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p h a 高产菌株的诱变选育及培养条件的研究 中文摘要 聚羟基脂肪酸酯( p h a ) 是一类由微生物在非平衡营养下合成的胞内贮藏性高分子 聚合物。它不仅具有高分子材料的热塑性、光学活性，还具有独特的生物可降解性和生 物相容性，极有可能成为塑料的代替品来缓解严重的环境危机，从而日益备受关注。 p h a 作为一种新型可降解性塑料，目前主要采用生物发酵法生产，此领域的研究多 集中于对有价值菌株的筛选、菌种改造、发酵条件的优化等。因此，本研究以实验室保 藏菌株y 4 为研究对象，采用紫外线及h e n e 激光复合诱变处理，获得优势变异菌株， 针对该诱变菌株设计培养基，并优化其组分，以期获得能够用于工业化生产的高产菌株。 实验结果如下： 通过紫外和h e - n e 激光复合诱变，选育出诱变菌株b y - 1 2 0 3 0 。其细胞干重为 1 3 2 9 l ，比出发菌株y - 4 的细胞干重9 2 9 l 高出4 3 5 ；p h a 的量为7 0 9 l 比y - 4 的 p h a 的量4 5g l 高出5 5 6 ；p h a 提取率为5 3 0 比y - 4 的p h a 提取率4 8 9 高出 8 4 。 进行了摇瓶发酵条件的优化实验，确定了摇瓶补料发酵的最佳条件为：2 5 蔗糖， 0 3 蛋白胨，o 3 酵母膏，0 3 硫酸铵，o 5 氯化钠，p h 为7 。培养温度为3 0 ，接 种量为1 0 ，装液量为7 0 m l 2 5 0 m l ，摇瓶转速为2 2 0 r p m 。在发酵培养1 2 h 时添加 6 m m o l l h 2 0 2 ，得到细胞干重为1 5 8 9 l ，p h a 的量9 7 9 l ，p h a 提取率为6 1 4 。 关键词： 聚羟基脂肪酸酯，诱变育种，条件优化 第一章前言 s t u d yo nm u t a t i o nb r e e d i n ga n do p t i m i z ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sf o rp o l y h y d r o x y b u t y r a t ea c i d ( p h a ) o v e r p r o d u c t i v es t r a i n s a b s t r a c t p o l y - h y d r o x y b u t y r a t ea c i d ( v h a ) i sw e l lk n o wa sak i n do ft h e r m o p l a s t i ca l i p h a t i c p o l y s t e rt h a ti ss y n t h e s i z e da n da c c u m u l a t e di n t r a c e l l u l a r l yd u r i n gu n b a l a n c e dg r o w t hb y m i c r o o r g a n i s m n o w a d a y s ，p h ah a v ea t t r a c t e di n c r e a s i n g i n t e r e s ta sa na l t e r n a t i v et o p e t r o l e u m d e r i v e dp l a s t i c sf o ri t ss i m i l a rm e c h a n i c a lp r o p e r t i e st ot h o s eo fp o l y p r o p y l e n e ，a s w e l la si t sa d d i t i o n a l a d v a n t a g e o f b e i n gc o m p l e t e l yb i o d e g r a d a b l e ，b i o c o m p a t i b l e ， n o n t o x i c i t ya n de t c a san e wk i n do fb i o d e g r a d a b l ep l a s t i c ，p h ah a sb e e np r o d u c e db yb i o l o g i c a lf e r m e n t p r e s e n t l y s of a r , m a n yr e s e a r c hf o c u s e do ns e p a r a t i n gv a l u a b l es t r a i n sw h i c hc a np r o d u c e p h a ，p r o d u c i n gs r a i n st h r o u g hc o m p o u n dm u t a t i o n ，a n ds u d y i n go nt h eo p t i m i z a t i o n a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w ec o m p o u n dm u t a t i o nt o p r o d u c i n g s r a i n sf r o my - 4w h i c h c o n s e r v e db yo u rl a b o r a t o r y , t h e ns t u d yo nt h eo p t i m i z a t i o n a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f o v e r p r o d u c t i v es t r a i n sj ho r d e rt op r o v i d ean e wo v e r p r o d u c t i v es t r a i nf o ri n d u s t r i a l i z a t i o n f o l l o w i n gr e s u l t sh a v eb e e no b t a i n e di nt h i ss t u d y t h em u t a t i o ns t r a i ni sa t t a i n e db yu va n dh e - n el a s e r t h ed e s i c c a t e dc e l l m a s sf r o m b y - 1 2 0 3 0w a s1 3 2 9 le n h a n c i n g4 3 5 ：p h ay i e l df r o mb y - 1 2 0 3 0w a s7 0g le n h a n c i n g 5 5 6 ：p h ap r o d u c t i o nr a t i of r o mb y - 1 2 0 3 0w a s5 3 0 e n h a n c i n g8 4 e x p e r i m e n t i z e dt h es h a k eb o r i cf e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o na n dt h eb e s ts u p p l e m e n t e d m e d i u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w ：2 5 c a n es u g a r , o 3 p r o t e o s ep e p t o n e ， o 3 y e a s te x t r a c t ，o 3 ( n i - h ) 2 s 0 4 ，o 5 n a c l ，i n i t i a lp h = 7 ，10 i n o c u l a t i o na m o u n t ， l i q u i dc a p a c i t y7 0 m li n2 5 0 m lf l a s k ，a tt e m p e r a t u r eo f3 0 c ，w i t h2 2 0r e v o l u t i o n sp e r m i n u t e s u p p l e m e n t e d6 m m o l lh 2 0 2a t12 h ，d e s i c c a t e dc e l l m a s sw a s15 8g l ，p h ay i e l d w a s9 7 l ，p h ap r o d u c t i o nr a t i ow a s614 k e yw o r d s ： p o l y h y d r o x y b u t y r a t ea c i d ( p h a ) ，m u t a t i o nb r e e d i n g ，o p t i m i z a t i o no f t e s tc o n d i t i o n s h 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：么互! i 刍指导教师签名：薹望叠 渺7 年月，日卅年多月旧 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者虢枥勺蔼 k 7 年莎月，日 两北大学硕十学位论文 第一章前言 自从2 0 0 8 年6 月1f 1 起，全国各大超市停止免费提供塑料袋，这标志着，我国加 强了对“白色污染”的治理。我国是塑料制品生产和消费的大国，据有关资料显示川，每 年的使用量高达四千万吨，其涉及的领域包括工业、农业、医药以及人们的日常生活等。 传统塑料以其可塑性强，使用范围广，方便廉价曾一度促进社会的发展，提高国民 产值，而其弊端也逐渐暴露出来，变成不得不面临的又一危机。首先，传统塑料使用范 围广，造成的环境污染也是“幅员辽阔”，极大危害环境保护。其次，传统塑料难以处理， 焚烧会造成空气污染，掩埋在土里上百年也不能降解，对周围的生态坏境是极大的危害。 塑料以其耐酸、耐碱、耐腐蚀、抗氧化和难降解为环境保护和回收利用带来了巨大的困 扰和麻烦【2 】。最后，将废弃的塑料制品，重新加工到可以再次利用不仅耗费更多的能量， 而且造价更高，这就为塑料的回收利用带来极大的阻力。经济问题，技术力量都是是塑 料再回收利用的最大障碍。 正是由于传统塑料的诸多危害性，国内外的科学家采取了多样的方法治理“白色污 染”，而收效甚微，大家一致认为要改变这种现状，最有效的是从源头入手，使用那些 能降解，易分解的环保塑料来替代传统的塑料制品【3 】。可降解塑料就是一种不依赖石油 资源，运用生物技术手段将可再生资源转化成生物可降解的聚合物高科技材料。首先， 相较于传统塑料难降解的特点，可降解塑料可以完全分解回归自然。不仅不会对环境造 成污染，而且还为生态循环做出贡献，是环保和节能的一项创举【4 】。其次，可降解塑料 理化性质类似于传统的塑料，这就提供了取代传统塑料的可能性。 按照促进化学结构发生降解变化的因素来分类，可降解塑料可分为光降解塑料、生 物降解塑料和光生物降解塑料三种【5 】。光降解塑料主要是指利用紫外光引起光化学反应 而分解的塑料，即塑料吸收紫外光后发生引发作用，使键能减弱，分裂成较低分子量的 片，经过一系列反应后，最终降解成为水和二氧化碳。生物降解塑料，亦称为“绿色生 态材料”，指的是在土壤微生物和酶的作用下能降解的塑料。在这一类中，研究最多的 就是微生物合成的降解塑料，其中又以p h a 家族的研究最为广泛【6 】。光生物降解塑料 是结合光和生物的降解作用，达到较完全降解目的可降解塑料。 为解决塑料污染问题，世界上一些主要国家和著名公司投入大量资会丌发研究可降 解材料，并已取得引人瞩目的进展。一些可降解塑料产品也已进入市场，实现工业化，匕产 【1 7 1 。其中，尤以生物降解性塑料p h a 的研究最为深入。 第一章前言 1p h a 的基本性质 采用微生物发酵法生产的可降解塑料聚羟基脂肪酸酯( p h a ) 的开发始于十九世纪。 i c i 公司首次采用天然土壤中微生物发酵生产了p h a 。同时，m a s s a c h u s e t t s 技术学院( m t i ) 开始采用工程菌生产p h a ，并于1 9 9 2 年诞生了m e t a b o l i x 公司。自石油危机和环保运 动开展后p h a 的研究就受到广泛的重视，直到现在，跨越了几十年的发展，大众对p h a 的关注依旧是有增无减。 1 1 p h a 的分子式及分类 已鉴定的p h a 有4 0 多种，不同的p h a 有不同的分子式，如图1 1 所示。 ro 壬。二6 h 一( c h 2 ) m c i i + n 图1 1p h a 的通式1 8 i f i g 1 - 1 s t r u c t u r a lf o r m u l ao fp h a 其中，c 1 c 1 1 ；m = l 3 ；n = 1 0 0 3 0 0 0 ，而r 多为不同链长正烷酸基，也可以是支 链的、不饱和的或带有取代基的烷基。例如：r 为甲基时，单体为p 羟基丁酸( h b ) ， 其聚合物为聚p 一羟基丁酸( p h b ) ；当r 为乙基时，单体为b 羟基戊酸( h v ) ，其聚合 物为聚p 一羟基戊酸( p h v ) ；r 为丙基时，单体为p 羟基己酸( h c ) ，其聚合物为聚1 3 一 羟基己酸( p h c ) ，以此类推。同时，不排除在一定条件下，两种或两种以上的单体共 同组成聚合物，其最具有代表性的是p h b v 【9 1 。 p h b ( p o l y h y d r o x y b u t y r i c a c i d 或p o l y h y d ro x y b u t y r a t e ) 是p h a 家族中研究最早，最 透彻的一个成员。早在1 9 2 5 年l e m o i g n e 首先发现了p h b ，随后又从巨大芽孢杆菌 ( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 中分离并鉴定了该物质【1 0 , 1 1 】。p h b 的发现为p h a 的研究奠定了 坚实的基础。 目前为止，已经发现不下百余种不同的脂肪酸作为p h a 的单体【l 列，其中包括碳原 子数目从3 到1 4 的大量含饱和或不饱和键或支链的脂肪族以及芳香族b 羟基脂肪酸。 根据单体中碳原子的数目可以将p h a 分为两类即短链p h a 和中链p h a 。 1 2p h a 的理化性质 最初，人们一直认为p h a 在胞内是以结晶固体的形式存在的1 1 3 , 1 4 l ，但自从s a n d e r s 等利用溶液n m r 技术证明p h a 在胞内是以一种无定形态的形式存在后，愈来愈多的 研究者赞同这种观点1 1 5 , 1 6 】。当p h a 颗粒在外界作用下发生颗粒膜破裂等情况时，p h a 2 两北大学硕十学位论文 会发生结晶形态的改变【1 7 , 1 8 1 。 p h a 是复杂的亚细胞颗粒，典型的p h a 直径约为0 2 0 5 r i m ，外膜厚约为2 r i m 由 0 5 脂类和蛋白质组成。其中脂成分是由一种丙酮可溶性脂和一种单磷脂酸组成f 拇1 。由 于存丙酮可溶性脂的存在，在后期提取p h a 颗粒时，采用丙酮对细胞进行处理，除去 外膜蛋白是一种有效的预处理方法。然而，p h a 颗粒中含有与合成和降解p h a 相关的 结合因子，要用温和的方法去除疏松的结合物质后才能分离到完整的p h a t 2 0 1 。因此丙 酮的除蛋白能力虽强，但要注意浓度和作用时间，才能既不损害到p h a 粒子影响其纯 度，又可以高效而简便的提取p h a 。 p h a 颗粒数目在细胞积累初期就己固定，p h a 的积累量的增加只是p h a 颗粒的体 积不断随着p h a 合成速率的提高而逐渐变大最终形成致密的小球。这就可以解释为何 p h a 的积累与菌体量是同步进行，同步完成的。p h a 的积累量由于受细胞壁的物理限 制作用，即使有足够的底物和p h a 合成酶也不能无限量的增加【2 l 】。 p h a 的主要优点是其理化性质接近于聚丙烯，完全可以取代传统塑料来进行加工生 产，可采用生物技术生产工艺，促进多样产品的形成，与此同时，p h a 家族的成员都可 以通过生物降解，最终降解成二氧化碳和水，对环境无污染，达到环保的目的。p h a 与 传统塑料部分性能的比较，见表l 一1 所示。 表1 1 多聚羟基烷酸与传统塑料的性能比较1 1 4 i t a b l e 1 - 1t h eq u a l i t a t i v eo fp h ac o m p a r ew i t hp p 由表1 1 可以看出p h a 家族成员与传统塑料在物理化学性质上和分子结构上有惊 人的相似之处，完全有理由取代传统塑剃2 2 1 。优点是透氧率低，抗紫外线照射强。p h a 易溶于氯仿，三氯乙烯等含卤素的有机溶剂，不溶于乙醚和乙醇，可以进行皂化反应而 降解，在浓硫酸中加热时，p h a 转变成巴豆酸。 第一章前言 2p h a 合成的研究 2 1 化学合成法 从基本化学原料( 3 一羟基丁酸酯等) 出发，通过化学反应末合成p h a 的方法就叫 做化学合成法。采用化学法合成p h a 主要具有以下两条优点：首先化学合成法简化生 产过程，提高生产效率，降低生产成本、提高产量，从而使p h a 的应用更加广泛。其 次，在调节聚合物结构方面更具灵活性。人们可以通过选取不同的合成方法和条件、调 整聚合物的结构，从而改善聚合物的性能，以适应不同应用领域的需要。 h a n sr k r i c h e l d o r f 等【2 3 】采用本体聚合及溶液聚合方法制备p h a ，利用氧化二丁基 锡，氧化二乙基锡，氧化二辛基锡及氧化二甲基锡作为催化剂，取得了良好的效果，可 以得到1 0 0 ，0 0 0 以上的重均相对分子质量的p h a 。国内学者王加宁等，采用p 羟基丁酸 乙酯单体【2 4 l 作为原料，通过酯交换法制备p h a ，在1 6 0 。c 下反应，以钛酸四异丙酯为催 化剂，得到分子质量最高为5 0 0 0 左右的p h a 。 尽管化学法合成p h a 有很多优点，但其缺点也是很明显的。首先，化学法合成法 的生产过程简单，但化学反应中技术控制难度较高，不容易达成期望的合成目的，产物 的性质不易于控制。其次，由于合成的是多分子的聚合物，对于再和其他物质的混合和 共聚造成严重的不便，有时还会无法混合。因此，化学合成法的技术还有待于改进和提 高，尚未进入工业化大规模生产，仍处于实验室研究阶段。 2 2 转基因植物生产法 为降低p h a 的生产成本，人们进行了各种尝试。其中，以植物为表达载体，利用 二氧化碳及光能合成p h a ，从而实现大规模廉价生产p h a 的想法，是一种从根本上解 决原料成本过高问题的理想途径。迄今为止，已作为合成酶基因表达受体生产的植物主 要有拟南芥、油菜、马铃薯、棉花、蓝细菌等。 植物生产p h a 无疑是一种理想的好方法，但同时也存在很多问题。植物生产p h a 时必须关闭其他的合成路线，以便使植物体内的所有能量都能用于合成p h a ，但这种情 况很大程度上会影响植物自身的生长发育。并且，从植物中提取p h a 比从微生物中更 复杂和困难，给后期提取工艺带来巨大的麻烦。 吴桂芳【2 5 l 等对转基因植物生产p h a 展丌研究，发现p h a 积累的最高水平为干细胞 的7 ，浓度为7 7 m g l ，产率为7 7 m g l d 。由此可见，转基因植物中合成的p h a 提取 率还很有限，无法投入生产。因此，转基i 大l 植物生产p h a 的道路还需要专家和学者不 4 西北人学硕十学位论文 断的努力研究。 2 3 微生物发酵法 2 3 1 微生物合成p h a 的途径 微生物发酵生产是获得生物可降解塑料的主要途径。 p h a 合成途径依微生物种类所利用基质的不同而不同。大多数微生物通过三步代谢 途径合成p h a ，过程如图1 2 所示。 p 酮硫裂解酶催化乙酰c o a 生成乙酰乙酰c o a 。 在依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶的作用下把乙酰乙酰c o a 还原成 d ( ) 一3 一羟基丁酰c o a 。 单体d 一( ) 一3 羟基丁酰c o a 由p h a 合酶催化聚合成p h a 合成。 c n 枷世：烈 掰酸 m 8 、| k a t p i 、a m p + p p 。 聚c o a 1 lc o a s h 4 a d ( 一，一3 一轻缓c o ad 一) 一，一鲐j 缓c o 暂- i - - 一i 一3 一静缆黢c o a 夕 lc o a s hc 。a 。h 卜c 。a 。h p h ap h 8p h b v 图1 - 2 不同微生物合成p h a 的主要途径 f i g 1 - 2t h ea c e s so fp h ab ym i c r o o r g a n i s m 早在8 0 年代后期，就已经有人开始用分子生物学技术深入分析p h a 合成的关键 酶。就目前所知，已从3 8 种细菌中克隆到4 2 个p h a 合成基因，其中3 0 个基因的核酸 序列己清楚【2 6 1 。p h a 合成酶位于p h a 颗粒上，是控制p h a 合成的最关键的酶，但此 酶难以纯化且纯化后不稳定，至今其e c 号码还末确定。p h a 合成酶催化合成聚合物反 6 ， ” 2 ，甲 精 ，5 第一章前言 应机制似乎类似于脂肪酸合成酶系统，其活性中心位于3 1 9 位的半胱氨酸和2 6 0 位的丝 氨酸上【2 7 1 。据研究，十多种细菌的p h a 合成酶都在这两个位点上保守一致。虽然，对 于p h a 合成酶我们有了一定的了解，但目前为止，对p h a 合成酶的认识仍不完全，有 待进一步的研究。 2 3 2 合成p h a 的微生物种类 自从1 9 2 6 年在巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t h e r i u m ) 中发现p h a 到目前为止，已 在包括光能化能、自养、异养的约3 0 0 种细菌中发现p h a 的存在。能合成p h a 的菌种 属众多，然而不同的菌属对底物的要求、所合成p h a 的结构、产率甚至合成机制均有 很大差别。能产生p h a 的主要种类见表1 2 。 表i 2能合成p h a 的微生物 t a b l e 1 - 2s o m eb a c t e r i au s e da sb i o s y n t h e s i so fp h a 由表1 2 呵以看出，能产生p h a 的微生物种类非常多，通常在自然环境中微生物 能储备细胞于重的5 2 0 的p h a ，这样的含量远远不能够满足工业化发展的需要。 6 西北人学硕十学位论文 2 3 3 p h a 的降解机理 p h a 具有生物可降解性，生物相容性。p h a 作为一种生物可完全降解塑料，无论 在有氧或无氧情况下，均可被生物完全降解。在好氧条件下，p h a 降解时除产生极少的 b 一羟基丁酸外，均被氧化为二氧化碳和水。环境中许多种微生物都可以利用p h a 作为 碳源生长而使其充分降解，特别是假单胞菌属是强烈的降解菌嘲。不同种类微生物降解 p h a 的方式机理也不尽相同。 生物机体对许多材料具有强烈的排斥作用，而p h a 具有良好的生物相容性，在生 物机体内容易被机体水解成p 一羟基丁酸，最后通过酮代谢成二氧化碳和水。其降解机制 为：p h a 表面的羟基和羧基逐渐增加，在微生物分泌的解酯酶的作用下，形成p h a 的 单体、二聚体和三聚体进入微生物细胞参与代谢循环，从而达到了对p h a 的降解作用。 p h a 反应方程式如下： 2 ( c 4 h 6 0 2 ) n 十9 n0 2 _ 8 nc 0 2 + 6 nh 2 0 综上所述，无论那种方法生产的p h a ，微生物法合成法或是化学法，都是可以被生 物所降解的。因此，p h a 无疑是一种很有前途的绿色材料。 2 4 基因工程菌合成法 从八十年代开始，研究人员已经开始着手通过分子生物学技术来研究p h a 的合成。 例如，将p h a 合成关键酶基因通过基因工程技术转入能够利用廉价底物的菌株( 如大 肠杆菌) 来合成p h a 。 利用重组大肠杆菌生产p h a 有诸多好处。首先大肠杆菌生长迅速，易于高密度培 养，其次它能利用多种廉价碳源，且体内积累p h a 的量大。最后，细胞内无p h a 解聚 酶，抽提更加简便易行。奥地利维也纳大学在组建ec o l i 工程菌时加入热敏噬菌体融 解基因，使细菌易裂解释放p h a 从而降低了提取成本。 虽然基因工程技术应用于p h a 的合成，为其扩大发展提供了一种新的途径，也确 实行之有效，但基因工程法生产p h a ，对于菌株质量要求高，且难以保证高拷贝的质粒 稳定而可靠的表达，这是关于基因工程菌种的难题。同时，重组e c o l i 发酵需要解决的 是高密度发酵时高需氧量的问题。 3p h a 的检测方法 p h a 检测方法主要有p h a 的染色法，重量法，分光光度法，气相色谱2 训、核磁共 7 第一章前言 振3 0 1 、高效液相1 3 l 】、质谱 3 2 1 、气相色谱质谱法【3 3 j 、傅立叶红外光谱1 3 4 】以及浓硫酸降解 法【3 5 】等。 3 1 染色法 p h a 的定性检测普遍采用染色法。使用的染料是：脂类的苏丹黑b 或尼罗兰a ， 方便快速。苏丹黑染色f 3 6 1 是使用脂溶性染料对微生物细胞进行染色，染色后用显微镜进 行检测。尼罗兰a 【3 7 】对p h a 进行染色时具有荧光，因此用荧光分光光度计还可直接检 测到细胞中p h a 的含量。尼罗兰a 染色对p h a 专一性较强，可使p h a 与其他非p h a 脂类化合物区分开。 3 ，2 气相色谱法 气相色谱法的最大优点在于不需将细胞内p h a 高度纯化就可检测其p h a 提取率， 是一种较新、较准确的测定方法。缺点也很突出，需要高纯度的p h a 标准样品，以及 价格昂贵的气相色谱仪。因此，在有条件的实验室和公司，可以采用气相色谱法进行 p h a 的鉴定，而一般的院校就需要考虑其他的简便廉价的方法。 3 3 红外光谱法 红外光谱通过记录样品的红外吸收进行定性和结构分析的方法【3 8 】。无损样品的傅立 叶红外光谱法能在不破坏细胞的条件下进行细胞成分分析。只要将几微克细胞直接涂在 盐片上检测，可以定性也可以定量、非常快速和简单。 4p h a 的用途 p h a 作为生物可降解的热塑性聚酯类高分子材料，应用范围相当广泛。从日常生活 到科学研究，从医院手术室到农村大田，到处都有其广泛的应用空间。p h a 可用作各种 纸张涂膜、污水处理用细菌床、电信器件外壳、医用塑料、软骨组织、血管组织等。近 些年，p h a 的发展势头迅猛，应用领域也逐渐增加。 4 1p h a 在塑料领域的应用 p h a 作为可降解塑料中研究最多，范围最广的一种塑料代替品，在塑料制品业的发 展占据首要地位【3 9 1 。用p h a 制成的塑料制品，使用范围广，完全可以取代传统塑料， 而且不会污染环境，在自然条件下就可以完全降解成为二氧化碳和水。 p h a 可用于绿色包装材料与容器、耐热耐水耐油制品、妇女卫生用品、尿布等可任 意处理的物品，作为音响设别的薄膜，以及农用薄膜等有重要的作用。由p h a 制成的 两北人学硕士学位论文 地膜替代传统的地膜后，可消传统塑料残留在土壤中对农作物造成危害。用作容器可减 少现在化工合成塑料容器对环境造成的白色污染，保护环境。 4 2p h a 在医药领域的应用 p h a 具有良好的生物相容性，避免了人工合成时引发剂或单体等残留于生物材料中 引起毒性等问题，引起了医药学界广泛的关注【1 0 , 1 1 ，4 0 1 。一般而言，生物机体对于异物均 具有强烈的排斥作用，而p h a 就不存在这种现象，在机体内容易被水解成单体b 羟基 丁酸，最后通过酮代谢成为二氧化碳和水。同时，血小板的吸附、补体的活化和血浆的 钙化等检测结果显示p h a 有良好的血液相容性，p h a 和血液接触后不会引发凝血反应， 没有慢性免疫反应的发生。 p h a 水解后产生的b 羟基丁酸，是人体代谢产物的一种，无毒无害，不仅如此， 1 3 一羟基丁酸单体可作为制备手性衍生物的原料【1 引。由1 3 羟基丁酸单体制成的手性衍生 物可被广泛应用于抗生素，维生素，芳香素和信息素等化学药品的合成，与常规药物相 比，手性药物更安全、有效、使用剂量也更小。 由于p h a 具有良好的生物可降解性，作为药物载体被植入体内后，不会产生不良 反应和现象，不会引起机体的免疫反应，同时又有效的控制药物的释放。当药物释放完 后，作为载体基质的p h a 在人体内自然降解，可见p h a 是安全而健康的载体选择。p h a 最初被用于可吸收缝线，目前已广泛应用于整形外科，载药控缓释微球等领域【4 1 1 。 4 3p h a 在组织学的应用 p h a 在组织学有相当广泛的应用，主要领域有：软骨组织工程、骨组织工程、血管 组织工程、神经系统组织工程、心脏瓣膜组织工程以及皮肤组织工程掣1 5 , 1 6 】。 早在1 9 8 8 美国v a c a n t i t 4 2 j 把生物材料聚羟基酸( p g a ) 和聚乳酸( p l a ) 应用于新 的软骨组织，为组织和器官的移植带来了无限的可能。l a n g e rr 1 4 3 1 等用聚氟乙烯制成管 状物在进行内皮细胞培养后，成功获得人工血管。现在已经逐步开始研究以p h a 为基 材的人工血管。由于p h a 对血清蛋白有清除作用，可以防止栓塞。对p h a 材料表面修 饰也可促进p h a 与血液的亲和力，同时也可精确调节p h a 支架的降解速率。新的血管 形成之时，p h a 支架也可以完全降解，从而达到对缺损血管组织的修复作用。 h a z a r i l 4 4 j 等在猫体上对初级神经的修复进行了研究。他们将横断的放射状神经移植 到以p h a 为基材的薄片上进行培养，一年后发现神经纤维直径变大，且在未梢神经中 发现越来越多的有髓鞘的神经经突，这表明培养的神经在不断的成熟。v a c a n t i 【4 5 】等在羊 9 第一章前言 体的骨动脉上采集纤维母细胞和内皮细胞，然后在p h a 纤维支架上种植。将此心脏瓣 膜移植到羊体上，实验显示其能够承担正常功能。d o y l e l 4 6 】等研究了应用人类真皮成纤 细胞在具有降解性的p h a 的织网上可以增殖。 4 4 p h a 在环境方面的应用 p h a 可以作为环境的标记。p h a 是在营养不平衡的环境中，微生物菌体利用环境 中过剩的碳源转化为自身的能力蓄积的产物。而碳源较丰富的环境大多数细菌都具备将 这种能力。因此，有理由认为，通过检测微生物聚集p h a 的能力，可以衡量出环境污 染的程度。 4 5p h a 在其他方面的应用 p h a 不仅可用于制造能分解的纤维和纺织品，同时也应用于诸多的包装材料。除此 之外，利用p h a 具有高结晶点的特点，压力传感器、点火器、声学仪器和振荡发生器 等物品上也经常使用p h a 材料。 5 生物发酵法生产p h a 的影响因素 5 1 优良菌株的筛选 微生物生产p h a 的关键和前提是有一株性能优良的菌种。筛选菌株被称为整个生 产的初始工作。从自然界筛选菌种是最普通，也是最常用的菌种筛选方法，然而仅仅通 过筛选得到的野生菌种很难满足工业化生产的要求，在实验室里通常都会采用一些诱变 方法来优化菌种，使得菌种的性能和产量增高。 由于自然突变频率低，单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行的自然选育无疑不 能满足生产实践的需要，诱变育种就应运而生。人们把能诱发基因突变、并使突变率提 高到超过自发突变水平的物理或化学因子叫做诱变剂。诱变剂种类很多，大体可以分为 物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。 5 1 1 物理诱变剂 物理诱变是使用辐射中的各种射线为诱变源，对生物靶进行诱变。物理诱变剂包括 紫外光、0 t 射线、1 3 射线、x 射线、丫射线、快中子、和超声波等。物理诱变剂对生物体 的作用主要是高能辐射引起生物系统的损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反 应过程【4 7 j 。其中，以操作简单，效果良好的紫外线使用范围最广。 紫外光是一种人眼不能感知的电磁波，在电磁波谱中，位于可见光紫光的外侧，能 1 0 两北人学硕+ 学l 寺= 论文 使被照射物质的分子或原子中的内层电子发生能量的跃迁，导致分子的理化变化。关于 紫外线诱变机理有诸多的解释，在d n a 上的生物学效应主要有形成嘧啶二聚体； 形成嘧啶的水合物；是d n a 分子交联。其中最重要的就是嘧啶二聚体的形成，这会 阻碍双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导致基因突变。由于存在光复活作 用，即白光照射能活化光激活酶并将嘧啶二聚体解开而使d n a 恢复正常，故辐照和处 理后的培养应避免可见光照射。 紫外线的光谱范围在1 3 6 3 9 0 n m ，而d n a 可以吸收的紫外线光谱通常为2 6 0 n m ， 因此能诱发微生物突变的紫外线的有效的波长最佳为2 5 3 7 n m 。紫外线可由紫外灯管产 生，影响紫外诱变的主要因素有紫外灯的功率，照射时间和照射距离等。 紫外诱变在诱变育种中占有重要地位，王慕华【4 8 】等人通过紫外诱变选育耐糖d 核 糖高产菌株，潘涛【4 9 l 等人通过紫外线诱变得到一株高产柠檬酸的生产菌株黑曲霉，比出 发菌株产量高5 左右。虽然紫外诱变凭借自己操作简便，设别简单曾经一度成为诱变 育种中不可缺少的诱变剂，但随着多种诱变剂的出现，紫外诱变的影响效果小，且遗传 性不稳定的特点，限制了其发展，许多研究者纷纷转向另外的诱变方法或复合使用多种 诱变方法来达到诱变目的1 5 0 1 。 5 1 2 化学诱变剂 化学诱变剂是一些能对d n a 分子起作用，改变其结构，并引起遗传性变异的化学 物质。对比紫外和激光辐射诱变，化学诱变造成的结果通常是点突变，适用于针对性强 的诱变育种领域。化学诱变剂往往具有专一性，对基因的某部位发生作用，而对其余部 位无影响，剂量主要决定于其浓度和作用时间。化学诱变剂种类极多，主要包括碱基类 似物、烷化剂、码移突变剂以及其他类等。 5 1 3 生物诱变剂 目前认为生物诱变剂按诱变方式可分为以下三类：转导诱发突变转化诱发突变 转座诱发突变。噬菌体，特别是溶原性噬菌体是一种遗传信息的传递者，在筛选抗噬 菌体菌株的过程中，经常发现一些产量明显提高的抗性菌株，因而有人把噬菌体看作一 种诱变剂。还有一种基因点突变技术，不过有其相当的局限性，它只能对天然蛋白质中 某些氨基酸进行替换，而高级结构基本不变，因此对酶的功能改造非常有限，作为诱变 的技术还有待于研究和改进。 5 1 4 新型诱变剂 第一章前言 虽然传统的诱变技术设别简单，操作方便，而且在微生物育种方面已经起到过极大 的作用，但是，长期、重复使用某种诱变源，往往会导致突变率低、抗性饱和等缺点的 出现。因此，一些新型、高效的诱变方法应运而生，在一定程度上能克服菌种对传统诱 变源的抗性饱，一经开发就快得到应用。主要的新技术包括有，微波辐射f 5 2 】、空问诱 变、离子注入诱变【5 3 】、激光诱变等。 激光是一种光量子流，又称光微粒。激光辐射通过光效应和电磁场效应对生物体进 行作用，直接或间接影响生物有机体，引起d n a 的改变，引起细胞分裂和细胞代谢活 动改变。依据激光的波长不同可分为：6 0 - 3 8 0 n m 的紫外激光、( 如n 2 激光) ；4 4 0 一 7 0 0 n m 的可见光激光( 如h e n e 激光) ；9 0 0 - - 4 4 7 2 1 0 3 n n l 的红外激光，( 如c 0 2 激光) 。 5 1 5 复合诱变 随着育种技术的不断探索和研究，专家学者发现，某些诱变源单独对微生物进行诱 变时效果不甚理想，但与其它诱变源进行复合诱变，则能起到较好效果。以激光，微波， 离子束犹为代表的这类诱变剂就叫做“增变剂”。 复合处理有几类：同一种诱变剂的重复使用( 例如：紫外线照射后的光复活再进行 紫外照射) ，两种或多种诱变剂先后使用( 例如：先紫外照射后激光照射) ，两种或多种 诱变剂同时使用( 例如，化学试剂和物理诱变同时使用) 。无论采用何种方法，以达到 诱变目的为依据，选择合适的方法和操作技术。 5 2 优化培养条件 微生物生产p h a ，除了高产的菌株外，还要有适合菌株生长的培养环境，因此，优 化培养条件是影响p h a 产量的另一个重要因素。 5 2 1 优化培养基 培养基是提供微生物生长繁殖和促进合成产物所必须的各种营养物质的混合物，是 微生物的物质、能量的重要来源。培养基的组分、浓度以及多少对于菌体生长、产物的 合成以及产物后期的分离提取都有重要的影响。积累p h a 的微生物因碳源不同而合成 不同含量和组分的p h a 。大多数积累p h a 的菌株，添加丙酸、戊酸等有机酸前体，就 会转为积累p h b v ，其组分比例主要由碳源和前体的比例而定【5 5 】。l e m o s 等研究发现用 乙酸做碳源时，聚磷菌主要合成h b 和h v 的共聚物，而丙酸则主要用来合成h v 单体。 d a v i d e 等发现分别以乙酸、丙酸、乳酸为单一碳源时，合成的聚合物为均一单体，共聚 物只在丙酸和其他两种酸任意一种共存时产生。此外，碳源占了全部的生产价格的4 0 两北大学硕十学位论文 5 0 。如果采用廉价的底物，如农业有机废弃物及食品工业废弃物等，可以使p h a 的 生产成本大大降低。因此廉价且易于利用的碳源是人们追寻的理想原料。 氮源的种类和含量以及c n 比对p h a 的百分含量也有很大影响【5 6 1 。分批补料发酵 也表明，较高浓度的总碳源得到的菌体p h a 提取率较分批发酵高，因此人们采用补料 技术不仅提高菌体量，也有利于p h a 的积累。氮源对p h a 的积累是必需的，若没有氮 源，p h a 合成酶活性下降并可能会引起己积累的p h a 降解。 5 2 2 优化温度 温度是影响机体生长与存活的重要因素之一。温度可以分为，最适温度，致死温度 等。最适温度是同时适合菌体生长和目的产物合成的温度。但最适生长温度与最适生产 温度往往不一致。从理论上讲，应该区分两者，在一个生产过程中，应该变温培养。但 有时，当菌体的生长与产物的积累同时进行，且这两者的最适温度差异不大的时候，可 以考虑选取适中的温度进行培养。k r i s h n a 5 7 1 等研究了在好氧瞬时供料条件下以乙酸作为 碳源时温度对合成的影响。发现随温度的上升，p h a 的产量却下降，考虑可能是溶氧减 少的原因。 5 2 3 优化p h 值 培养基的酸碱度是另一个影响微生物生长和产物积累的重要因素。培养过程中培养 基的p h 值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，可以影响微生物菌体生长、 代谢产物积累、菌体的形态大小、对微量元素的吸收以及各种酶的活性。且在培养过程 中，某些菌种会产酸产碱，从而改变了培养基的p h 值，对菌体的生长，产物的积累也 造成重要的影响。p h a 积累也受p h 的影响。最适菌体生长的p h 在7 左右，而最佳积 累产物的p h 要低点，在6 5 左右，作为发酵罐培养时，就应该根据需要调节p h 值，以 满足不同时段的p h 要求。因此，培养基的p h 值和培养过程中p h 值的变化一直都是需 要重视和关注的，是衡量整个培养过程的重要指标之一。 5 2 4 优化溶氧量 溶氧量是关系p h a 积累的一个重要影响因素。对于好氧菌的培养而言，菌体生长 是需要充足的溶氧量，而菌体合成p h a 时则需要较低的溶氧量。溶氧量还影响p h a 的 产率及3 h v 的含量，低溶氧浓度下h v 单体含量为高溶氧浓度下的2 3 倍，但合成h b 单体的速率明显下降f 5 引。总之，溶氧量是很重要的衡量因子，氧气的供给是通过调节转 第一章前言 速和通气量来实现的。转速慢，培养基内的溶解氧少，影响菌体生长，同时也导致代谢 产物产量降低；转速过快，机械刺激过于强烈，同样也影响菌体和产物的产量。 5 3p h a 的提取 p h a 的后期提取价格高，是工业生产p h a 成本过高的最主要原因之。由于p h a 提取方法涉及p h a 的纯度，提取率以及分子量，这些都关系着最终p h a 理化的性能以 及生产成本的高低，所以p h a 提取方法是各专家学者孜孜不断的研究方向。 细胞破壁是从细菌中提取p h a 的必要手段，大规模的细胞破壁，通常采用的是高 压均质或高速珠研磨。细胞壁是机械破碎的主要障碍，因此使用化学试剂预处理能降低 细胞壁强度，从而减少操作压力。碱性条件下细胞壁的强度变弱，因此在机械破碎前， 调节p h 以及加入化学试剂提取p h a 的效果更加理想。 有机溶剂抽提方法较多，氯代烃【5 9 1 ，如氯仿、亚甲基氯和一氯乙烷等氯