实验三_球菌的培养和鉴定_I.ppt

临床微生物学和微生物检验,实验三球菌的培养和鉴定,教员：顾江单位：临床微生物学教研室E-mail:jianggu2012,常见的球菌种类,球菌的检验程序,标本,直接检查（涂片、染色、镜检）,分离培养,可疑菌落,菌落特点,鉴定试验,第一次,第二次,生化结果观察荚膜染色结果讨论与分析,第三次,形态、色素、溶血,血浆凝固酶、触酶、菊糖发酵、甘露醇发酵、胆汁溶菌、小白鼠毒力试验,教学目标与要求,了解：脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的形态和染色特性理解：葡萄球菌属和链球菌属的主要生化反应原理掌握：1.葡萄球菌属、链球菌属的检验程序2.葡萄球菌属、链球菌属的分离培养与鉴定方法,重点与难点,重点：葡萄球菌属、链球菌属的检验程序和鉴定方法难点：葡萄球菌属、链球菌属的鉴别要点,本次实验内容,1.标本的直接镜检（细菌革兰染色和形态观察）2.细菌的分离培养（普通琼脂平板、血琼脂平板接种）,实验器材,一、直接检查5个标本分别涂片并革兰染色镜检,实验内容一,涂片,生理盐水,接种环,结晶紫,碘液,95%乙醇,复红,自然干燥,媒染1min,脱色30s,复染30s,干燥镜检,固定,初染1min,干燥镜检,常见致病性球菌染色特点,葡萄球菌,链球菌,双球菌,革兰阳性,革兰阳性,革兰阳性,不规则成堆排列,链状排列,矛头状成双排列,脑膜炎奈瑟球菌,淋病奈瑟菌,革兰阴性球菌,奈瑟菌染色特点：肾形或豆形，成双排列、凹面相对的革兰阴性球菌,实验内容二,细菌分离培养:(分区划线分离法),标本分别接种至普通琼脂和血平板,乙型链球菌，溶血环,肺炎链球菌，草绿色溶血环,第2区划线,第1区划线,第3区划线,分区划线分离法（三线法）,实验内容二,学员实验操作与讨论：55min分别进行涂片染色和镜检、细菌接种，并对结果进行讨论。,操作内容,一、五个标本的涂片、染色,二、将五个标本分别接种至血平板（分区划线法）,五株待测菌的主要鉴定结果,性状,革兰染色,菌落、溶血环,触酶,甘露醇发酵,1,2,3,4,5,血浆凝固酶,菊糖发酵,胆汁溶菌,诊断,小结,+，球状，不规则,+，球状，不规则,+，成双或呈链状,+，成双或呈链状,+，矛头状成双排列,1.致病性球菌的鉴定流程？2.葡萄球菌属和链球菌属的细菌染色和形态区别？,复习思考题,ThankYou!,临床微生物学和微生物检验,实验三球菌的培养和鉴定,教员：顾江单位：临床微生物学教研室E-mail:jianggu2012,球菌的检验程序,标本,直接检查（涂片、染色、镜检）,分离培养,可疑菌落,菌落特点,鉴定试验,第一次,第二次,生化结果观察荚膜染色结果讨论与分析,第三次,形态、色素、溶血,血浆凝固酶、触酶、菊糖发酵、甘露醇发酵、胆汁溶菌、小白鼠毒力试验,教学目标与要求,了解：脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的形态和染色特性理解：葡萄球菌属和链球菌属的主要生化反应原理掌握：1.葡萄球菌属、链球菌属的检验程序2.葡萄球菌属、链球菌属的分离培养与鉴定方法,重点与难点,重点：葡萄球菌属、链球菌属的检验程序和鉴定方法难点：葡萄球菌属、链球菌属的鉴别要点,本次课实验内容,细菌菌落特征观察细菌革兰染色生化反应鉴定,实验器材,实验内容一细菌菌落特征观察,大小形状突起边缘,表面溶血色素气味,完全溶血,表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,乙型链球菌,草绿色不完全溶血,甲型链球菌,肺炎链球菌,白色菌落无溶血环,葡萄球菌,链球菌,肺炎链球菌,革兰阳性,革兰阳性,革兰阳性,不规则成堆排列,链状排列,矛头状成双排列,实验内容二细菌革兰染色,球菌,球菌,球菌,革兰染色,细菌涂片,结晶紫,碘液,95%乙醇,媒染1min,脱色30s,初染1min,复染30s,干燥、镜检,稀释石炭酸复红,水洗,水洗,水洗,2,水洗,1,口诀：紫碘酒红，一一半半,实验内容二细菌革兰染色,触酶试验,甘露醇发酵试验,菊糖发酵试验,胆汁溶菌试验,血浆凝固酶试验,实验内容三生化反应鉴定,1.触酶试验【原理】H2O2H2O+O2【操作】取洁净玻片一张，滴加3H202一滴，以接种环分别取待检细菌培养物少许，在H202中磨匀，立即观察结果【结果】阳性为半分种内产生大量气泡。葡萄球菌为阳性，链球菌为阴性。【意义】触酶试验可区分葡萄球菌和链球菌。,实验内容三生化反应鉴定,过氧化氢酶,2.血浆凝固酶试验【原理】致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细胞表面生成凝块。【操作】取兔血浆和生理盐水各1滴分别滴于载玻片上，用接种环挑取细菌，混合后观察。【结果】金黄色葡萄球菌为阳性，表皮葡萄球菌为阴性【意义】,血浆凝固酶试验可区分致病性和非致病性葡萄球菌,实验内容三生化反应鉴定,3.甘露醇发酵试验【原理】致病性葡萄球菌多含有分解甘露醇的酶类，能发酵甘露醇产酸，培养基由紫色变为黄色。【操作】细菌分别接种甘露醇单糖发酵管，经37孵育18-24h观察结果。【结果】金黄色葡萄球菌为阳性，表皮葡萄球菌为阴性,血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验可区分致病性和非致病性葡萄球菌,实验内容三生化反应鉴定,4.菊糖发酵试验【原理】大多数肺炎链球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由黄色变为紫红色。【操作】细菌分别接种菊糖发酵管，经37孵育18-24h观察结果。【结果】用以区分肺炎链球菌和甲型链球菌，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。,实验内容三生化反应鉴定,5.胆汁溶菌试验【原理】肺炎链球菌可产生一种自溶酶，胆盐能活化自溶酶，加速自溶过程，引起细胞自溶。【操作】,胆汁溶菌试验可用以区分甲型链球菌和肺炎链球菌,实验内容三生化反应鉴定,37，24h,+胆盐（0.1ml）,37，0.5h,【结果】液体由混浊变透明为阳性，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。【意义】,接种细菌,【注意事项】无菌操作挑取细菌培养平板上的单个菌落进行生化鉴定。,实验内容三生化反应鉴定,本次课实验操作内容,1.5株细菌的菌落特征观察2.5株细菌的革兰染色3.5株细菌的生化反应鉴定触酶试验血浆凝固酶甘露醇发酵试验菊糖发酵试验胆汁溶菌试验,5种球菌的主要生物学性状,鉴别要点,革兰染色,触酶,1号,2号,3号,4号,5号,血浆凝固酶,胆汁溶菌试验,颜色,溶血,菌落特征,生化反应,结论,甘露醇发酵试验,菊糖发酵试验,重要的生化试验,触酶试验可区分葡萄球菌和链球菌。血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验是区分致病性和非致病性葡萄球菌。胆汁溶菌试验可区分甲型链球菌和肺炎链球菌。,小结,葡萄球菌属和链球菌属的主要菌落特征？区分葡萄球菌属和链球菌属的主要生化反应是什么？区分肺炎链球菌和甲型链球菌的生化反应是什么？,复习思考题,ThankYou!,临床微生物学和微生物检验,实验三球菌的培养和鉴定III,教员：顾江单位：临床微生物学教研室E-mail:jianggu2012,球菌的检验程序,标本,直接检查（涂片、染色、镜检）,分离培养,可疑菌落,菌落特点,鉴定试验,第一次,第二次,生化结果观察荚膜染色结果讨论与分析,第三次,形态、色素、溶血,血浆凝固酶、触酶、菊糖发酵、甘露醇发酵、胆汁溶菌、小白鼠毒力试验,本次课实验内容,生化结果观察荚膜染色结果讨论与分析,教学目标与要求,了解：脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的形态和染色特性理解：葡萄球菌属和链球菌属的主要生化反应原理掌握：1.葡萄球菌属、链球菌属的检验程序2.葡萄球菌属、链球菌属的分离培养与鉴定方法,重点与难点,重点：葡萄球菌属、链球菌属的检验程序和鉴定方法难点：葡萄球菌属、链球菌属的鉴别要点,实验器材,触酶试验,甘露醇发酵试验,菊糖发酵试验,胆汁溶菌试验,血浆凝固酶试验,实验内容一生化反应结果观察,1.甘露醇发酵试验【操作】观察第二次课接种的甘露醇发酵生化管的颜色变化，致病性葡萄球菌多含有分解甘露醇的酶类，能发酵甘露醇产酸，培养基由紫色变为黄色为阳性。【结果】金黄色葡萄球菌为阳性，表皮葡萄球菌为阴性,血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验可区分致病性和非致病性葡萄球菌,实验内容一生化反应结果观察,2.菊糖发酵试验【操作】观察第二次课接种的菊糖发酵试验生化管的颜色变化，大多数肺炎双球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由黄色变为紫红色为阳性。【结果】用以区分肺炎链球菌和甲型链球菌，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。,实验内容一生化反应结果观察,3.胆汁溶菌试验【操作】,胆汁溶菌试验可用以区分甲型链球菌和肺炎链球菌,37，24h,+胆盐（0.1ml）,37，0.5h,【结果】液体由混浊变透明为阳性，肺炎链球菌为阳性，甲型链球菌为阴性。【意义】,接种细菌,实验内容一生化反应结果观察,实验内容二荚膜染色,【实验原理】荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。,实验内容二荚膜染色,【操作步骤】制片：解剖肺炎链球菌感染的小鼠，用棉签蘸取腹腔液印片，空气自然干燥，无需加热固定。染色：滴加结晶紫液，于火焰上加温染色，使冒蒸汽为止。用20%硫酸铜溶液冲洗，勿水洗，干后油镜观察。,【实验结果】菌体紫色，荚膜淡紫色,实验内容二荚膜染色,【注意事项】不加热固定标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。,实验内容二荚膜染色,本次课实验操作内容,观察记录5种球菌的生化反应结果肺炎链球菌的荚膜染色三次系列实验课结果分析及小组讨论,5种球菌的主要生物学性状,鉴别要点,革兰染色,触酶,1号,2号,3号,4号,5号,血浆凝固酶,胆汁溶菌试验,颜色,溶血,菌落特征,生化反应,结论,甘露醇发酵试验,菊糖发酵试验,小结,标本,直接检查（涂片、染色、镜检）,分离培养,可疑菌落,菌落特点,鉴定试验,生化结果观察荚膜染色结果讨论与分析,形态、色素、溶血,血浆凝固酶、触酶、菊糖发酵、甘露醇发酵、胆汁溶菌、小白鼠毒力试验,球菌的检验程序,致病性球菌的主要生物学性状,鉴别要点,革兰染色,触酶,金黄色葡萄球菌,表面葡萄球菌,乙型