微生物生态学研究中通用引物的覆盖率评估以及高通量测序结果的自动化处理.pdf

指导小组成员名单 全哲学副教授 万方数据 目录上堕0 0 8 i i i i i l 7 i i i i i l 9 i i i i i i 。j 舢舢删脚删舢 摘要1 第一部分综述6 1 1 微生物在环境中的存在情况6 1 2 传统的微生物学研究方法6 1 4 分子生物学方法在微生物生态学研究中的应用7 1 4 基于p c r 技术的分子生物学研究方法存在的问题8 1 5 引物覆盖率评估及引物改进的必要性9 1 6 元基因组学的发展对引物覆盖率评估的数据支持1 l 1 7 高通量测序结果的分析过程一1 3 第二部分研究内容1 5 第一章通用引物的覆盖率评估及引物的改进1 5 2 1 研究背景1 5 2 2 材料与方法一1 8 2 2 1r d p 数据库中细菌1 6 sr r n a 基因序列的下载1 8 2 2 2 元基因组数据库中1 6 sr r n a 基因序列的初次筛选1 8 2 2 3 元基因组数据库中1 6 sr r n a 基因序列的二次筛选。1 9 2 2 4 序列分类2 2 2 2 5 引物结合区的确定以及引物覆盖度的评估2 2 2 3 结果与讨论2 3 2 3 1r d p 数据集中p c r 引物污染的消除2 3 2 3 2 末4 位碱基上的单错配( s i n g l em i s m a t c h ) 对引物非覆盖率的影响2 7 2 3 3 细菌域水平的引物非覆盖率3 0 2 3 4 细菌门水平的引物非覆盖率3 1 2 3 5 引物的改进4 4 2 4 结 仑4 6 第二章微生物生态学研究中高通量测序结果的自动化处理4 8 3 1 研究背景4 8 3 2 材料与方法5 1 万方数据 3 2 1 程序原理描述5 1 3 2 2 本地数据库以及分类信息的准备5 2 3 2 3 可信度检测5 3 3 2 4o t u m i s e s s 在1 8 sr r n a 基因和l t s 序列中的应用一5 3 3 t 3 结果与讨论5 3 3 3 1 整体结果展示5 3 3 2 2 程序可信度检验结果5 8 3 3 3 在1 8 sr r n a 基因和l t s 序列中的应用6 0 3 4 结 念6 2 第三部分展望6 3 参考文献6 4 致谢。7 2 附录o t u m i s e s s 结果说明。7 3 万方数据 引物的覆盖率评估及序列的自动化处理 摘要 微生物群落结构是微生物生态学研究的重要内容，分子生物学方法的应用使 得对环境中未培养微生物的研究成为了可能，促使微生物生态学研究从基于培养 的时代进入了分子生物学的时代。在分子生物学时代，我们面临的问题主要有两 个，一个是如何无偏差的从环境样品中获得序列数据，另一个是如何快速、有效 地从序列数据中提取有价值的信息。 序列数据的获得主要通过聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简 称p c r ) 进行，通过p c r 技术可以直接从总的环境样品中选择性扩增特定的基 因片段，从而对微生物群落结构进行分析。但是p c r 过程中的很多因素都会导 致有偏向性的p c r 扩增，其中引物的偏向性会引起部分微生物类型的选择性扩 增，导致该方法得到的微生物群落结构和真实情况出现偏差。全面理解各种通用 引物的覆盖率对于正确阐释p c r 结果具有重要作用。之前关于引物覆盖率的研 究基本上都是定性或半定量的，所用数据多来自r d p 等公共数据库，这些数据 库中的序列很多是通过p c r 方法得到的，数据结构已经受到p c r 引物的影响。 而且之前的研究也没有考虑引物和模板之间不同位置的错配对覆盖率的影响，尤 其是引物3 端的4 位碱基所发生的错配。 本研究对目前微生物生态学研究中面临的两个问题都进行了初步的研究。首 先在r d p 数据集和7 个元基因组数据集的基础上对8 个常用的细菌1 6 sr r n a 基因通用引物进行了非覆盖率的评估。在域的水平，每个引物在8 个元基因组数 据中的非覆盖率平均值都比相应引物在r d p 数据中的非覆盖率值要高，除2 7 f 外，其它引物的该比值都在4 以上，对于5 1 9 r 来说这个比值高达1 1 5 。在门的 水平，引物末4 位碱基的单错配( s i n g l em i s m a t c h ) 对非覆盖率显示出重要影响， 尤其是对3 3 8 f 和5 1 9 f 这两个引物，它们使3 3 8 f 在5 个门以及5 1 9 f 在1 0 个门 中的非覆盖率提高了至少2 0 。对于每个引物，我们分析了引起其高非覆盖率的 主要错配类型，以及这些错配类型在各个门中的分布，然后在这些错配类型的基 础上通过引入简并碱基或门特异性的引物序列，对6 个引物进行了改进，改进后 的引物可以覆盖更广的细菌谱。 在序列数据的处理过程中，主要问题是缺少能够全面满足微生物生态学研究 的系统化、自动化的软件。目前基于序列的微生物生态学研究主要分为两个阶段， 一个是可操作分类单元( o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t ，简称o t u ) 的定义，可以 大致提供样品的微生物多样性信息；另一个是序列的生物学分类，可以提供样品 的微生物种类信息。一般的研究都包括这两个过程，但是现有的软件基本上都只 能完成其中一个过程，满足我们的部分需求，而且大都限于1 6 sr r n a 基因序列 万方数据 复旦大学硕士学位论文 的处理。随着高通量测序技术的发展以及测序费用的下降，单次研究所要处理的 数据从几百条上升到了几万甚至几十万条，通过软件自动化的处理这些数据是广 大微生物生态学家的共同需求。 为了解决数据处理过程中的难题，我们开发了软件o t um i s e s s 。 o t um i s e s s 是一个整合了序列的o t u 定义和生物学分类的自动分析软件，除 了分析细菌和古生菌的序列( 1 6 sr r n a ) ，还能分析真核生物( 1 8 s i t s ) 和功能 基因的序列，分析过程主要分为两个阶段：第一阶段是从峰图文件中读取碱基， 经过序列质量和长度筛选之后去除载体和引物来源的序列片段，生成有效序列文 件；第二阶段是对有效序列进行分析，包括o t u 定义、微生物分类和末端限制 性片段长度分析( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n t ，简称t - r f ) 。这两个过程可以 一起进行，也可以分开进行。一次运行可以同时分析不同样品来源的数据，并且 根据来源列出不同样品的群落组成。通过对已发表文章中的8 3 4 条1 6 sr r n a 基 因序列、1 8 1 条1 8 sr r n a 基因序列以及9 7 5 条i t s 基因序列进行o t um i s e s s 分析，并和g r e e n g e n e s 以及r d p 的分类结果进行比较，我们证明了o t um i s e s s 在1 6 sr r n a 、1 8 sr r n a 以及i t s 基因序列分类功能上的可信度。 我们的工作对分子生物学方法在微生物生态学研究中的应用所面临的两个 阶段的问题进行了初步研究，为了更深入的解决这些问题，使分子生物学方法能 够更好地服务微生物生态学研究，我们将把引物评估的流程程序化、构建专门的 处理元基因组数据的网站、优化o t um i s e s s 在数据处理方面的功能。 关键词：微生物群落结构；引物非覆盖率；1 6 sr r n a ：元基因组；可操作分类 单元( o t u ) ；微生物分类 中图分类号：q 9 3 万方数据 引物的覆盖率评估及序列的自动化处理 a b s t r a c t t h es t u a yo fm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ei s i m p o r t a n tf i l e do fm i c r o b i a l e c o l o g y t h ea p p l i c a t i o no fm o l e c u l a rm e t h o d sm a d ei tp o s s i b l et os t u d yt h e u n c u l t u r e dm i c r o o r g a n i s m si nt h ee n v i r o n m e n ta n dp u s h e dt h es t u d yo fm i c r o b i a l e c o l o g yf r o mc u l t u r e d e p e n d e n tp e r i o dt om o l e c u l a rb i o l o g i c a la g e i nt h ea g eo f m o l e c u l a rb i o l o g y , t h e r ea r et w om a j o rp r o b l e m sw ea r ef a c i n g ：o n ei sh o wt og e t m o l e c u l a rs e q u e n c e sf r o me n v i r o n m e n ta u t h e n t i c a l l y , t h eo t h e ri sh o wt og e tv a l u a b l e i n f o r m a t i o nf r o ms e q u e n c ed a t aq u i c k l ya n de f f e c t i v e l y t h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n0 1 c r ) i st h em o s tc o m m o nw a yt oo b t a i n s e q u e n c ed a t a s p e c i f i cs e q u e n c ef r a g m e n tc a nb ea m p l i f i e df r o mt o t a le n v i r o n m e n t a l s a m p l e sd i r e c t l yt h r o u g hp c ra n du s e df o rt h ef u r t h e rm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e a n a l y s i s h o w e v e r , v a r i o u sp a r a m e t e r sd u r i n gp c rw i l ll e a dt ob i a s e da m p l i f i c a t i o n a n dt h eb i a sc a u s e db yt h es e q u e n c es p e c i f i c i t yo f t h e p r i m e rw i l lr e s u l ti np r e f e r e n t i a l a m p l i f i c a t i o na n dl e a dt o ad e v i a t i o nf r o mt h et r u e c o m m u n i t ys t r u c t u r e a c o m p r e h e n s i v eu n d e r s t a n d i n go ft h ec o v e r a g er a t eo fp r i m e r si sc r u c i a lt ot h ec o r r e c t i n t e r p r e t a t i o no fp c rr e s u l t s t h o u g ht h e r eh a v e b e e ns t u d i e sa b o u tt h ec o v e r a g er a t e o fs o m ep r i m e r s ，m o s to ft h e mw e r eq u a l i t a t i v eo rs e m i q u a n t i t a t i v ea n dd e p e n d e n to n s e q u e n c e sf r o mp u b l i cd a t a b a s e so n l y m a n yo ft h es e q u e n c e sf r o mp u b l i cd a t a b a s e s u c ha sr i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e c t ( r d p ) w e r ep r o d u c e db yp c ra n dt h ed a t a s t r u c t u r eh a sb e e ni n f l u e n c e db yp c r p r i m e r s f u r t h e r m o r e ，e a r l i e rs t u d i e sh a v e n t t a k e nt h ep o s i t i o no fp r i m e r - t e m p l a t em i s m a t c hi n t oa c c o u n t ，e s p e c i a l l yt h es i n g l e m i s m a t c ho f t h e4n u c l e o t i d e sa tt h e3 e n do f p r i m e r i nt h i s s t u d y , t h et w op r o b l e m si n m i c r o b i a l e c o l o g yw e r ei n v e s t i g a t e d p r e l i m i n a r y t h eu n - c o v e r a g er a t e so f8c o m m o n l yu s e du n i v e r s a lp r i m e r so fb a c t e r i a w e r ee v a l u a t e db a s e do nt h er i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e c t ( r d p ) d a t a s e ta n ds e v e n m e t a g e n o m i cd a t a s e t sa tb o t hd o m a i na n dp h y l u ml e v e l a tt h ed o m a i nl e v e l ，t h e a v e r a g eo fu n c o v e r a g er a t e sf o rt h em e t a g e n o m i cd a t a s e t sw e r e4t i m e sa sh i i g ha st h e c o r r e s p o n d i n gu n c o v e r a g er a t ef o rt h er d p d a t a s e tf o r7p r i m e r s ( p r i m e r se x c e p t2 7 f ) ， a n dt h er a t i or e a c h e d11 5f o rp r i m e r519 r a tt h ep h y l u ml e v e l ，s i n g l em i s m a t c h e so f t h el a s t4n u c l e o t i d e sa tt h e3 p r i m e re n dg r e a t l yi n f l u e n c e dt h eu n c o v e r a g er a t e t h e s em i s m a t c h e si m p a c t e dt h es u c c e s s f u lp c r a m p l i f i c a t i o no fa tl e a s t2 0 o ft h e s e q u e n c e si n5p h y l aw h e nu s i n gp r i m e r3 3 8 fa n d1 0p h y l aw h e nu s i n gp r i m e r5 1 9 f s e q u e n c et y p e sr e s p o n s i b l ef o rt h eh i i g hu n c o v e r a g er a t eo fe a c hp r i m e rw e r e a n a l y z e d a n de i g h tp r i m e r sw e r e i m p r o v e d w i t hi n t r o d u c t i o no f d e g e n e r a t e 万方数据 n u c l e o t i d e s f o re a c hp r i m e r , s e q u e n c et y p e sr e s p o n s i b l ef o rt h eh i g hu n c o v e r a g er a t e a n dt h e i rd i s t r i b u t i o ni nd i f f e r e n tp h y l aw e r ea n a l y z e d i nt h ee n d6p r i m e r sw e r e i m p r o v e dt oa i m a tab r o a d e rb a c t e r i a ls p e c t r u mw i t ht h ei n t r o d u c t i o no fd e g e n e r a t e n u c l e o t i d e sa n dp h y l u ms p e c i f i cp r i m e rm e m b e r s t h em a i np r o b l e md u r i n gt h em a n a g e m e n t o fs e q u e n c ed a t ai st h el a c ko fa s y s t e m a t i c a n da u t o m a t i cp r o g r a mt h a tc o u l dm e e tt h ed e m a n d so fm i c r o b i a l e c o l o g i c a ls t u d yc o m p r e h e n s i v e l y t h e r ea r et w om a j o rs t e p si ns e q u e n c ep r o c e s s i n g ： o n ei st h ea s s i g n m e n to fo p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t ( o t u ) w h i c hc o u l dp r o v i d et h e i n f o r m a t i o no fm i c r o b i a ld i v e r s i t yo fe n v i r o n m e n t a ls a m p l e s ；t h eo t h e ri sm i c r o b i a l i d e n t i f i c a t i o no fs e q u e n c e ，w h i c hc o u l dp r o v i d et h ei n f o r m a t i o no fm i c r o b i a ls p e c i e s a n dc o m m u n i t ys t r u c t u r e t h et w os t e p sa r ei n c l u d e di nm a n ys t u d i e sw h i l em o s t e x i s t i n gp r o g r a m sc a nf i n i s ho n l yo n eo f t h es t e p sa n d m e e tp a r to fo u rd e m a n d s w i t h t h ed e v e l o p m e n to fh i g h t h r o u g h p u ts e q u e n c i n gt e c h n i q u e sa n dt h ed e c l i n eo f s e q u e n c i n gc o s t s ，s e q u e n c e si n as i n g l es t u d yh a v ei n c r e a s e df r o mh u n d r e d st o t h o u s a n d sa n de v e nm i l l i o n s i ti st h ec o m m o nd e m a n do fm i c r o b i a le c o l o g i s t st od e a l t h e s ed a t aw i t hs o f t w a r ea u t o m a t i c a l l y w ed e v e l o p e ds o f t w a r eo t um i s e s sf o rt h ep r o c e s s i n go fs e q u e n c e d a t a o t um i s e s si sa ni n t e g r a t e dt o o lf o ro t ua s s i g n m e n ta n dm i c r o b i a li d e n t i f i c a t i o no f s e q u e n c e sf r o me n v i r o n m e n t a ls a m p l e s i tc a n d e a lw i t h16 sr r n a g e n es e q u e n c e so f b a c t e r i aa n da r c h a e a ，18 sr r n a i t sg e n es e q u e n c e so fe u c a r y aa n ds e q u e n c e so f p r o t e i n c o d i n gg e n e s o t u m i s e s si n c l u d e st w oi n d i v i d u a ls t e p s i nt h ef i r s ts t e p ， r e l i a b l es e q u e n c e sa r eg e n e r a t e df r o mi n p u tc h r o m a t o g r a mf i l e sa f t e rb a s e c a l l i n g ， l e n g t ha n dq u a l i t yc h e c k i n g ，v e c t o ra n dp r i m e rr e m o v i n g i nt h es e c o n ds t e p ，r e l i a b l e s e q u e n c e sa r ea n a l y z e d ，i n c l u d i n go t ua s s i g n m e n t ，m i c r o b i a l i d e n t i f i c a t i o na n d t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n t ( t - r f ) l e n g t ha n a l y s i s t h et w os t e p sc a nr u ns e p a r a t e l y o rt o g e t h e r s e q u e n c ed a t af r o md i f f e r e n ts a m p l e sc a na l s o r u nt o g e t h e ra n d c o m m u n i t ys t r u c t u r eo fe a c hs a m p l ew i l l b el i s t e ds e p a r a t e l y w ec o n f i r m e dt h e t a x o n o m i ca s s i g n m e n tr e l i a b i l i t yo fo t um i s e s si n 16 sr r n a ，18 8r r n aa n di t s g e n es e q u e n c e sw i t h8 3 416 sr r n ag e n es e q u e n c e s ，1 8118 sr r n ag e n es e q u e n c e a n d 9 7 5i t sg e n es e q u e n c e sp u b l i s h e d f o rf u r t h e rs o l u t i o no ft h ep r o b l e m si nm i c r o b i a le c o l o g ya n a l y s e sa n dm a k et h e f u l lu s eo fm o l e c u l a rm e t h o d si nm i c r o b i a le c o l o g ys t u d i e sw ew i l ld e v e l o pap r o g r a m f o rt h ee v a l u a t i o no fp r i m e ru n - c o v e r a g er a t e ，b u i l daw e b s i t ef o rt h em a n a g e m e n to f m e t a g e n o m i cd a t a ，o p t i m i z et h ef u n c t i o no fo t u m i s e s si nd a t ap r o c e s s i n g 4 万方数据 引物的覆盖率评估及序列的自动化处理 k e y w o r d s ：m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e ；u n c o v e r a g er a t eo f p r i m e r ；16 sr r n a g e n e ；m e t a g e n o m e ；o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t ；m i c r o b i a li d e n t i f i c a t i o n c l a s s i f i c a t i o nc o d e ：q 9 3 5 万方数据 复旦大学硕士学位论文 第一部分综述 微生物在环境中的存在情况 微生物是一类个体微小( 一般 3 0 0 ，0 0 0 ，序列平均长度8 0 0 n t 的 数据库，分别为：a n t a r c t i c a a q u a t i c ( 南极洲水样) ，a c i d m i n e ( 酸性采矿废水样 品) ，b i s o n m e t a g e n o m e ( 黄石公园温泉样品) ，g o s ( 环球海水样品) ，g u t l e s s w o r m ( 地中海寡毛纲蠕虫共生微生物) ，h u m m a g u t ( 人类直肠末端) 以及h o t ( 夏 威夷海洋样品) 。 2 2 2 2 潜在的1 6 sr r n a 基因序列获取 由于1 6 sr r n a 基因序列在元基因组数据库中的比例很低，直接下载整个数 据库进行筛选工作量较大，我们选择用b l a s t ( b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht 0 0 1 ) 对潜在的1 6 sr r n a 基因序列进行一次初级筛选。为了尽可能完整的获得元基因 组数据库中的潜在1 6 sr r n a 基因序列，我们用3 4 个不同门的近全长细菌1 6 s r r n a 基因序列做成一个代表序列组作为b l a s t 的待查询序列( q u e r ys e q u e n c e ) 。 然后通过c a m e r a 自带的b l a s t 功能，以代表序列组分别对7 个元基因数据 库进行b l a s t 搜索，参数设置：d ba l i g n m e n t sp e rq u e r y ：5 0 0 0 0 ；e v a l u ee x p o n e n t ( 1 e x ) ：- 5 ；f i l t e rl o w - c o m p l e x i t ys e q ：t ；l o w e rc a s ef i l t e r i n g ：f a l s e 。g o s 数据库由于 数据量过大，用代表序列组进行搜索的话返回的序列数将超过上限，而超出部分 万方数据 引物的覆盖率评估及序列的自动化处理 无法下载，因此用3 4 条代表序列分别对g o s 数据库进行搜索。以数据库为单位， 下载b l a s t 返回的序列，去除重复和含有碱基“n ”的序列，把不含碱基“n ” 的非重复序列放到一个f a s t a 文件中，形成7 个潜在1 6 sr r n a 基因序列的 f a s t a 文件。 2 2 3 元基因组数据库中1 6 sr r n a 基因序列的二次筛选 通过b l a s t ，我们从7 个元基因组数据库中得到了7 组潜在的细菌1 6 s r r n a 基因序列，然后用序列比对( a l i g n m e n t ) 和生物学分类( c l a s s i f i c a t i o n ) 对这些潜在序列进行二次筛选，以获取比较可靠的、可用于引物覆盖率评估的细 菌1 6 sr r n a 基因序列。这一步主要通过软件包m o t h u r 中的程序进行【6 3 1 。m o t h u r 网站对s l v a 数据库中的s s ur r n a 基因序列进行筛选和比对，提供了三个含 有分类信息的标准s s ur r n a 基因序列的a l i g n m e n t 文件，分别为细菌1 6 s 、古 菌1 6 s 和真核生物1 8 s 的序列( h t t p ：w w w m o t h u r o r g w i k i m a i np a g e ) 。我们把 这三个s s ur r n a 基因序列的文件合并成一个大的文件，命名为“s i l v a , s s u f a s t a ”。 同时，从s i l v a 数据库中下载大亚基核糖体r r n a 基因的序列( 包括2 3 s 和2 8 s ) ( _ h t t p ：w w w a r b - s i l v a d e ) ，命名为“s i l v a l s u f a s t a ”。 通过m o t h u r 软件包中的“a l i g n s e q s ”命令将初筛得到的潜在1 6 sr r n a 基 因序列及其反向互补序列分别和“s i l v a s s u f a s t a ”及“s i l v a l s u f a s t a ”做序列 比对。对于每一个序列名，得到4 个比对结果，即：原始序列和“s i l v a s s u f a s t a ”， 原始序列和“s i l v a l s u , f a s t a ”，反向互补序列和“s i l v a s s u f a s t a ”，反向互补序 列和“s i l v a , l s u f a s t a ”的比对结果。每一次比对得到一个“a l i g n m e n ts c o r e ”，通 过比较4 个a l i g n m e n ts c o r e ，确定产生最大s c o r e 的那次比对所用的序列和数据 库。如果这个最大的s c o r e 3 0 ，则这条序列来自核糖体r r n a 基因的概率很小， 因此把这种序列排除。反之，确定序列的来源与方向，即产生最大s c o r e 的那次 a l i g n m e n t 所用的序列是最佳方向的序列，相对应的数据库则表示序列来自s s u 还是l s u 。以元基因组数据库为单位，将所有来源是s s u 的序列从最佳方向的 a l i g n m e n t 结果中抽提出来并合并成一个文件，命名为“x x x s s u a l i g n ”( “x x x ” 表示不同的元基因组数据库名称) 。此即来源于元基因组数据库的s s ur r n a 基 因序列，也称为“元基因组数据集”。 万方数据 o n (亨e口时。醪 o。g。11丁o一_【ihoiio矗_。苫一一 h v 西v (苔ouotl叮o勺。一cigq be口时og o。iio；叮uo一_iioiio砖_dh之一一g屯四。配oogo；叮uol_iio口o硝_o_三li(he日时n霞ii；polo一【lio岛o啼_o苫一一ceq时吐“oq鼍goh砭goh之= e屯田d应liripooo一_【iioiio时_oh占一一 q墨o，igo一蔷茜。一矗ogi工口器oo一参舟雹。舞瓮og。ii占釜lu；g暑。u一曩口。jo一毫 一。雹 芑曲一呈cl o旨。一莒d r b 长一q i i 时g ；墨 菩o时gri墨 hiiolj。“日_。h昌ii“n季的嘞。一_j10 ii瞄。ii时-。葛屯。岂 星p乒。一_n。 iio召一屯。盆x丑ii一一(i舞-【l喇ooo一对cioomii一召雹go一oil旦事。一一mgo盘。iiioiio时苗q舀gd器龇g。嘲高。龇【i一妥q。urq茜prq o o 。量oiiq墨。q占iio一og一蔓po ogogo比go可茜一盘(103一q舀。一瓮=叮时31苗磊善 o一苗；叮时o_芑蠢_111q 副脉黑世 聪米 世曙糕困醐恨 o(芯un墨罨窭。ui暑剑薹。若匿夏山蓦u皿辗v嚼逛罴牯靠f襄黎黑函荆唳岛旺怒廿迥鞋斟涮晔察而：搽愀皋犁孙二f醛外k删聪 万方数据 要蚕要量基至 詈詈 磊毯 nn n n 凹净 x “ 。n一工卜uo两hboihu o 矗。轨 n。u盔h_doloo u _ d o o u 7 n n - 工h hoo一h呈u日工vu卜ouo。n 一o o o g u o o u ouu宙hv工o。n n6亩-工ooo o u u d 目商u o u 。s n_工ooohou u p u u o h u o 。n -o_duoooo ou5u扣on g n 乱寸一 岔寸。2 醴。乱c i 鼍壹 【 互心6)卜。乱 圜葛 岔心承)凹岔一” c _ o u u oo卜茗净hqo一lhoon叫舀n一净u【_【 ，)皿卜n 茬议种媳 迥如姆岛叫困 醐弓当崎_【粗 鞋鐾k 始堰惮 砥世黎赤 副粼壤渡 藩婚s 而 。i幺ohi澎。uj窆工ui。键烈譬醐髻撒坦。晕高曲状删迥如好岛q函醐藿u_【(17qu蕊心星u奄裔v祖宾龌k始蜷博息n苫醐髻棣坦嗽迥n_【援净醐餐状蛙嗽逍h【拣盘兽n惰悄；苫2净-【h、器世吾翠甚基状臣n墨剥粼g状埋惜僻站廿奸k露哩n删牮g霉而挂醐髻状遁憾馔蚪糕g岳婴1。剥粼状埋，博。婢旺靶球岛蟀而蟮状馋翟g廿妒辖旧呈f婚器而导靼1。睡器而：婚。器而旺喇困醐蚕_i【租导午喾妲拳基廿妖匿恃n心群 剐议芒需皿垤最坎隧蟮拳糌捆群嚣晕而 万方数据 复旦大学硕士学位论文 2 2 4 序列分类 r d p1 6 sr r n a 基因序列和元基因组的s s u r r n a 基因序列分别通过m o t h u r 的“c l a s s i f y s e q s ”命令进行分类。分类之前，“r d p 数据集”先和“s i l v a s s u f a s t a ” 进行序列比对，把a l i g n m e n ts c o r e 8 0 视为分类结果可信，以此确定每条序列所属的门。 2 2 5 引物结合区的确定以及引物覆盖度的评估 因为m o f l a u r 提供的s i l v a 数据库中的序列是经过剪切的，只包含了