 0 r i m ， 在3 4 0 n m 处进行测定。用荧光比色杯测定并记录荧光值f ( i m l ) ，加入0 4 ( v v ) t r i t o n x 1 0 0 测定最大荧光值f m a x ，最后加入i m o l l 的e g t a ，测定最小荧光值f m i n 。孵 育介质由甘露醇1 9 5 m m o l l 、蔗糖6 5 栅0 1 l 、h e p e s3 m m o l l 、琥珀酸3 m m o l l 、t r i s ( p h 7 4 ) 2 5 0 m m o l l 配成。 4 4 4 心肌线粒体a t p 含量测定 方法：高效液相色谱法m _ 铂( 日本岛津l c 一6 a 高效液相色谱仪) 。 操作步骤：色谱条件为c 1 8 柱，流动相为5 0 m m o l l 的磷酸盐缓冲液，流速为 0 5 m l m i n ，柱温为室温，检测波长2 5 4 n m ，进样量2 0ul ，实验采用外标法。实验当天 用微孔滤膜( 0 4 5i jm ) 抽滤。取0 1 m 1 线粒体悬液加入冰冷的1 6 m m o l l 的h c l o ，：0 2 m l ， 0 。静置5 m i n 后以2 0 0 0 0 转2 。c 离心1 0 m i n ，取上清用2 5 m o l l 的k o h 调p h 6 5 ，充分 混合于0 。静置1 0 m i n 后再次2 0 0 0 0 转2 离心1 0 m i n ，取上清2 0ul 定a t p 量。 4 5 主要试剂与仪器 主要试n - i r is 和f u r a 一a m 为s i g m a 公司产品，h e p e s 由北京欣经科生物技术有 限公司提供，n o 测试盒和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均由南京建成生物科研所旋供， a t p 标准品由北京欣经科生物技术有限公司提供，其他试剂均为国产分析纯。 o t 目脂x 女竭4 动小鼠心肌线粒体功能# 目的研a 主要仪器：低温低速离心机、低温高速离心机、c a 一9 5 8 h 半自动生化分析仪、开本 岛津r f 一5 4 0 荧光分光光度计、日本岛津l c 一6 a 高效液相色谱仪。 46 数理统计 各测试指标结果运用s p s s1 15 进行整理，组与组之间进行多因素方差分析。 47 实验结果 4 7 1 磷脂补克对小鼠心肌线枉体n 0 含量的影响 表4 - 1 小鼠心肌线粒体n o 禽鲎( 单伉：p 肿l g p r o t ) ( s d ) 组别 s c 组8 c 纽s e 组l e 组l l 组 注： 与s c 组相比具有显著性差异，p o0 5 与e c 组相比具有显著性差异，p o0 5 n o 含量 ：4 羔3 ：2 拿1 雹 茁0 赴 - s c 组 r _ 舄 1阕 不同磷胎补充对力蝎运动小鼠o m 线柱体功能影响的研究 纽别s c 组 e c 组s e 组l e 组l l 组 注： 与s c 组相比具有显著性差异p o0 5 ； 与e c 组相比具有显著性差异p o0 5 游离c a 2 + 含量 s 蛆 组别 ( 刚4 - 2 小鼠心肌线粒体游离c a 2 含量) 由图4 2 可以看出s c 组游离c a ”古量最多，e c 组最少。e c 组与其余四组相比具有 显著性差异( p o0 5 ) ；s c 组与其余四组相比具有显著性差异( p o0 5 ) 。3 组磷脂补充 组心肌线粒体游离c a l e 组含量最高，s e 组最低，但并没有显著性差异。 47 3 磷脂补克对小鼠心肌线粒体a t p 舍量的影响 表4 - 3 小鼠心肌线粒体a t p 古量( 单位i g ) ( ；s d 组别 s c 组e c 组s 窒f ll e 组l l 组 面西疆1 蕊正百矿再豇而万 五正而f 1 忑五两f 百百五面7 一 注：十与s c 组相比具有显著性差异，p o0 5 ： 与e c 组相比具有显著性差异，p o0 5 如加鲫如0 哪名l一掣辞一衄扛 不蚓脂补充对力自小鼠心肌线粒体功能影响白勺f 究 ) ! 垂 v 妊 赴 a t p 含量 ( 图4 - 3 小鼠心肌线粒体a t p 含鼙) 小鼠心肌线粒体a t p 含量如图4 3 所示，e c 组a t p 含量最低，s c 组台量最高。e c 纽与其余四组相比具有显著性差异( p 00 5 ) ：s c 组与其余四组相比具有显著性差异 ( p o 0 5 ) ：3 个磷脂补充组中l l 组含量最高，s e 组含量最低，但相比不具有显著性 差异。 4 7 4 碡脂补充对小鼠体重变化的影响 表4 - 4 小鼠体重日平均增长率( 单位克) ( x s d ) 不f n j 磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究 ( 图4 - 4 饲养两周小鼠平均体重变化示意图) 表4 - 4 的统计分析发现，各小组小鼠体重的日平均增长率并未表现出显著性差异。 由图4 - 4 分析可以看出在饲养的2 周内，各组小鼠体重均呈持续增长趋势。 4 7 5 磷脂补充对小鼠平均进食量变化的影响 表4 - 5 小鼠两周内日平均食物摄入增长量( 单位：克) ( x s d ) 由表4 - 5 中数据发现，各组小鼠日平均食物摄入量呈平均增长趋势，因对l l 组小 鼠限制了饮食，故对食物摄入增长量的研究主要研究其余四组。其余四组小鼠日平均食 物摄入增长量经统计分析，并未发现各组间具有显著性差异。 4 7 6 磷脂补充对小鼠力竭游泳时间的影响 表4 - 6 小鼠游泳运动平均力竭时间( 单位：分钟) ( x s d ) 注：宰与e c 组相比具有显著性差异，p o 0 5 ； 术木与e c 组相比具有非常显著性差异，p o 0 1 。 由表4 6 可以看出e c 组游泳力竭时间最少，l l 组最长。e c 组小鼠游泳至力竭的平 均时间远远小于磷脂补充组，而且与磷脂补充组相比具有显著性差异。( p o 0 5 ) ；l l 组 与e c 组相比具有非常显著性差异( p o 0 1 ) ：各磷脂补充组茅未发现显著性差导。 1 3 不j 司磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒休功能影响的研究 5 分析讨论 6 1 磷脂补充对小鼠心肌线粒体n 0 含量的影响 许多研究显示，心肌细胞中总n 0 的5 6 来自于线粒体，n 0 在心肌细胞功能活动中起 极其重要作用。t a t s u m i 的研究表明m 3 ，n 0 诱导的线粒体功能障碍可引起心肌细胞能量 的耗竭，从而影响心肌的收缩能力。n i s o li 认为汹3 ，n 0 对线粒体的影响具有时相性，短 时效应是抑制线粒体的功能，长时效应( 2 - 6 天) 能提高线粒体的呼吸功能。当n 0 在体内 发挥短时效应时，主要通过几个途径来抑制线粒体的呼吸活动的，一是直接与细胞色素 c 氧化酶结合，与氧竞争，从而抑s u c o x 活性，来抑制线粒体呼吸活动；二是线粒体中的 n o 极易与0 ：。结合形成活性氮，即o n 0 0 一，o n 0 0 - 主要通过灭活电子传递链成分活性来抑制 线粒体呼吸，并介导线粒体c a 斗外流，破坏钙稳定阳。张全江等也报道一次性力竭游泳 后小鼠肝脏n o 含量显著下降，而骨骼肌和血清n 0 含量显著升高。还有报道显示，n o 在 运动时氧消耗和糖转运方面起重要作用哺2 j ，这可能就与运动时能量的大量消耗有关。 本实验结果显示在力竭性运动后，小鼠心肌线粒体中n o 含量力竭运动组显著高于空 白对照组，可能由于力竭性运动后，产生大量的n o ，与0 ：一结合生成o n 0 0 ，伎线粒体受 到损伤，从而影响线粒体膜的结构和功能，进而导致线粒体功能障碍，而肝磷脂补充、 大豆磷脂补充和肝磷脂补充+ 限食组的n 0 含量显著低于运动对照组，且与安静对照组无 显著性差异，可能由于磷脂的补充抑制了内皮细胞释放n 0 ，减少了对线粒体呼吸功能的 抑制作用。由表4 - 1 可以看出，肝磷脂和大豆磷脂补充组力竭运动后的心肌线粒体n o 含 量没有显著性差异。 5 2 磷脂补充对小鼠心肌线粒体游离c a 舡含量的影响 线粒体是细胞钙的缓冲器，具有摄取、释放c a 2 + 以及调节胞浆c a p 浓度的能力，线粒 体内钙占细胞钙含量的3 0 左右，其含量比胞浆高5 0 0 倍阳引。有许多研究表明：。3 引，大强 度运动时总是伴随着心肌细胞内钙浓度的变化，而这种c a 2 + 转运发生的紊乱是由于线粒 体内膜的通透性发生改变引发的。张钧等的研究显示，力竭运动后即刻心肌线粒体游 离钙含量显著下降，力竭运动后2 4 h 游离钙含量升高，其可能机制为：( 1 ) 力竭运动后线 粒体摄钙能力下降。( 2 ) 力竭运动可使线粒体钙释放能力加强。( 3 ) 运动可导致线粒体无 机磷( p i ) 增加，使游离钙和p i 结合形成磷酸钙沉淀增加，使线粒体中游离钙浓度下降， 1 4 不蚓磷脂补充对力竭运动小鼠心肌线粒体功能影响的研究 而胞浆内钙离子浓度增高，胞浆内钙离子浓度升高激活了线粒体膜上的磷脂酶a ! ( p l a 2 ) ，使磷脂氧化酶系统产生脂质过氧化反应，膜磷脂分解，膜上出现大量新的钙 通道，从而使线粒体内游离钙释放进一步加强，造成线粒体的损伤。李雷旧3 等研究发 现：细胞c a 2 + 浓度的变化使机体产生不同程度的应激和损伤，c a ，浓度的改变导致疲劳和 细胞凋亡的同步发生。b y r d “认为在长时间的运动中，运送到肌浆网中的c a 会减少，这 样能量生成量亦会减少，不能满足运动的需要。 力竭运动后，运动对照组小鼠线粒体内游离c a 2 含量较安静对照组显著减少，说明 大运动量运动影响了c a 卦的转运，而c a 斗的减少就会影响细胞产生不同程度的应激和损 伤，进而造成了细胞线粒体的严重损伤，摄钙能力下降。本实验通过补充肝磷脂和大豆 磷脂，磷脂补充组游离c a 2 + 含量显著高于运动对照组，可能磷脂的补充可以减少对线粒 体膜的损伤，减少线粒体内游离c a p 的外流，从而一定程度上改善了线粒体的功能。肝 磷脂补充组和肝磷脂补充+