利用稻草液体发酵产纤维素酶优化培养基.doc

利用稻草液体发酵产纤维素酶优化培养基2010年3月第33卷第1期湖南师范大学自然科学学报journalofnaturalscienceofhunannormaluniversityv01.33n0.1mar.,2010利用稻草液体发酵产纤维素酶优化培养基谭宏,刘选明,廖红东,谢莫湘涛2,邓乐,王骊,梁志坤,廖胜辉,纪鸿雁鑫,朱立超,张元戎(1.湖南大学生命科学与技术研究院,中国长沙410082;2.湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081)摘要选用液体发酵产纤维素酶的优良菌株里氏木霉hc-415,在摇瓶阶段,通过正交试验等对稻草培养基中稻草粉与豆粕粉的用量等因素进行了研究,确定了优化的培养基配方和产酶条件.当一级种接种体积分数为15%,一级种培养时问24h;产酶培养基稻草粉与豆粕粉质量比为6:1,p(khpo)=0.01g/ml,p(caci2)=0.006g/ml,聚醚不加,装瓶量为50ml/250ml瓶,培养120h时,发酵液纤维素酶活性最高.此时,cmcase酶活性平均为94.62u/ml;fpa酶活性平均为l6.04u/ml.关键词稻草;液体发酵;里氏木霉;纤维素酶;正交试验中图分类号q93.335文献标识码a文章编号1000-2537(2010)o1-0114-06productionofcellulaseusingthestrawsubmergedfermentationtanhong,liuxuan.ming,liaohongdong,xieli,liangzhikun,liaoshenghui,jlhong-yan,moxiang.tao,dengle,wangxin,zhuli.chao,zhangyuan-r02(1.lifesciencesandtechnicalinstitute,hunanuniversity,changsha410082,china;2.lifesciencescollege,hunannormaluniversity,changsha410081,china)abstractri1iiefinestrain(trichodermareeseihc-415)isstudiedinthecellulaseproductionbysubmergedfermentation.thefactorsinstrawmediumarealsostudiedaccordingtoorthogonalexperimentsonshakingbottlestage.ri1leoptimizedmedium&conditionsofproducingenzymeareconfirmed.thecellulaseactivityinfermentablesolutionisthehighestwhenthestairinoculationdosageis15%,theculturedtimeofstairstrainis24h,thepropor-tionbetweenstrawandbeancakepowderinmediumproducingcelullaseis6:1,theconcentrationofkh2po4andcac12inmediumrespectivelyis0.01g/mland0.006g/mlete.atthistime,theaveragecmcandfpenzymeactivitiesale94.62u/mland16.04u/ml.keywordsstraw;submergedfermentation;trichodermareesei;eellulase;orthogonalexperiments纤维素酶(cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称.纤维素酶在食品,饲料,纺织,农产品加工,石油开采和资源再生等方面具有广泛的用途和应用前景;特别是在利用废弃秸秆生产酒精的生物能源开发方面,具有巨大的潜在价值.湖南省农业资源优势明显,每年仅稻草的产量就有数千万吨;合理利用与转化这些纤维素资源对于解决工农业原料来源,能源危机,环境污染等具有重要的意义.本文选用液体发酵产纤维素酶的优良菌株里氏木霉hc-415_3j,在摇瓶阶段,通过正交试验等对稻草培养基中稻草粉与豆粕粉的用量,一级种接种量,一级种培养时间,二级产酶发酵时间,通气量,无机盐等因素进行了研究,确定了优化收稿日期:2009.12-03基金项目:湖南省科技厅基金资助项目(2007nk3099)通讯作者.e?mail:hnuth126.tom第1期谭宏等:利用稻草液体发酵产纤维素酶优化培养基115的培养基配方和产酶条件.为利用稻草液体深层发酵产纤维素酶的研究提供了基础的实验依据.现将结果报导如下.1材料和方法1.1菌种里氏木霉(trichodermareesei)hc-415.1.2培养基1.2.1斜面培养基pda培养基.1.2.2一级种摇瓶培养基麸皮0.02g/ml,葡萄糖0.03g/ml,(nh4)2so0.0015g/ml,ph5.56.0.1.2.3二级产酶摇瓶基础培养基稻草粉,豆粕粉,无机盐等,ph5.56.0.1.3主要仪器设备722s分光光度计;电热恒温水浴锅;universal32r台式冷冻离心机;hzqq全温摇瓶柜.1.4酶活性测定方法1.4.1羧甲基纤维素酶活性(cmcase)测定dns法,0.5ml适当稀释的酶液加入0.005g/mlcmcna溶液1.5ml.50酶解30min,加3mldns试剂.沸水浴10min显色,测还原糖.1.4.2滤纸糖酶活性(fpa)测定参照mandels,蒋传葵dns法引.1ml适当稀释的待测酶液,加入1ml0.05mol/l(ph4.6)柠檬酸盐缓冲液和1条1omx6cm新华1号滤纸.5o酶解1h,加dns试剂3ml,沸水浴10min.显色测还原糖,扣除空白后计算酶涪陛.酶液活性单位规定:1h水解生成1mg葡萄糖的酶量为1个活性单位(u).2结果与讨论2.1二级产酶培养基稻草粉与豆粕粉的用量对纤维素酶活性的影响参照文献3,此试验中一级种制备为:250ml三角瓶中,一级种培养基装量100ml,2830全温摇瓶柜中150r/min培养40h.二级产酶培养基为:250ml三角瓶中,培养基装量100ml;无机盐kh2po0.005g/ml,cac10.003g/ml,不加聚醚;一级种接种体积分数为10%,(304-1)全温摇瓶柜中140170r/min培养144h.产酶培养基稻草粉与豆粕粉的用量对纤维素酶活性的影响见表1.表1二级产酶培养基稻草粉与豆粕粉用量对纤维素酶活性的影响从表1可知,稻草粉与豆粕粉的质量比为4:1时,cmcase酶活性较高,平均为85.88u/ml;6:1时,fpa酶活性较高,平均为9.8u/ml.尽管本实验中,用豆粕粉代替了以前使用的豆饼粉,但稻草粉与豆粕粉的质量比仍与以前一样.表明作为氮源的豆饼粉与豆粕粉可以互换使用.在后面的试验中,作者选定的产酶培养基稻草粉与豆粕粉质量比为6:1.2.2一级种接种量等对纤维素酶活性影响的正交试验采用ij9(3)正交表,对一级种接种量,培养时间,二级产酶发酵时间和通气量4因素作摇瓶正交试验.二级产酶培养基中kh2po0.005g/ml,caci20.003g/ml;聚醚不加.2.2.1实验因素水平安排见表2,正交试验共进行了两批次.116湖南师范大学自然科学学报第33卷a一级种接种体积分数/%b二级产酶发酵时间/hc一级种培养时间/hd通气量(250ml瓶装量/ml)51202450l514448loo2516872l502.2.2实验结果及分析对正交试验各摇瓶编号的提取酶液,分别测定cmcase及fpa酶活性.分析时同时采用极差分l析与方差分析的方法.所得结果见表3和表4.表3一级种接种量等因子摇瓶正交试验cmc酶活性结果分析从表3看,一级种接种量等因子对cmcrise的影响,通过极差分析其顺序为d>b>a>c,最佳配方为dtb.a:c,;方差分析的显着性顺序与极差分析一致.从表4看,一级种接种量等因子对fpa酶活性的影响,极差分析与方差分析的顺序均为d>b>c>a,最佳配方则为dbca.表明在稻草培养基中,通气量与产酶发酵时间对纤维素酶的生成具有重要作用,尤其是通气量的作用最为显着,通气量d.表明hc-415菌液体发酵产纤维素酶时,耗氧量较高,这是与以前报道不一致的地方引.产纤维素酶最佳组合:一级种接种体积分数为15%,二级产酶发酵时间168h,一级种培养时间24h,通气装瓶量50ml.对比9号实验数据,两者结果基本吻合;cmcase酶活性最高平均为85.56u/ml;fpa酶活性最高平均为11.78u/ml.第1期谭宏等:利用稻草液体发酵产纤维素酶优化培养基表4一级种接种量等因子摇瓶正交试验fpa酶活性结果分析1l72.3无机盐等因素对纤维素酶活性影响的正交试验以上述实验结果为基础,采用(3)正交表,进一步研究了二级产酶发酵时间,培养基中kh:pocac1,聚醚对纤维素酶活性的影响.此正交试验中一级种接种体积分数为15%,一级种培养时间24h,二级产酶培养基装瓶量为在250ml三角瓶中装入50ml.2.3.1实验因素水平安排见表5.正交试验共进行了两批次.表5无机盐等正交试验因子及水平安排表2.3.2实验结果及分析对本正交试验各摇瓶编号的提取酶液,分别测定cmcase及fpa酶活性.分析时采用极差分析与方差分析的方法.所得结果见表6和表7.118湖南师范大学自然科学学报第33卷表7无机盐等因子摇瓶正交试验fpa酶活性结果分析第1期谭宏等:利用稻草液体发酵产纤维素酶优化培养基ll9从表6看,无机盐等因子对cmcase的影响,通过极差分析其影响顺序为c>b>a>d,最佳配方为cbad;方差分析的显着性顺序与极差分析一致.从表7看,无机盐等因子对fpa酶活性的影响,极差分析与方差分析的影响顺序则为b>c>a>d,最佳配方为bc,ad.表明稻草培养基中,khpo与cac1:对纤维素酶的生成具有重要作用,而产酶发酵时问则排到了第三位,聚醚的影响不显着.cac1:对cmcase的生成最重要;而khpo对fpa酶的生成最重要.产纤维素酶最佳组合为:kh2po0.01g/ml,cac1:0.006g/ml,二级产酶发酵时间120h,聚醚不加.对比3号实验数据,两者结果基本吻合;cmcase酶活性最高平均为94.62u/ml;fpa酶活性最高平均为16.04u/ml.有文献报道l6j,聚醚作为表面活性剂,一是可以消泡,二是能促进酶分子从菌体表面加速扩散到发酵液里,使酶合成的动态平衡向产酶方向移动,从而增加酶的活性.但本试验中聚醚的影响属于不显着,这是与报道不一致的地方.从表6,表7看,d列的kl,l<2及k3值的分布不太合规律.因此,作者认为聚醚对hc-415菌的产酶作用不会太简单,值得今后进一步研究.另外经此优化后,二级产酶发酵时间由2.2中最佳的168h缩短至120h,无疑有利于今后工业化的生产.3结论(1)采用摇瓶平行试验与正交试验相结合研究培养基的优化组成问题,对于以后利用里氏木霉hc-415菌在发酵罐中进行稻草液体深层发酵生产纤维素酶的工业化试验具有重要的指导意义.优化后的培养基组合能明显提高纤维素酶的活性并缩短发酵时间.(2)底物浓度及c/n对纤维素酶的产生有较大的影响r.由2.1实验结果,可知里氏木霉hc-415菌对稻草培养基固形物的浓度要求为0.050.07g/ml.超过0.09g/ml时,酶活性显着降低.产酶培养基中稻草粉与豆粕粉最佳用量比例为4:16:1.(3)综合2.2及2.3实验结果,可知里氏木霉hc-415菌利用稻草液体发酵产纤维素酶时,培养基的通气量,无机盐khpo,cac1和二级产酶发酵时间对纤维素酶的生成具有显着性的影响.优化后的稻草培养基最佳产酶时间能缩短2d.(4)表面活性剂聚醚在本实验中对里氏木霉hc-415菌利用稻草液体发酵产纤维素酶的影响不显着,其机理有待进一步的深入研究.参考文献:1woodtm,mccraes1.sinergismbetweenenzymesinvolvementinthesolubilizationofnativecellulosej.advchemset,1979,18(1):181-209:2leerl,paulj.microbialeellulaseutilization:fundamentalsandbiotechnonlgyj.microbiolmolbiolrev,2002,(9):506-577.3谭宏,谢小保,莫勇.里氏木霉液体发酵产纤维素酶的研究j.工业微生物,1