持续压力对兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响---优秀毕业论文 参考文献 可复制黏贴.pdf

分 类 号 分 类 号 学号 学号 d200978205 学校代码 10487 学校代码 10487 密级 密级 博士学位论文 持续压力对兔椎间盘髓核细胞线粒体 及细胞外基质合成代谢的影响 持续压力对兔椎间盘髓核细胞线粒体 及细胞外基质合成代谢的影响 学位申请人： 丁 凡 学 科 专 业 ： 外科学（骨科） 指 导 教 师 ： 邵增务 教授 答 辩 日 期 ： 2012 年 4 月 学位申请人： 丁 凡 学 科 专 业 ： 外科学（骨科） 指 导 教 师 ： 邵增务 教授 答 辩 日 期 ： 2012 年 4 月 a dissertation submitted to huazhong university of science and technology for the degree of doctor of medicine sustained compression on the metabolism of mitochondrial and extracellular matrix synthesis of the rabbit nucleus pulposus cells d.candidate: fan ding major: surgery （orthopedics） supervisor: pro.f zeng-wu shao huazhong university of science alginate; intervertebral disc the isolation and culture of primary chondrocytic cells in intertevertebral disc and the establishement of co-culture objective：to investigate the effects of notochordal cells on the proliferation and matrix anabolism of chondrocytic cells in a co-culture system of no direct cellular interaction in vitro. methods：the nucleus pulposus tissues were obtained from the thoracolumbar spine of 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 10 4-week-old japanese white rabbits under the sterile conditions, and the notochordal cells and chondrocytic cells were isolated by the collagenase digestion and discontinuous density gradient centrifugation. the chondrocytic cells at second generation and the notochord cells were co-cultured in the transwell chamber device with a ratio of 1:1，the chondrocytic cells cultured in monolayer as control group. after 1，3, 7 and 10 days of co-culture, the morphologic feature was observed with inverted phase-contrast microscopy. the phenotype of chondrocytic cells was confirmed by immunofluorescence, cck-8 was used to determine the cell proliferation, and the expression of collagen type and aggrecan was detected by rt-pcr. results：the notochord cells and chondrocytic cells were successfully isolated. the notochord cells was round or oval in shape and approximately 1015m in diameter, which had many cytoplasmic vesicles. while the chondrocytic cells were smaller than the former, they appeared short spindle and had a diameter of 46m. with the along of co-culture durations, the growth of the chondrocytic cells was accelerated apparently, it was obvious for 7, 10 days （p0.05） ; and the expression of collagen type and aggrecan was increased gradually. conclusion：the notochord cells could promote the proliferation of the chondrocytic cells in a co-culture system and may play an important role in preventing the degeneration of disc. key words：notochord cell; chondrocytic cells; nucleus pulposus 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 11 part sustained compression on the metabolism of mitochondrial and extracellular matrix synthesis of the rabbit nucleus pulposus cells with monolayer culture objective： the purpose of this study was to investigate whether the mitochondrial pathway is involved in compression-induced apoptosis of rabbit np cells. methods： the compression apparatus was used to investigate the effect of the compression in this process at one magnitude (1.0 mpa) for 6, 12, 18, 24 and 36 h. cell viability was measured by cell counting kit-8 (cck-8). apoptosis rate was analyzed by flow cytometry and the morphologic changes in apoptosis cells were observed by the phase-contrast microscopy. the apoptosis-related gene and protein synthesis, such as bax, bcl-2 and caspase-3, was analyzed by real-time polymerase chain reaction (rt-pcr) and western-blot, respectively. the protein expression of collagen type and aggrecan in extracellular matrix (ecm) was detected by western-blot in np cells. mitochondrial function was evaluated by analyzing the mitochondrial permeability transition pore (mptp), as well as reactive oxygen species (ros) and mitochondrial membrane potential (mmp). results：the results indicated that compression at the magnitude of all time points reduced the vitality of np cells and the protein expression of collagen type and aggrecan was decreased by it significantly. and it also induced apoptosis of rabbit np cells in a 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 12 time-dependent manner. furthermore, the compression at this level profoundly suppressed the functions of the mitochondria such as the opening of mptp, the excessive production of ros and the decreased mmp. conclusion：our findings suggest that this compression not only inhibited the synthsis metabolism of ecm, but also induced the apoptosis of np cells. mitochondrial pathway possibly involved in the apoptosis of np cells. and the compression-induced ivd degeneration is mediated, at least in part, via the mitochondrial apoptotic pathway in np cells. key words：mitochondria; nucleus pulposus; apoptosis; compression part sustained compression on the metabolism of mitochondrial and extracellular matrix synthesis of the rabbit nucleus pulposus cells which cultured in alginate objective: the purpose of this study was to investigate the effects of sustained compression on mitochondrial function and related gene expression in np cells. methods: the rabbit np cells were isolated and cultured in alginate beads. the np cells were exposed to static compression at 1.0 mpa for 12, 24, 36, 40 and 48 h. the mitochondrial dehydrogenase activity of np cells was analyzed by microplate reader. 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 13 related gene expression was detected by specific staining and real-time polymerase chain reaction (rt-pcr). results: this compression in each time points decreased the mrna expression of extracellular matrix such as aggrecan and induced the apoptosis of np cells. in addition, the pressure can significantly inhibit mitochondrial function of np cells, such as the reduced mitochondrial dehydrogenase activity. conclusion: this static compression profoundly inhibited the extracellular matrix synthesis metabolism and mitochondria dehydrogenase activity and induced the apoptosis of np cells. these findings suggest that the mitochondrial pathway, at least in part, is involved in this pathological progression which is initiated by compression. key words: mitochondria, nucleus pulposus, intertevertebral disc 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 14 正 文 正 文 第一部分 原代椎间盘髓核细胞的体外分离及培养 第一部分 原代椎间盘髓核细胞的体外分离及培养 目前对椎间盘退行性改变的原因研究较多，但其确切机制仍然不是很明确。近年 来有研究表明椎间盘退变性疾病通常源于髓核细胞的老化或凋亡。正常人约 10 岁前 髓核组织内存在有两种细胞，即脊索细胞和软骨样细胞，主要以前者为主。但在 10 岁以后脊索细胞逐渐消失，几乎完全被软骨样细胞所取代。一般认为脊索细胞为终末 期退化细胞，在人类一生的活动中不能发挥重要作用。但近年来有大量研究提示脊索 细胞可能为胚胎时期脊索组织的残留， 且认为其可能在椎间盘退行性变的发生及组织 工程学修复中起着重要作用。本研究将对原代脊索细胞进行体外分离和培养，通过观 察脊索细胞的生物学特点， 为椎间盘退变机制及组织工程学髓核方面的研究提供一定 的实验依据。 椎间盘退行性变的发生是一个多因素共同参与而引起的对椎间盘结构造成进行性 损害的慢性过程，进而影响椎间盘正常的生理功能。退变椎间盘共同的病理特点表现 为髓核细胞的数量的减少和功能的退变，从而引起其合成和分泌的型胶原、蛋白多 糖等基质成分的降解丧失，最后引起椎间盘内结构、生物力学功能的异常及退变的加 速。尽管椎间盘退变的确切机制仍然不是很清楚，但目前普遍认为髓核细胞在维持椎 间盘结构和功能的完整方面所起的核心作用。 我们通过对两种髓核细胞进行非接触共 培养,来观察脊索细胞对软骨样细胞增殖的影响，探讨二者的生物学特点及意义。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 15 材料与方法材料与方法 一、实验材料及主要仪器一、实验材料及主要仪器 1 原代椎间盘髓核细胞原代椎间盘髓核细胞 原代细胞的取材、分离及培养详见实验方法 2 细胞培养所需的主要试剂细胞培养所需的主要试剂 1) 基础培养基液体（dulbeccos modified eagles medium, dmem/f12） 购自 gibco 公司 其中含 l-谷氨酰胺和 15mm hepes, 不含碳酸氢钠, 保存于 4 冰箱 2) 胎牛血清 500 ml/瓶 购自 gibco 公司 其中含内毒素较低（5eu/ml）, 细胞克隆率80%，-20冰箱保存 3) 无菌双蒸水 取自协和医院供应室 4) pbs 缓冲液粉末（ph 7.27.4） 购自武汉博士德生物有限公司 保存于 4冰箱 5) 青霉素-链霉素双抗 购自 sigma 公司 保存于 4冰箱 6) 胰蛋白酶粉末及型胶原酶粉末 购自 sigma 公司 保存于 4冰箱 7) 细胞计数试剂盒 cck-8 购自碧云天生物技术公司 保存于 4冰箱 8) l-谷氨酰胺 购自 amresco 公司 保存于 4冰箱 9) 抗坏血酸/维生素 c 购自武汉博士德生物公司 10) 乙二胺四乙酸 edta 购自 amresco 公司保存于 4冰箱 11) 藻酸盐（alginic acid salt, from brown algae） 购自美国 sigma 公司 12) 氯化钠（sodium chloride） 购自天津市大茂化学试剂厂 13) 柠檬酸钠 (trisodium citrate dehydrate) 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 16 购自上海豪申化学试剂有限公司 14) 无水氯化钙（calcium chloride anhydrous） 购自天津市博迪化工有限公司 15) 1%多聚赖氨酸溶液 购自美国 sigma 公司 16) 钙黄绿素（calcein-am）/碘化丙啶（propidium iodide, pi） 购自美国 sigma 公司 17) 通透液：0.1%triton-x100 购自武汉博士德生物技术公司 18) 缓冲甘油封固剂 购自 sigma 公司 19) 即用型 sabc 免疫组化染色试剂盒 购自武汉博士德生物公司 20) fitc 荧光染料 购自武汉博士德生物技术公司 21) 逆转录试剂盒 日本 toyobo 公司 22) 定量 pcr 试剂盒 日本 toyobo 公司 23) 型胶原抗体 购自北京博奥森生物技术有限公司 24) 量子点超敏荧光试剂盒 购自武汉嘉源量子点技术开发有限公司 3 实验用试剂的配置实验用试剂的配置 1) pbs 缓冲液: 将从试剂公司购买的已配好的 pbs 粉末放入 2000ml 无菌双蒸水中， 将装有液体的烧杯置于恒温磁力加热搅拌器上匀速搅拌混匀液体， 见液体混匀后， 调整 ph 值在 7.27.4 之间，最后将混匀的液体分装至无菌玻璃瓶中高压灭菌 （121.5, 30min）,冷却后放于 4冰箱保存备用。 2) 含 15%胎牛血清培养基：超净工作台内将 500ml 的 gibco 胎牛血清分装成 15ml 每小瓶，放入-20冰箱中保存备用。使用前先过夜解冻小瓶血清，配置含血清培 养基时，先用无菌注射器抽取 85ml dmem/f12 基础培养基，再加入 15ml 解冻的 胎牛血清，最后加入 1ml 青霉素-链霉素双抗溶液（100）即可。将配置好的含 血清培养基放于 4冰箱保存备用。 3) 0.25%胰蛋白酶溶液：用电子天平称取 0.25g 胰蛋白酶粉末，将其放入 100ml 无 菌 pbs 溶液中，磁力加热搅拌器充分匀速混匀后用无菌滤器过滤分装即可。将配 置好的胰蛋白酶溶液放于-20冰箱中保存备用。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 17 4) 含0.02%edta的胰蛋白酶溶液： 用电子天平分别称取0.25g胰蛋白酶粉末及0.02g 的 edta 粉末， 将其放入 100ml 无菌 pbs 溶液中， 磁力加热搅拌器充分匀速混匀 后用无菌滤器过滤分装即可。将配置好的胰蛋白酶溶液放于-20 冰箱中保存备 用。 5) 0.2%型胶原酶溶液：用电子天平称取 100mg 的型胶原酶粉末，无菌超净工作 台内放于 50ml 的 dmem/f12 基础培养基中，再放置于磁力加热搅拌器上充分混 匀，无菌滤器过滤分装，最后将配置好的 0.2%型胶原酶溶液放于-20冰箱中 保存备用。 6) 低粘度藻酸盐溶液：根据参考文献要求，先用电子天平称取适量的藻酸盐粉末， 再将其放入 100ml 氯化钠溶液中，置于磁力加热搅拌器上均匀搅拌约 10min 后可 见充分溶解， 最后将混匀的液体分装至无菌玻璃瓶中高压灭菌 （121.5, 30min） , 冷却后放于 4冰箱保存备用。 7) 102mml/l 氯化钙溶液：根据参考文献要求，用电子天平上称取适量 cacl2粉末， 将其放入 200ml 三蒸水中，置于磁力加热搅拌器上充分混匀至完全溶解，最后将 混匀的液体分装至无菌玻璃瓶中高压灭菌（121.5, 30min）,冷却后放于 4冰 箱保存备用。 8) 55 mm 柠檬酸钠溶液：根据参考文献要求，于电子天平上称取适量的柠檬酸钠粉 末充分混匀至完全溶解，将其放入 200ml 氯化钠溶液中，置于磁力加热搅拌器上 均匀搅拌至充分溶解， 最后将混匀的液体分装至无菌玻璃瓶中高压灭菌 （121.5, 30min）,冷却后放于 4冰箱保存备用。 9) 10mm tbs(ph 7.27.4)的配制： 分别于电子天平上准确称取 1.21g 三羟基氨基甲 烷和 7.6g 氯化钠，放入 500ml 烧杯后加入 800ml 双蒸水，使用浓盐酸调节 ph 值 至 7.27.4，最后定容到 1000ml，放于 4冰箱保存备用。 10) tbs-t 溶液的配制： 将配好的 tbs 溶液与 tween 20 以 0.05%的体积比混匀即可， 放于 4冰箱保存备用。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 18 4 实验所需的主要仪器设备及耗材实验所需的主要仪器设备及耗材 1) 倒置相差显微镜 日本 olympus 2) 多功能酶标仪 美国 bio-tek 公司 3) 超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 4) co2 细胞培养箱 德国 heraeus 公司 5) 电子分析天平（型号：bs 224s） 德国 sartorius 公司 6) 6 孔、24 孔及 96 孔细胞培养板 美国 nest 公司产品 7) 50ml 细胞培养瓶 美国 nest 公司产品 8) 细胞计数板及盖玻片 武汉博士德生物公司 9) 枪头和枪头盒 武汉洁洋盛生物公司 10) 大、 中、 小号手动单道移液器 （量程分别为： 1001000 l/20200 l /0.510l） 德国 eppendorf 公司 11) 荧光显微镜 日本 olympus 12) 15ml 锥形离心管 美国 nest 公司产品 13) 0.22m 无菌滤器 美国 millipore 公司产品 14) 称量纸 购自武汉化学试剂公司 15) 电热鼓风干燥箱（型号：yla-6000） 上海医用仪表厂 16) 大容量水平离心机 北京白洋医用离心机有限公司 17) 手提式不锈钢蒸汽消毒器 杭州汇尔仪器设备有限公司 18) 磁力加热搅拌器 上海沪西公司 19) 电热恒温水温箱 北京长安科学仪器厂 20) 台式恒温振荡器 上海贺德实验设备厂 21) 台式高速冷冻离心机（型号 neofuge 15r） heal force 公司 22) pcr 仪（型号：life express thermal cycler） 杭州生物技术有限公司 23) 荧光定量 pcr 仪（名称：slan 荧光定量 pcr 检测系统） 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 19 上海宏石医疗科技有限公司 24) 匀浆器 购自武汉协和医院器材科 25) transwell 小室 美国 costar 公司产品 二、实验方法及检测步骤 二、实验方法及检测步骤 原代脊索细胞的体外分离及培养 原代脊索细胞的体外分离及培养 1.细胞的体外分离及培养:.细胞的体外分离及培养: 4 周龄日本大白兔（购自湖北省疾病控制中心） ，空气栓 塞处死后置于 75%酒精中浸泡消毒 23min。 取俯卧位， 无菌条件下切取胸腰段脊柱， 75%酒精浸泡后以磷酸盐缓冲液（pbs，ph 值 7.27.4）反复冲洗。实验参照文献 1-3 进行。手术刀依次切开椎间盘纤维环，用无菌小刮匙刮出胶冻样米粒大小髓核组织， 置于含 dmem/f12 培养基的培养皿中，剪成碎块后移至培养瓶中；用 0.2% 型胶原 酶消化剪碎的髓核组织， 37培养箱中消化 30min。 200 目滤网过滤后两次离心 （5min， 1200r/min）收集沉淀细胞，再以 percoll 不连续密度梯度法分离获取纯化的脊索细胞。 以含 15% 胎牛血清的 dmem/f12 培养基（均为美国 gibco 公司）制成细胞悬液后接 种至 50ml 细胞培养瓶中，置于 37、含 5%co2细胞培养箱中培养，每 23d 换液 1 次，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况。 2.原代脊索细胞的初步鉴定：原代脊索细胞的初步鉴定： 无菌细胞爬片放于 6 孔板中， 经过 100g/ml 多聚赖氨酸 溶液包被过夜。消化离心收集原代脊索细胞，以 1 105个/ml 接种于细胞爬片后置于 37培养箱中进行培养；培养 3d 待细胞生长稳定后进行型胶原免疫荧光染色，染 色方法参照免疫荧光试剂盒（武汉博士德生物公司） 。 详细染色步骤为：详细染色步骤为： 将经过泡酸清洗及高压灭菌过的无菌盖玻片放于 24 孔板中，用 多聚赖氨酸包被过夜； 离心（300g, 5min）收集脊索细胞,加入 1ml 细胞培养液重 悬细胞，计数后以 1105 个/孔的密度将脊索细胞接种于放有经多聚赖氨酸包被的盖 玻片的 24 孔板中；培养 48h； 吸除培养液，用无菌 pbs 洗涤 2 次后每孔加入 4% 的多聚甲醛溶液 200l 固定细胞 20min, 固定完成后吸除固定液，以无菌蒸馏水洗涤； 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 20 每孔分别加入 200l 含 30%h202 和纯甲醇的混合溶液（二者比例为 1:50） ，常温下浸 泡 20min; 无菌蒸馏水再次洗涤 2 次； 每孔加入正常山羊血清封闭液 200l，常温 下封闭 20min, 吸掉多余的液体； 每孔加入适当稀释的一抗(型胶原)200l， 放于 4 冰箱过夜； 吸除一抗液体，pbs 洗涤 2 次后孔加入 200l 稀释好的 fitc 荧光标记 的二抗， 避光孵育 1h, 孵育期间均匀摇动； 孵育结束后吸除二抗液体， pbs 洗涤 3 次， 每次 5min, 洗涤期间应注意避光操作；滴加一滴抗荧光淬灭封片液于每个盖玻片上， 盖上贴有细胞的盖玻片，封片后于荧光显微镜下观察。 3.藻酸盐凝胶立体培养：.藻酸盐凝胶立体培养：收集原代脊索细胞，加入 1.2%藻酸盐溶液（美国 sigma 公 司）中混匀成细胞悬液，调节细胞浓度为 1106个/ml。于 6 孔细胞培养板每孔加入 102mmol/l 的氯化钙溶液 5ml， 再用带 22g 针头的注射器将藻酸盐细胞悬液缓慢滴入 氯化钙溶液中，每孔 25 滴，静置 15min 后即可形成细胞-藻酸盐串珠。缓慢吸除氯化 钙溶液后，以 dmem/f12 基础培养基漂洗藻酸盐串珠 2 次；然后每孔加入 2.5ml 含 15%胎牛血清的 dmem/f12 培养基，隔日换液。 4.死活细胞染色：死活细胞染色：细胞于藻酸盐凝胶内培养 3、7、10d 后进行准备钙黄绿素 （calcein-am）/碘化丙啶（propidium iodide, pi）染色观察藻酸盐凝胶内细胞活力。 检测前吸除培养基，dmem/f12 基础培养基漂洗含细胞的藻酸盐串珠 3 次，加入 3.5mmol/l 的柠檬酸钠溶液 2ml 溶解串珠， 离心 （5min,1100r/min） 收集细胞,再以 pbs 溶液洗涤离心细胞。加入含 1.5 mol/l 的 calcein-am 溶液和 4mol/l pi 溶液的染色 工作液，37孵育 15min；pbs 离心洗涤 2 次后，取适量细胞悬液滴入共聚焦皿底部， 于荧光显微镜下观察。 5.cck-8 检测细胞增殖：检测细胞增殖：收集细胞方法同上。收集细胞后，用 dmem/f12 培养基调 整为 5104/ml 的细胞悬液；将细胞悬液种于 96 孔细胞培养板中，每孔 200l 细胞悬 液，设 5 个复孔。每孔加入 20l cck-8 溶液（碧云天生物技术公司）后，于 37细 胞培养箱中继续孵育 4h，酶标仪（美国 bio-tek 公司）测定 450nm 波长的吸光值。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 21 原代软骨样细胞的体外分离培养及共培养体系的建立 原代软骨样细胞的体外分离培养及共培养体系的建立 1. 原代髓核软骨样细胞的分离及培养：原代髓核软骨样细胞的分离及培养： 4 周龄日本大白兔（购自华中科技大学同济 医学院实验动物中心） ，空气栓塞法处死后无菌条件下获取胸腰段脊柱，75%酒精浸 泡 5min 后以无菌 pbs 反复冲洗。依次横形切开纤维环，无菌显微镊刮出胶冻样髓核 组织， 剪成约 1mm3碎块后用 0.25%型胶原酶于 37细胞培养箱中消化 30min。 200 目滤网过滤消化的组织后以 pbs 冲洗，离心（5min，1100r/min）收集细胞；参考文 献 1,3,4方法， 再以 percoll 分离液不连续密度梯度法分离获得纯化的脊索细胞及软骨样 细胞。最后用含 20%胎牛血清（美国 gibco 公司）的 dmem/f12 培养基（美国 gibco 公司）混匀成细胞悬液，转移至 50ml 细胞培养瓶中，于细胞培养箱中培养。 2. 原代髓核软骨样细胞的鉴定： 原代髓核软骨样细胞的鉴定：无菌细胞爬片放于 24 孔板中，多聚赖氨酸溶液 （100g/ml）包被过夜。消化离心收集原代髓核软骨样细胞，以 2104 个/孔接种于 爬片后放于培养箱中培养 23d。待细胞生长稳定及密度均匀后进行型胶原免疫荧 光染色，染色方法参照量子点超敏荧光试剂盒（武汉嘉源量子点技术开发有限公司） 。 详细染色步骤为： 细胞固定：无菌滴管吸除培养基，用 10mm 的 tbs 溶液 300l （ph 7.27.4）洗涤 2 次，每次 5min，再加 1%多聚甲醛室 300l 温固定 10min 后自 然干燥； 细胞通透：上述 tbs 溶液反复洗涤（洗涤 2 次，每次 5min）,移液器加 入通透液 300l（0.1%triton-x100）后放于 37细胞培养箱中孵育 15min； 封闭： 移液器加入封闭缓冲液 300l， 细胞培养箱中继续孵育 35min; 加入用抗体稀释液稀 释的 collagen type抗体 200l，放在 4冰箱过夜；再次洗涤，方法同前；洗涤后 再次封闭，封闭方法同上；然后加入稀释缓冲液稀释的生物素化羊抗兔 igg(稀释比 例为 1:400)，37细胞培养箱中孵育 30min； 加入用稀释缓冲液（以 1:150 比例 稀释的量子点超敏荧光试剂 qds-sa） 于 37细胞培养箱中孵育 40min； 再次 tbs-t 洗涤 3 次，每次 5min,tbs 洗涤 2 次，每次 5min； 待样本晾干后，使用甘油封片， 荧光显微镜下观察照相。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 22 3. 共培养体系的建立: 共培养体系的建立: 将 0.4m 孔径的置入 24 孔板内组成共培养体系，取第 2 代软 骨样细胞置于下层的 24 孔板底部，取第 1 代脊索细胞置于上层的 transwell 小室内。 分别于培养的第 1, 3，7，10 天取下层软骨样细胞进行检测。 4. cck-8 法测定细胞增殖：法测定细胞增殖：0.25%胰酶（含 0.02% edta）消化收集细胞后，将 200l 细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板中，每组设 5 个复孔。每孔加入 cck-8 溶液（碧云 天生物技术公司） 20l， 细胞培养箱中孵育4h， 450nm波长下使用酶标仪 （美国bio-tek 公司）测定吸光值。 5. 逆转录. 逆转录-聚合酶链反应（聚合酶链反应（rt-pcr）检测型胶原、蛋白多糖的表达：）检测型胶原、蛋白多糖的表达：采用 trizol 提取各组软骨样细胞总 rna，按逆转录试剂盒（日本 toyobo 公司）说明书合成 cdna 。 取 2l cdna 为模板进行 pcr 扩增， 反应体系为 20l， 反应条件为 95 1min， 95 15s，退火 15s，7245 s,共 40 个循环。引物由 invitrogen 生物公司合成。实验 结果经凝胶成像系统检测后再扫描条带灰度。内参为 gapdh，实验重复 3 次。 6. 统计学方法：统计学方法：部分实验数据资料（cck-8）用均数标准差(x s)来表示， 运用 spss12.0 统计分析软件对实验结果行单因素方差分析。 p0.05 确定为有统计学意义。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 23 结结 果果 1. 脊索细胞形态学观察：脊索细胞形态学观察：如图 1.1 所示：镜下见原代椎间盘脊索细胞多为圆形，且 其体积较大，含有大量的囊泡，直径约 1015 m,贴壁一般约需 12d。细胞增殖缓 慢，镜下未见明显的细胞分裂相，长期培养后观察发现脊索细胞数量逐渐减少。在藻 酸盐凝胶培养体系中，细胞形态正常，生长良好。 2. 原代脊索细胞的初步鉴定：原代脊索细胞的初步鉴定：如图 1.2 所示：免疫荧光染色提示脊索细胞能显著表 达型胶原， 染色呈强阳性， 可见大量型胶原分布于胞浆。 且随着培养时间的延长， 其表达也较稳定。 3. 死活细胞染色：死活细胞染色：钙黄绿素（calcein-am）/碘化丙啶（pi）染色显示原代脊索细胞 在藻酸盐凝胶内生长良好，未见细胞凋亡。而且培养 10d 后细胞仍然保持较好的活力 （图 1.3） 。 4. cck- -8 检脊索测细胞增殖：检脊索测细胞增殖：脊索细胞在凝胶内培养 3，7，10d 后，cck-8 检测 的光吸收度值分别为：0.61470.2070，0.66430.1747，0.69500.1648。p0.05 统计 分析显示各组间无明显统计学差异，提示细胞生长缓慢，增殖不明显。 5. 原代髓核软骨样细胞的培养及鉴定：原代髓核软骨样细胞的培养及鉴定：镜下观察见图 2.1 所示：原代贴壁的软骨样 细胞呈短梭形，直径 46m；图 2.2 免疫荧光染色均可见软骨样细胞胞浆内有明显 的型胶原表达） 。 6. 细胞增殖：细胞增殖：除培养 1，3d 组间 p0.05 无统计学意义外，其他各组均 p0.05。提 示非接触共培养条件下脊索细胞能明显促进软骨样细胞增殖，并与培养时间相关。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 24 表 1 表 1 各组细胞增殖能力比较（x s） 7. 型胶原、蛋白多糖的表达：从图 3 可以看出，随着共培养时间的延长，软骨样 细胞型胶原、蛋白多糖的表达上升；提示脊索细胞能促进软骨样细胞的基质合成。 图 3 图 3 共培养条件下细胞型胶原、蛋白多糖 mrna 表达 讨 论 讨 论 由于脊索细胞和软骨样细胞共同存在于年幼动物的髓核组织中，如何将二者分离 纯化并进行表型鉴定将是一个非常重要的问题。 目前少数学者多采用不连续密度梯度 离心及针对二者的形态学特点（脊索细胞大而圆，呈空泡状；软骨样细胞体积相对较 小，呈短梭形）来进行分离纯化；但尚无特异性的表面标记分子对其进行鉴定。国外 学者 kim 等发现脊索细胞能高表达型胶原、蛋白多糖及软骨特异性基因 sox-9 5。 我们的研究结果也证实其能高表达型胶原。此外，wiler 等研究认为脊索细胞的细 组别 1 d 3 d 7 d 10 d 共培养 0.480.03 0.500.03 0.750.04 0.850.02 单层培养 0.450.03 0.460.04 0.600.04 0.710.04 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 25 胞角蛋白(cytokeratins, ck)-8,-18,-19 及乳糖凝集素 galectin-3 免疫组化染色阳性 率较高 6。 脊索细胞的增殖能力较弱， 体外培养比较困难， 因此其对培养条件要求严格。 kim 等发现脊索细胞的群体倍增时间较软骨样细胞慢 5。我们的 cck-8 检测结果证实脊 索细胞在培养 1 周后仍增殖缓慢。同时 kim 还发现脊索细胞能分化为 3 类形态不同 的细胞类型，即空泡细胞、细胞不分裂且生长迅速的巨细胞和与软骨样细胞形态相似 的多角形细胞，又因其具有软骨细胞表型，他们认为脊索细胞有望作为退变椎间盘再 生修复的祖细胞 5。多数文献报道髓核细胞长期单层培养后容易产生去分化现象，导 致其表型改变， 而在藻酸盐凝胶培养可逆转这一现象并且可稳定维持其软骨样表型 7。 我们的研究结果证实脊索细胞在藻酸盐凝胶中存活良好。 guehring 等研究认为脊索细 胞对营养缺乏的耐受性弱于软骨样细胞，还发现低氧能增加脊索细胞的糖酵解率 8。 此外 won 等证实高糖可引起脊索细胞的早熟、过度凋亡及加快其向软骨样细胞的分 化，从而导致椎间盘早期退行性变 9。 由于脊索细胞增殖缓慢，因此难以获得大量的细胞来进行相关研究。目前国外学 者的相关研究多集中在其与软骨样细胞的相互作用上，而迄今国内较少有学者进行相 关研究。erwin研究提示结缔组织生长因子ctgf/ccn2信号通路参与了脊索、脊索细 胞的发育分化成熟细胞外基质的维持 10，其具体机制尚需进一步深入研究。aguiar等 发现脊索细胞可分泌结缔组织生长因子等可溶性细胞因子来引导髓核周围间充质样 细胞的迁移，从而促进软骨样细胞分泌细胞外基质 2。此外wang等研究提示随着年龄 的增长，来源于内胚层的脊索细胞会逐渐被来源于中胚层的软骨样细胞所取代，这可 能与椎间盘退行性变的发生有一定关系 7。本课题组在研究中也发现脊索细胞在长期 单层培养后，细胞形态逐渐变小；而与软骨样细胞单层共培养时发现其形态逐渐由圆 形空泡状变为椭圆形及不规则形，甚至最后消失。多数学者进一步证实脊索细胞数量 与软骨样细胞蛋白多糖的合成量与存在明显相关 11,12。脊索细胞因独特的生理功能使 其在椎间盘退变机制及退变椎间盘修复的研究中具有广阔前景。因此尚需进一步对脊 索细胞的生物学特点做深入研究。 脊索细胞常存在于年轻人髓核内，常被认为是胚胎时期脊索的残留，其在髓核和 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 26 脊柱的发生形成中起着重要作用 13。而正常成年人髓核组织内主要为软骨样细胞，有 大量研究表明软骨样细胞的老化及凋亡可能是椎间盘发生退变的主要机制 14。le maitre 等 15认为来源于内胚层的脊索细胞会逐渐被来源于中胚层的软骨样细胞所取 代，这可能与软骨样细胞过早老化及凋亡的发生有密切关系。 由于脊索细胞与软骨样细胞共同存在于年幼动物的髓核组织中，如何将二者分离 纯化将是一个非常重要的问题。 目前少数学者多采用不连续密度梯度离心及针对二者 的形态学特点（脊索细胞大而圆，呈空泡状；软骨样细胞体积相对较小，贴壁后为短 梭形）来区别及进行流式分选。软骨样细胞多采用其表达的型胶原及蛋白多糖进行 初步鉴定，但目前尚无特异性的表面标记分子对脊索细胞进行鉴定。 退变的椎间盘髓核组织中可见髓核细胞老化凋亡及其特异性表达的型胶原含量 明显减少，并逐渐被型胶原所取代。通常体外单层培养的软骨样细胞随着传代次数 的增加，型胶原和蛋白多糖的表达会逐渐减少且增殖明显减缓。我们的研究发现随 着共培养培养时间的不断增长，软骨样细胞增殖加快且能够稳定地维持其表型；这提 示可能与脊索细胞的作用相关。 aguiar 等研究发现脊索细胞可通过分泌可溶性细胞因 子，如结缔组织生长因子 ctgf，来引导髓核组织周围的间充质样干细胞迁移，从而 促进软骨样细胞分泌大量细胞外基质 2。erwin 等