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实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料 小麦面粉(1000 g) 2主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL11 （2） 滤纸 （3）烧杯：100 mL2 （4）三角瓶：100 mL1 （5）容量瓶：100 mL3 （6）刻度吸管：1mL1；2 mL2；10 mL1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度计3 试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80 烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。（5） 6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37%浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取7支20 mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值 （OD540nm）0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540 nm，用0号管调零点，等后面710号管准备好后，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 葡萄糖标准曲线光密度值葡萄糖含量（mg）2. 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00 g食用面粉，放入100 mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50 mL蒸馏水，搅匀，置于50 恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取准确称取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸馏水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解30 min, 取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100 mL，过滤取滤液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。（3）显色和比色取4支20 mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540 nm，用0号管调零点，测出710号管的光密度值。表2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）平均值70.51.51.580.51.51.59111.510111.5五、结果与计算计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计)。还原糖（%）=查曲线所得葡萄糖毫克数 提取液总体积测定时取用体积100 =样品毫克数总糖（%）=查曲线所得水解后葡萄糖毫克数稀释倍数0.9100 =样品毫克数六、注意1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？3. 绘制标准曲线的目的是什么？实验二 油脂酸价的测定一、目的与要求 初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定油脂酸价的意义。 二、实验原理 油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。三、主要仪器、实验材料和试剂1. 锥形瓶（250 mL）3个。 2. 量筒（50 mL）1支。3. 碱式滴定管1支。4. 花生油、菜油、芝麻油等。5. 乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)。6. 0.2 KOH（2克KOH溶于1000 mL纯水中）。四、操作步骤1. 准确称取12 g油脂于250 mL锥形瓶中。2. 在瓶内加入乙醇乙醚混合液50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。待油样完全溶解后，加入1酚酞指示剂35滴，立即用0.2 KOH标准溶液滴定至溶液成微红色（放置30 S内不褪色）为终点，并记录用去的KOH的体积，并按下式进行计算。酸价2(V2-V1)/W V2 ：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数 V1 ：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数 W：油样重(g)注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。 五、实验结果油脂名称起始刻度终点刻度体积 （ mL）酸价备注空白对照六、思考题请对你的实验结果进行分析。 实验三 蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)一、目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸等，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰约在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。三、实验材料、主要仪器和试剂1. 试验材料：萌发3天的小麦种子 2. 主要仪器（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管 （5）研钵 （6）100 mL容量瓶3试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/ mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500 mL）的溶液。四、操作步骤1蛋白质（淀粉酶）的提取称取1 g萌发3天的小麦种子（芽长约1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。2. 标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1 cm的石英比色杯，在280 nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。表1 蛋白质标准曲线制作管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm104020.53.50.12531.03.00.2541.52.50.37552.02.00.5062.51.50.62573.01.00.7584.001.03.样品测定取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280 nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。蛋白质浓度=五、思考题1. 为何要在280 nm波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？2. 如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？ 实验四 酶的激活和抑制作用一、实验目的初步认识酶的性质，了解酶促反应的激活剂与抑制剂； 学习检定激活剂和抑制影响酶反应的方法和原理。二、实验原理酶是具有高效专一催化活性的蛋白质，其活性常受温度PH及些物质的影响。 某些物质可以增加其活性，称为激活剂；某些物质能降低其活性，称为抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且这种作用常常具有特异性。但要注意的是激活剂和抑制不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂时却为另一种酶的抑制剂，而在高浓度时则为该酶的激活剂（如NaCl）。淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色，紫色，暗色或红色。最简单的糊精遇碘不呈蓝色。三、实验步骤激活剂和抑制的认识：取4支试管，按下表加试剂： 管号 12340.1% 淀粉（mL）1.51.51.51.51% CuSO4（mL）0.5/1% NaCl（mL）/0.5/1% Na2SO4（mL）/0.5/水/0.5稀（1/1000）淀粉酶（mL）0.50.50.50.5保温（37）7分钟后KII223滴23滴23滴23滴现 象 四、思考题 1、激活剂抑制剂实验中淀粉酶要最后加，为什么？ 2、加入淀粉时要小心，不要沾到试管壁；另外，摇匀时也不宜用力过猛，使淀粉溶液或淀粉粒过多地沾在试管壁上，这样会影响结果的观察，误差较大，为什么？实验五 维生素C的定量测定原理维生素C具有很强的还原性。在硷性溶液中加热并有氧化剂存在时，维生素C易被氧化而破坏。在中性和微酸性环境中，维生素C能将染料2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型2,6-二氯酚靛酚，同时维生素C氧化成脱氢维生素C。氧化型的2,6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后即失去红色。根据滴定时2,6-二氧酚靛酚溶液的消耗量，可以计算出被测物质中维生素C的含量。操作1.称量样品2g，加2%草酸液5ml于研钵中，研成匀浆倾入50ml量筒中。2.以1%草酸液将样品稀释至20ml摇匀。3.如果样品有颜色，再加入适量的白陶土，振摇数次，使其充分脱色。4.取上层液过滤，收取滤液5ml，以标定过的2,6一二氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈现淡红色，在15秒内不退为止，记录滴定用量为V1。5.取1%草酸5ml，用2,6一二氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈现淡红色，记录滴定用量为V2。为空白滴定。6.计算计算维生素C(mg/100g)= (V1-V2)TW100W滴定时所用样品稀释液中含样品的克数T1ml2,6一二氯酚靛酚能氧化维生素C的mg数(0.088mg/ml)注意事项1、操作过程中要迅速，因还原型维生素C易被氧化。2、食物中含有较多的还原物质，亦能与2，6一二氯酚靛酚作用，故误差可达10%左右。试剂1.1%草酸溶液2.2%草酸溶液3.白陶土4.0.001N2，6-二氯酚靛酚溶液：称取氧化型2，6-二酚氯靛酚25mg，溶于100ml含26mg NaHCO3的水中，充分摇振，放置过夜。用前过滤，用蒸馏水稀释至125ml。用标准Vc标定其浓度。标准Vc溶液(1.0ml=0.5mg)：精确称取纯Vc25mg，溶于4%盐酸25ml，移入50ml和容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度。吸取标准Vc溶液1.0ml，置于蒸发皿中，加2%盐酸1ml，用配制的2，6一二氯酚靛酚滴定。然后将2，6-二氯酚靛酚稀释至每mlVc0.088mg，贮于棕色瓶中，置冰箱中可保存一周。1ml2，6-二氯酚靛酚相当维生素Cmg数=维生素C浓度(mg/ml)维生素Cml数滴定消耗2，6-二氯酚靛酚ml数5.维生素C溶液：纯维生素C粉末20mg，以10%草酸溶液溶解，并定容到100ml，冷藏保存。标定：吸取维生素C液2ml于锥形瓶中，加入6%KI溶液0.5ml，1%淀粉液2滴，再经标准的1.710-4mol/l KIO3溶液滴定至终点，呈淡兰色。维生素C浓度(mg/ml)=消耗1.710-4mol/L KIO3的ml数0.088所取维生素C液ml数6.0.017mol/L KIO3溶液：精确称取干燥的KIO3 0.3567用蒸馏水溶解后，再加水至100ml刻度。7.1.710-4mol/L KIO3溶液：0.017mol/L KIO3液1ml用水稀释到100ml刻度。此液1ml相当于维生素C 0.088mg。8.1%淀粉液：可溶性淀粉0.5克，加水1滴搅拌成糊状后倒入50ml沸水中，混匀，冷藏待用。9.6%KI溶液：称取KI0.6g溶于100ml水中临用现配。10.4%HCl：取38%含量的HCl 21ml加水至200ml。思考题1.维生素的理化性质最重要是什么?为何用草酸提取维生素C?2.维生素C的生理功能有哪些?3.食品中维生素C的含量受哪些因素的影响?试举出三种含维生素C最高的食物。实验六 磷脂单分子膜模型的制作目的 通过制作磷脂单分子膜模型，领会双层磷脂分子所构成的细胞膜的状态。实验前的思考 每个细胞都被一层细胞膜覆盖，但是用光学显微镜看不到。近年来应用电子显微镜等新技术、新方法了解到细胞膜以双层磷脂分子为骨架，不同程度地镶嵌着蛋白质分子。本实验用卵磷脂为材料，作一个单层磷脂分子的模拟膜，来领会双层磷脂分子所构成膜的状态。材料器具 试管架，试管，滴管；亚甲基蓝，正丁醇溶液，卵磷脂，95%乙醇。步骤1.配制