（流行病与卫生统计学专业论文）白藜芦醇对d半乳糖诱导细胞衰老的保护机制研究.pdf

li徐州医学院硕士学位论文缩略词b pd e p cd g a ld m s oe bf b sm e mm o r f 4英文全称b a s ep a i r缩略词表a b b r e v i a t i o nd i e t h y l p y r o c a r b o n a t ed ( + ) g a l a c t o s ed i m e t h y l s u l f o x i d ee d l i d i u m b r o m i d ef e t a lb o v i n es e r u mm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m中文全称碱基对焦磷酸二乙酯d 半乳糖二甲基亚砜溴化乙锭胎牛血清m e m 培养基m o r t a l i t yf a c t o ro nc h r o m o s o m e44 号染色体上死亡因子m r gm o r f 4 r e l a t e dg e n em r g l 5m r g xm t to dp a m l 4p b sp c rm o r f 4 相关基因m o r f 4 - r e l a t e dg e n eo nc h r o m o s o m e1515 号染色体上m o l 强4相关基因m o r f 4 - r e l a t e dg e n eo nc h r o m o s o m exx 染色体上m o r f 4 相关基因m e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u mo p t i c a ld e n s i t y四甲基偶氮唑蓝光密度p r o t e i na s s o c i a t e dw i t hm r g , 1 4 k dm r g 相关蛋白1 4p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n磷酸盐缓冲液聚合酶链反应徐州医学院硕士学位论文p d lr e sr p ml 玎p o p u l a t i o nd o u b l i n gl e v e lr e s v e r a t r o lr e v o l u t i o n sp e rm i n u t er e v e r s et r a n s c r i p t i o nls a - p - g a ls e n e c e n c e - a s s o c i a t e d 1 3 - g a l a c t o s i d a s ex g a l群体倍增水平白藜芦醇每分钟转速反转录衰老相关p 一半乳糖苷酶5 - b r o m o - 4 - e h l o r o 一3 - i n d o l y lp - d g a l a c t o s i d e5 溴- 4 氯- 3 - 吲哚p - d 一半乳糖苷2徐州医学院硕士学位论文白藜芦醇对d 半乳糖诱导细胞衰老的保护机制研究中文摘要目的本研究旨在从细胞水平研究白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，r e s ) 对d 半乳糖诱导的w i 3 8 衰老细胞的保护机制，探讨m r g 家族基因在r e s 抗衰老中的重要作用，为今后r e s 作为延缓衰老治疗提供理论和实验依据。方法( 1 ) m e m ( m i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m ) 培养人胚肺成纤维细胞( w i 3 8 ) ，p d l ( p o p u l a f i o nd o u b l i n gl e v e l ) 2 7 代进行实验。( 2 ) 建立衰老模型：d - 半乳糖8 9 a 、1 6 9 l 、3 2 朗、6 4 9 1 分别对w i - 3 8 细胞干预2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 、1 2 0 h ，m t t 法检测细胞增殖活力，绘制生长曲线。s a p 半乳糖苷酶( s a p g a l ) 染色法检测细胞衰老程度。( 3 ) 研究分组：w i 一3 8 ( p d l = 2 7 ) 细胞为对照组、1 6 酊的d - 半乳糖诱导细胞衰老组，两种r e s 处理方式：衰老前r e s 预处理组、衰老后r e s 保护组。r e s 干预浓度为2 5 1 t m 、5 0 1 t m 、1 0 0 1 t m 、2 0 0 l m 、4 0 0 “m ，预处理干预时间2 h , 衰老后r e s 干预时间2 4 h 。m t r 法检测各干预组细胞增殖活力及s a p g a l 染色法检测细胞衰老程度；检测各组总s o d 活性。用r t - p c r 检测m o r f 4 、m r g l5 、m r g x 、p a m l 4 的表达。s p s s l 6 0 进行数据录入及统计学分析，i m a g ej 灰度值分析。结果w i 3 8 细胞生长良好，对照组衰老染色可见蓝染细胞比例小于1 0 。d 半乳糖8 矿、1 6 酽、3 2 9 l 、6 4 妒、1 2 8 9 1 处理年轻w i - 3 8 细胞4 8 h 后，与对照相比各组细胞存活率呈现不同程度下降( p o 0 5 ) 。s a - p - g a l 染色不同时间下d - 半乳糖8 鲫、1 6 酊、3 2 酊处理后细胞染色率均高于对照组( 尸 0 0 5 ) 。衰老后2 5 p m 、5 0 p mr e s 保护组细胞存活率均高于同浓度衰老前预处理组b o 0 5 ) 。2 5 p m 、5 0 州、1 0 0 p m 、2 0 0 p mr e s 保护组染色率比衰老组分别降低了2 5 1 2 、3 3 0 2 、3 9 4 5 、3 2 3 1 ，差异均有统计学意义( 氏o 0 5 ) 。1 0 0 “m 浓度的r e s 作用于衰老组细胞后，其总s o d 活性不仅高于衰老组，而且也高于对照组( 尸 o 0 1 ) 。衰老后r e s 各保护组总s o d 活力均高3徐州医学院硕士学位论文于衰老组( p 0 0 1 ) 。1 0 0 p , m r e s 能明显上调m o r f 4 、m r g l 5 基因的表达伴0 0 5 ) ，4 0 0 1 x mr e s 可下调m o r f 4 、m r g l 5 基因的表达( p 0 0 5 ) 。结论1 d 半乳糖可诱导体外培养的w i 3 8 细胞发生衰老改变，包括s a b g a l 染色阳性率上升，细胞增殖能力降低。2 1 0 0 1 t mr e s 浓度对衰老w i 3 8细胞保护作用最强，衰老后r e s 处理2 4 h 方式保护能力大于衰老前r e s 预处理2 h方式。1 0 0 9 mr e s 浓度提高衰老w i 3 8 细胞总s o d 活性能力最强。3 1 0 0 9 mr e s能明显上调衰老细胞m o r f 4 、m r g l 5 基因的表达，而4 0 0 x m r e s 处理衰老细胞、。后，m o r f 4 、m r g l 5 基因的表达下调。关键词衰老；白藜芦醇；d 半乳糖；m r g 家族4徐州医学院硕士学位论文s t u d yo f t h ep r o t e c t i o nm e c h a n i s mo fr e s v e r t r o lo nd - g a l a c t o s ei n d u c e dc e l ls e n e s c e n c ea b s t r a c to b je c t i v et oo b s e r v et h ep r o t e c t i v ee f f e c to fr e s v e r a t r o l ( r e s ) a g a i n s ts e n e s c e n c ei n d u c e db yd - g a l a c t o s eo nw i - 38c e l l sa n dt h ep r o t e c t i v em e c h a n i s m m e t h o d s1 h u m a ne m b r y o n i cl u n gf i b r o b l a s tl i n e s ( w i - 3 8 ) w e r ec u l t u r e d 、) l ，i t hm e m ( m i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m ) i nv i t r oa n ds e l e c t e dt h ec e l l sw h i c ht h ep o p u l a t i o nd o u b l i n gl e v e l ( p d l ) a t2 7i nt h ee x p o n e n t i a lp h a s eo fg r o w t ht oe x p e r i m e n t 2 t h ec e l l sw e r et r e a t e d 、) l ，i md i f f e r e n td g a l a c t o s ec o n c e n t r a t i o n s ( 8g ，l ，16g 1 ，3 2 鲈，6 4g l ，a n d12 8g 1 ) f o r4 8 h t oi n v e s t i g a t et h ea g i n ge f f e c to fd g a l a c t o s eo nd a m a g e so fw i - 38b yac o l o r i m e t r i c3 - 【4 ，5 - d i m e t h y lt h i a z o l - 2 一y l 】一2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ( m 删a n ds a p g a l a c t o s i d a s es t a i n i n g 3 w i 3 8c e l l sw e r ed i v i d e di n t on o r m a lc o n t r o lg r o u p ，a g i n gg r o u pi n d u c e db y16 们o fd - g a l a c t o s ef o r4 8 h ，r e sp r e t r e a t m e n tg r o u pa n dr e sp r o t e c t i o ng r o u p t h es e n e s c e n tc e l l sw e r et r e a t e dw i t l ld i f f e r e n tr e sc o n c e n t r a t i o n s ( 2 5j - t m ，5 0 1 x m ，10 0 p m ，2 0 0 p m ，4 0 0 1 x m ) f o r2 hi nr e sp r e - t r e a t m e n tg r o u pa n d2 4 hi nr e sp r o t e c t i o ng r o u p t oo b s e r v et h ep r o t e c t i v ee f f e c to fr e so ns e n e s c e n tw i 3 8c e l l si n d u c e db yd - g a l a c t o s e ，t h ev i a b i l i t yo fw i 一3 8c e l l sw e r ed e t e c t e db ym t t , t h ea c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) i nc e l l sw e r em e a s u r e db yl 【i t s r t - p c rw a su s e dt od e t e c tt h em r n ae x p r e s s i o no fm o r f 4 ，m r g l5 ，m r g x ,a n dp a m14i na g i n gc e l l s d a t af o re a c he x p e r i m e n t a lg r o u pw e r ea n a l y z e d 、i t l ls p s s l 6 0b y a n o v a r e s u l t ss e n e s c e n tc e l l sm o d e lw a se s t a b l i s h e db yt r e a t i n gw i 38c e l l sw i t h16 酊o fd - g a l a c t o s ef o r4 8 h t h ec e l lv i a b i l i t yo fs e n e s c e n tc e l l sd e c r e a s e dt o7 1 2 4 ，s t a i n i n gr a t eo f5 5 4 7 b ys a - p g a l a c t o s i d a s es t a i n i n g t h el e v e lo fc e l lv i a b i l i t yi nr e sp r o t e c t i o ng r o u pa n dr e sp r e t r e a t m e n tg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ，c o m p a r e dw i t ht h ea g i n gg r o u p ( 尸 0 0 5 ) ，e s p e c i a l l yt h e10 0 “mc o n c e n t r a t i o nw h i c hc a nm a k et h ec e l lv i a b i l i t ya p p r o a c ht h el e v e lo ft h en o r m a lc o n t r o lg r o u p w i t ht h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m2 5 1 x mt o5 0 1 t m ，t h ev i a b i l i t yo fs e n e s c e n tc e l l si nr e sp r o t e c t i o ng r o u pw a se n h a n c e d ，c o m p a r e dw i t hr e sp r e t r e a t m e n tg r o u pa n da g i n gg r o u p ( 尸0 0 5 ) d i f f e r e n td o s a g eg r o u p so ft h er e sc a ni m p r o v et h es o da c t i v i t yi ns e n e s c e n tw i - 38c e l l s ，5徐州医学院硕士学位论文e s p e c i a l l yt h e ：o o u mc o n c e n t r a t i o nw h i c hc a nm a k et h es o dv a l u ee x c e e dt h el e v e lo ft h en o r m a lc o n t r o lg r o u p 畎o 01 ) c o m p a r e dw i t ht h ea g i n gg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fm o r f 4a n dm r g l5w e r es i g n i f i c a n t l ye n h a n c e di nr e s10 0 p mp r o t e c t i o ng r o u p畔0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：! t h es e n e s c e n te e l lm o d e lc o u l db ee s t a b l i s h e db yi n d u c i n gw i 一38d a m a g ew i t hd g a l a c t o s e 2 t h eo p t i m a ld o s eo fr e si s10 0i l m ，w h i c hp r e v e n tw i - 3 8c e l l sf r o ma g i n g 3 t h ec o n c e n t r a t i o n10 0 mo fr e sc a ne n h a n c et h ee x p r e s s i o no fm o r f 4a n dm r g15i na g i n gw i 一38c e l l s k e yw o r d s ：s e n e s c e n c e ，r e s v e r a t r o l ，d g a l a c t o s e ，m r gf a m i l y6徐州医学院硕士学位论文上丽吾衰老( s e n e s c e n c e ) 是指在正常状态下生物体随着年龄增加而机能减退，表现为组织结构、化学组分退行性变，最终趋向机体死亡。现代科技文明极大地改善了外界生存条件，相对延长了一般人群的平均寿命。2 0 世纪5 0 年代起世界各国人口老龄化进程加速，中国2 0 1 0 年第六次全国人口普查数据表明：6 0 岁及以上人口为1 7 7 6 亿人，占总人口1 3 2 6 ，与2 0 0 0 年第五次全国人口普查相比，比重上升了2 9 3 。随着老龄化社会的来临，衰老相关的慢性心、脑血管疾病逐渐成为人类死亡和生存质量下降的主要危险因素。延缓机体衰老有利于改善老年人的健康素质，降低老年性疾病的发病率和恶性程度，减少社会老年性疾病的治疗成本。研究生物的整体衰老过程存在一系列难以克服的障碍，这是由于衰老本身的复杂性及不同个体之间的差异性所导致，此外，将单纯地正常衰老与疾病效应相区分亦存在许多不明确的未知因素影响。 刍h a r r i s o n 在1 9 0 7 年首创组织培养法以来，体外培养传代的细胞成为一种简化的、条件可控的衰老研究模型【i 】。1 9 6 1 年，h a y n i c k 及m 0 0 r 1 1 e a d 证明体外培养人类正常成纤维细胞的寿命是有限的【2 1 ，这种正常人体细胞在体外分裂潜能受限制的现象被称为细胞复制衰老【3 】。这种现象提示：复制衰老可能是生物体生命周期在细胞水平的重演，或者也可以说在体外细胞培养中的复制衰老可以反映体内衰老发生的过程。由于要得到复制性衰老细胞需几个月时间，许多研究是用氧化剂或药物诱导年轻细胞出现早熟性衰老( p r e m a t u r es e n e s c e n c e ) ，比如使用过氧化氢( h 2 0 2 ) 、d 半乳糖( d g a l ) ( 4 - s 】。白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，r e s ) 是在植物中发现的一种微弱雌激素效应的抗毒素【6 1 ，现代科学研究发现它具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等一系列作用【7 - 8 1 ，其化学结构是一种含有芪类结构非黄酮类多酚化合物，当植物受病原体进攻、紫外光照射以及暴露于臭氧时大量生成此物质，主要存在于虎杖、葡萄、花生、桑堪、松树等1 2 科、3 1 个属7 2 种植物中。r e s 及糖苷分子在紫外光或其它理化因素的7徐州医学院硕士学位论文诱导下发生顺反几何异构，研究表明反式结构在乙醇中可稳定存在数月且生物活性较强，而顺式结构仅在中性环境中稳划9 1 。白藜芦醇具有强抗氧化、清除自由基、抗脂质过氧化作用。白藜芦醇的抗氧化作用比维生素c 和维生素e 更强，可以通过抑制二硫化谷胱甘肽的形成，使谷胱甘肽保持还原态【1 0 1 。白藜芦醇对自由基系统引发的脂质过氧化反应有很强的抑制作用，能明显降低组织中的丙二醛( m d a ) 含量，提高超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x )活性，对脑缺血及组织损伤有保护作用。低密度脂蛋白( l d l ) 的过度氧化与冠心病和心肌梗塞的发病风险有着密切关系【1 1 】，白藜芦醇可以通过鳌和铜离子减轻低密度脂蛋白的氧化程度，通过直接清除氧自由基发挥抗氧化作用【1 2 】，也可抑制肿瘤和紫外线诱导的脂质过氧化作用，减轻庆大霉素诱导的肾毒性作用【1 3 】。在自发性高血压病小鼠模型中，白藜芦醇显著降低了血清中糖化球蛋白和尿液中8 羟化鸟嘌呤核苷等反映机体氧化水平的生理指标【1 4 】。这些证据显示白藜芦醇可以有效调节脂质及其他大分子物质的过氧化程度，抑制下游的病理性改变。活性氧物质( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 可以通过直接损伤d n a 和其它大分子物质来促进肿瘤的发生。流行病学及实验证据显示抗氧化剂对肿瘤的发生有明显的抑制作用。白藜芦醇可以增强血浆的抗氧化能力，降低脂质的过氧化水平，减少h 2 0 2 产生，使髓过氧化酶和氧化型谷胱甘肽还原酶的活性正常化，恢复谷胱甘肽水平和s o d活性，从而增强机体的抗氧化、抗自由基防御系统，间接发挥其抗氧化、抗自由基作用【15 1 。m o r f 4 ( m o r t a l i t yf a c t o r4 ) 位于染色体4 q 3 3 - 3 4 l ，属于人体基因组中6 个m o r f相关基因( m r g ) 家族【1 6 】。它编码小内含子( i n t r o 1 e s s ) 转录因子样蛋白，其结构与m r g 家族的2 个在组织和细胞中大量表达的基因m r g l 5 和m r g x 非常相似，含有多个类似转录因子的模序，认为它们可能是转录性调控因子从而对衰老或细胞生长调节起重要作用【1 7 1 ，后来研究证实并不是小鼠细胞生长和发育必需的【1 引。蛋白质组学研究发现，m r g l 5 是哺乳动物基因中唯一的、与组蛋白脱乙酰基酶和组蛋白乙酰基转移酶都有联系的基酬1 9 】。已发现m r g l 5 能活化原癌基因b m y b 的启动徐州医学院硕士学位论文子，从而启动细胞由g 1 期进a s 期，促进细胞增殖【2 0 1 。m r g l 5 可能通过活化细胞周期必需的基因发挥其关键的正性调控作用，而m o r f 4 可能通过负性途径抑制了m r g l 5 的作用，使细胞增殖减少而开始衰老【2 。另外，细胞衰老一直被认为是一种抵抗肿瘤形成的保护性机制，m o r f 4 能诱导人肿瘤细胞株亚型衰老【2 2 1 。已经证实m o r f 4 所属的m r g 家族在细胞衰老、增殖、正性及负性转录调控、d n a 损伤的修复过程中都起了重要的作用【1 9 1 。目前国内外均罕有研究白藜芦醇是否可以对m r g 家族基因的调节从而发挥抗衰老作用。本实验拟用d 半乳糖诱导人胚肺二倍体细胞系( w i 3 8 ) 细胞出现早熟性衰老，从而建立细胞衰老模型。采用不同浓度白藜芦醇在建立衰老模型前预处理及衰老模型建立后再保护的实验设计，运用r t - p c r 、s a 1 3 g a l 染色、总s o d 活性、m t t等方法作为观察终点及分析手段，探讨白藜芦醇在衰老细胞模型中发挥抗衰老作用的强度及其机制，为白藜芦醇在代谢性和衰老性疾病的治疗及预防保健提供科学依据。9徐州医学院硕士学位论文材料和方法1材料1 1 细胞株w i 3 8 细胞株，购于中国医学科学院上海分院细胞研究所。1 2 主要药品及试剂胎牛血清杭州四季青生物技术有限公司m e m 培养基g i b c o 公司青链霉素碧云天生物技术研究所胰蛋白酶s i g a m a 公司d 半乳糖a m e r $ c o 公司台盼蓝( t r y p a nb l u e )s i g a m a 公司二甲基亚砜( d m s o )a m e r s c , o 公司x - g a la m e r s o ：o 公司d m f f n ，n - 二甲基甲酰胺)a m e r s c o 公司白藜芦醇( r e s )s i g m a 公司总s o d 活性检测试剂盒( n b t 法)碧云天生物技术研究所w e s t e r n 及坤细胞裂解液碧云天生物技术研究所q u a n t 一步法r t - p c r 试剂盒t i a n g e n 公司t r n z o lr e a g e n tt i a n g e n 公司噻唑兰( m t t )a m e r s e x ) 公司d l 2 0 0 0m a r k e rt a k a r a 公司焦碳酸二乙酯( d e p c )a m e r $ c o 公司引物合成上海生工生物工程有限公司1 0徐州医学院硕士学位论文1 3 主要仪器设备及耗材凝胶电泳和转移系统3 7 恒温水浴箱8 0 低温冰箱超净工作台细胞培养箱p h 3 t c 精密数显酸度计电子天平m p 2 0 0 a相差倒置显微镜生物显微c x 2 1 b i m s e tt g l - 2 0 m 台式高速低温离心机p c r 仪核酸蛋白测定仪全自动酶标仪( c e r e s 9 0 8 )紫外手提式分析仪手提式蒸气消毒器磁力搅拌器液氮生物容器电热恒温培养干燥两用箱制冰机移液枪o l y s i a - b i o r e p o r t 图像拍摄系统1 5 m le p p e n d o r f 管0 2 m lp c r 管5 0 m l 、1 5 m l 一次性离心管6 孔、1 2 孔、2 4 孔、9 6 孔培养板美国b i o - r a d 公司浙江美晨公司苏州净化设备厂德国h e r a e u s 公司上海第二分析仪器厂上海良平仪器仪表有限公司日本o l y m p u s 公司日本o l y m p u s 公司长沙平凡仪器仪表有限公司e p p e n d o r f 公司e p p e n d o r f 公司美国b i o t e k 公司上海长明光学电子仪器厂上海三中医疗器械有限公司国华电器有限公司航空工业部豫新机械厂中国厦门电子医疗仪器厂s c o t s m a n 公司e p p e n d o r f 公司日本o l y m p u s 公司a x y g e n 公司a x y g e n 公司c o m i n g 公司c o s t a ri7 s a徐州医学院硕士学位论文1 4 主要试剂的配f 3 1 ：1 4 1p b s 溶液( 0 0 1 mp h 7 2 ) ：n a 2 h p 0 4 12 h 2 0k h 2 p 0 4n a c lk c l3 6 3 90 2 4 98 90 2 4 9先加入8 0 0 m l 的双蒸水搅拌均匀，滴加浓盐酸将p h 值调至7 2 ，然后加入双蒸水将溶液定容至1 0 0 0 m l ，高温高压灭菌后，4 c 保存备用。1 4 2o 1 2 5 胰蛋白酶：胰蛋白酶0 1 2 5 9 溶于1 0 0 m l0 0 1 mp b s 中，过滤分装后，2 0 保存。1 4 3e d t a 溶液( o 5m o l l ，p h8 o ) ：将1 8 6 1ge d t a n a 2 j j l x , 8 0 0m l 去离子水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用n a o h 调节溶液的p h 值至8 0 ，定容至1l ，高压蒸气灭菌1 5m i n 。e d t a 二钠盐需j j l x , n a o h 将溶液的p h 值调至接近8 0 时，才会完全溶解。1 4 41 0 x t e 溶液( p h8 0 ) ：1m o l 1 i r i s c 1 ( p h8 0 ) 1 0 0m l0 5m o l le d t a ( p h8 0 ) 2 0m l加去离子水至ll 。高压蒸气灭菌1 5m i n ，室温保存。使用时稀释为l 。1 4 55 0 x t a e 溶液( 1l ) ：t r i s 碱2 4 2 0 0g冰乙酸5 7 1 0 i i l l0 5m o l le d t a ( p h8 0 ) 1 0 0 0 0m l加去离子水至ll ，常温保存，使用时稀释为1 。1 4 6 琼脂糖凝胶按终浓度计算，称取定量的琼脂糖，加入1 0 0m llx t a e ，加热溶解，冷1 2徐州医学院硕士学位论文却至5 啦6 0 时加e b ( 原浓度1 0m g m 1 ) 5 p l ，使之终浓度为0 5 p g m l ，混匀，倒胶。1 4 7d n a 上样缓冲液溴酚蓝二甲苯青f f甘油常温保存。o 2 5 ( m )o 2 5 ( m )3 0 0 0 ( m )1 4 81 0 x d h a n k s ( 1l )n a c l8 0gk c l4gn a 2 h p 0 4 。1 2 h 2 01 2gk h 2 p 0 4葡萄糖双蒸水0 6g1 0g1 0 0 0 m l过滤灭菌，4 。c 储存。1 4 9m e m 培养基配制取l d , 袋m e m ( c a t n o 4 1 5 0 0 0 6 7 ) 9 6 9 ，n a o 1 l g 丙酮酸钠，3 1 1 9 5 0m l 蒸馏水，力i a l o m l 青链霉素( 碧云天c 0 2 2 2 ) ，磁力搅拌l h 。用1 5 9 碳酸氢钠调p h 值至7 5 ，定容至1 l 。过滤灭菌，分装，4 储存。1 4 1 0i b - g a l 染色固定液：2 福尔马林4 0 甲醛1 0 m l0 2 戊二醛2 5 戊二醛1 6 m l去离子水1 8 9 4 m l混匀备用。1 4 1 11 3 - g a l 染色用缓冲液的配制：4 0 m m 柠檬酸磷酸钠( p h 6 0 ) ，) ) 1 1 k 5 m mk f e ( c n h 、15 0 r a mn a c l 、2 m mm g c l 2 。1 3徐州医学院硕士学位论文1 4 1 2x - g a l ：将1 0 0 m g 的x - g a l 溶于5 m l d m f ( n ，n - 二甲基甲酰胺中) ，配制为贮存液2 0 m g m l ，- 2 04 c 储存，使用时加入p g a l 染色用缓冲液，配制为1m g m l应用液，使用前过滤除菌，3 7 c 预温，避光。1 4 1 3r e s 浓度梯度配制：取1 0 0 m gr e s 溶于4 3 8 m ld m s o 配制为1 0 r a m 的储存液，采用耐d m s o 的n y l o n 材料滤膜过滤，分装，2 0 。c 储存，使用前以m e m 完全培养基倍比稀释成4 0 0 i t m 、2 0 0j _ t m 、1 0 0 9 m 、5 0 i t m 、2 5 i - t m 、1 2 5 p m 浓度梯度溶液备用。1 4 1 4d - 半乳糖浓度梯度配制：取1 2 8 9d - 半乳糖溶于10 m lm e m 配制为12 8 9 1 储存液，过滤除菌，4 。c 保存，使用前以m e m 完全培养基倍比稀释成6 4 鲫、3 2 朗、1 6 们、8 9 l 、4 9 1 浓度梯度溶液备用。2 方法2 1w i 3 8 。细胞常规培养传代冻存( 1 ) w i 3 8 细胞用含1 0 2 0 胎牛血清、双抗的m e m ( m i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m ) 完全培养基常规培养；( 2 ) 弃去培养瓶内的原培养液，沿着生长细胞瓶壁的对面注入3 7 p b s液，轻轻转动培养瓶以冲洗细胞，除去残余的血清；( 3 ) 用同样的方法n x o 1 2 5 ( w v ) 胰蛋白酶溶液约l m l ，旋转培养瓶使消化液覆盖细胞层约3 0 秒，弃去，重新加入新鲜胰蛋白酶溶液约1 s m l ，消化约1 2m i n ；( 3 ) 将细胞置于倒置显微镜下观察，待大部分细胞收缩变形变圆后，立即翻转培养瓶，使细胞离开消化液，弃去消化液：( 4 ) 加入等量完全培养基( 含1 0 2 0 胎牛血清) ，用吸管将细胞自瓶壁全部吹打下来，并将细胞团打散，1 0 0 0 r m i n 离，1 二, s m i n ，用培养基洗涤2次，制成细胞悬液；( 5 ) 将细胞悬液接种新培养瓶中，按1 ：2 传代培养，加入完全培养基悬浮细胞后，置3 7 c 、5 c 0 2 培养箱中培养，每二天换完全培养基一次；1 4徐州医学院硕士学位论文( 6 ) 冻存细胞悬液内血清含量调整到5 0 ，取9 5 0 “1 悬液加入5 0 p l d m s o ，混匀，以每分钟降1 的原则分别在4 放置2 0 r a i n ，2 0 放置3 0 m i n ，8 0 c 过夜，长期保存( 大于三个月) 放置于液氮内。2 2 细胞计数( 1 ) 将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。( 2 ) 将细胞悬液吸出1 0 肛l ，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。( 3 ) 静置3 m i n 。( 4 ) 计数四个大方格之细胞总数，再除4 ，乘以稀释倍数，最后乘以1 0 4 ，为每m l 中细胞悬浮液的细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞( 或上线与左线之细胞) ：细胞数m l = ( 4 大格细胞总数4 ) x 1 0 0 0 02 3m t t 法( 1 ) 检测原理：m t t 细胞增殖及细胞毒性检测以活细胞代谢物还原剂3 - ( 4 ，5 ) - d i m e t h y l t h i a h i a z o ( - z y 1 ) 35d i p h e n y t e t r a z o l i u m r o m i d e ，m t t 噻唑蓝为基础。m t t 为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c 的作用t e t r a z o l i u m 环开裂，生成结晶状的深紫色产物f o r m a z a n ，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比( 死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将m t t 还原) 。还原生成的f o r m a z a n 结晶在d m s o 溶液中溶解，用酶标仪测定4 9 0 n m 处的光密度o d 值，以反映出活细胞数目。( 2 ) 检测步骤：用5 i l l lp b s 溶解2 5 m gm 丌，配制成5 m g m l 的m t t 溶液。配制后即可使用，或直接2 0 避光保存，也可以根据需要适当分装后2 0 避光保存。m t t 溶液正常为黄绿色，如果颜色变灰则不可使用。接种细胞个数4 0 0 0 - - 6 0 0 0 孔至9 6 孔板，培养至细胞对数生长期时，按照实验需要，给予不同浓度的药物刺激，每组细胞设8 个复孔。干预结束后弃原培养基，按每孔1 0 0 “l 培养基加入1 0 1 上i m t t 溶液的比例加入m t t ，在细胞培养箱内继续孵育4 h 。1 s徐州医学院硕士学位论文每孔加入1 0 0 p 1 d m s o ，振荡溶解紫色结晶。在4 9 0 n m 测定吸光度( o d 值) 。以空f l ( p b s + 完全培养基) 无细胞组及完全培养基有细胞组作为对照。计算各组细胞在不同药物浓度下细胞存活率，计算公式：细胞存活率( ) ：塑堕鳖咝三至塑堕垒婴萼l o o 、。对照组o d 值一无细胞组o d 值2 4 总s o d 活性检测( 1 ) 检测原理：超氧化物岐化酶( s u p c r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢( h 2 0 2 ) 和氧气( 0 2 ) ，是生物体内一种重要的抗氧化酶。碧云天的总s o d 活性检测试剂盒( n b t 法) ( t o t a ls u p e r o x i d ed i s m u t a s ea s s a yk i tw i t hn b t ) 是一种基于n b t 的显色反应，通过比色来检测细胞、组织或其它样品中s o d 即超氧化物歧化酶活性的试剂盒。本方法采用经典的氮蓝四唑( n b t ) 显色，通过黄嘌呤( x a n t h i n e ) 及黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n eo x i d a s e ) 反应系统产生超氧阴离子( 0 2 ) ，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲躜( f o r m a z a n ) ，后者在5 6 0 n m 处有强吸收。而s o d 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲躜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。( 2 ) 检测步骤：应用碧云天的总s o d 活性检测试剂盒o n b t 法) 。细胞接种于六孔板上，培养至对数生长期后药物干预，中止培养后，用4 * c p b s 洗涤1 2 遍。沉淀用碧云天的w e s t e r n 及i p 细胞裂解液( p o o l 3 ) 裂解，对于裂解液或匀浆液，4 离心取上清作为待测样品。裂解或匀浆在冰上操作。配制n b t 工作液：按照每1 8 m l s o d 检测缓冲液中加入5 0 “l n b t 的比例进行配制( 用s o d 检测缓冲液将n b t 稀释约3 6 倍) ，混匀后即为n b t - v 作液。根据实验需要配制适当量的n b t 工作液，配制好的n b t 工作液4 现配现用。配制酶工作液：先把试剂盒中的酶溶液轻轻混匀，并轻轻离心沉淀酶溶液至管底。按照每2 0 0 肛1 稀释液中加入5 p l 酶溶液的比例进行配制( 用稀释液将酶溶液稀释约4 0 倍) ，混匀后即为酶工作液。可以根据实验需要配制适当量的酶1 6徐州医学院硕士学位论文工作液，配制好的酶工作液4 现配现用。酶溶液的用量比较少且易沉降，必须充分混匀。用9 6 孔板设置样品孔和空白对照孔( 分三种空白对照：空白对照1 、空白对照2 、空白对照3 ) 。3 7 孵育2 0 m i n ，在5 6 0 n r n 澳y 定吸光度。抑制百分率的计算：抑制百分率：l 竺墨兰垡塑坠二叁兰旦型墨型二竺壁旦二垒窒皇塑i l o o la 空白对照1 一a 空白对照2is o d 酶活力的计算：s o d 酶活力单位的定义，在抑制百分率为5 0 时，反应体系中的s o d 酶活力定义为一个酶活力单位。待测样品中s o d 酶活力单位：塑型亘坌兰u i l i t s1 一抑制百分率2 5s a p g a l 细胞衰老染色法( 1 ) 检测原理：细胞衰老p 半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时s a p g a l( s e n e s c e n c ea s s o c i a t e d - b g a l a c t o s i d a s e ) 活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色的检测方法。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞细胞通常体积变大，表达p h6 0 时有高酶活性的p 半乳糖苷酶。细胞衰老也被认为是生物体抑制肿瘤的一种方式，同时也是生物体老化( a 百n 曲的一种潜在原因。本法仅染色衰老细胞，不会染色衰老前的细胞( p r e s e n e s c e n tc e l l s ) 、静止期细胞( q u i e s c e n tc e l l s ) 、永生细胞( i m m o r t a lc e l l s ) 或肿瘤细胞。( 2 ) 检测步骤：在6 孔或1 2 孔或2 4 孔板中培养细胞，按实验步骤进行药物干预后，吸弃细胞徐州医学院硕士学位论文培养基，用p b s 洗涤1 次，加入适量的p 半乳糖苷酶染色固定液，室温固定1 5 m i n 。吸弃细胞固定液，用p b s 洗涤细胞3 次，每次3 m i n 。吸弃p b s ，每孔加入预温的x - g a l 染色工作液( 1 m g m 1 ) ，放入无c 0 2 ，3 7 c孵育2 4 h ( m a x ：1 2 - 1 6 h ) 。普通光学显微镜下观察，阳性细胞呈蓝绿色。计数5 0 0 个细胞，统计蓝染阳性细胞数。如不能及时观察计数，去除染色工作液，加入2 m l p b s ，4 c 可以保存数天。染色率( ) ：堕竺塑堕垫l o o 总细胞数2 6r t - p c r 法检测目的基因的转录2 6 1 提取细胞总r n a 并测定其a 2 6 0 a 2 8 0按t i a n g e n 公司t r n z o lr e a g e n t 使用说明进行，提取w i 3 8 对照组、d 半乳糖诱导衰老组和衰老后r e s 保护组总m r n a 。( 1 ) 弃6 孔板内培养液，按l o 锄2 m l 的比例加入1 r i z o ll m l ) 舌，吹打数次，移至无核酶处理过的1 5 m l e p 管内，室温放置5 m i n ，使其充分裂解( 注：此时可放入7 0 ( 2 长期保存) 。( 2 ) 4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离- 心1 0 m i n ，取上清。( 本步属于可选步骤)( 3 ) 按2 0 0 1 x l 氯仿l m lt r n z o l 加入氯仿，手动振荡混匀后室温放置3 m i n 。( 注：禁用漩涡振荡器，以免基因组断裂) 。( 4 ) 4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离一t m 0 r a i n ，样品分为三层，上层无色水相、中间层、下层黄色有机相。( 5 ) 小心吸取上层水相4 0 0 p 1 - 6 0 0 肛1 ，至另一离心管中。注：不要吸取到中间层；若同时提取d n a 和蛋白质，则保留下层酚保存于4 冰箱，若只提r n a ，则弃下层酚相。( 6 ) 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置2 0 - 3 0 m i n 。徐州医学院硕士学位论文( 7 ) 4 c ，12 0 0 0 r