（遗传学专业论文）一例自发性静脉血栓症家系蛋白c基因的初步研究.pdf

摘要 摘要 蛋白c 是一种维生素k 依赖性的丝氨酸蛋白酶，活化的蛋白c ( a c t i v a t e d p r o t e i n c ) 可特异性失活凝血活化辅因子v ( v ) 和( ) ， 在凝血抗凝血系统中起着重要的调节作用。蛋白c 基因异常或一些后天 因素可造成蛋白c 缺陷，其常与其它先天或后天危险因子共同作用引发 静脉血栓的发生。 蛋白c 缺陷是引起深静脉血栓( d e e p v e i nt h r o m b o s i s ，d v t ) 的一个 常见原因。目前临床上已报道了3 0 0 多例与蛋白c 缺陷有关的静脉血栓 病例，共发现了约1 3 0 种不同的突变。由于蛋白c 基因突变形式很多， 临床上没有建立完善的检测手段，到目前为止，尚未能详尽地阐明蛋白c 突变与静脉血栓形成的分子机制。目前该领域的研究主要集中在欧洲和美 国，国内相关方面的研究较少。我们发现了一个具有明显遗传倾向的自发 性静脉血栓症家系，并试图在该家系中探索蛋白c 基因是否存在异常。 通过对该家系三代中7 名成员的蛋白c 基因的研究，经d n a 测序共找到 6 个突变，其中5 个为错义突变，均位于蛋白c 外显子9 编码区内即丝氨 酸蛋白酶活性结构域内：另一个为缺失突变，位于外显子9 的3 端u t r 区( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) 。6 个突变分别是t 1 1 0 6 6 - - - c ( a t c - - - a c c ， l l e 4 0 7 - - t h r ) ，a 1 0 7 8 9 _ g ( a c c - - - - ，g c c ，m 3 1 5 _ 趟a ) ，a l 0 9 9 8 - * g ，( a g c - g g c ， s e r 2 5 2 - - - g l y ) ，g 1 0 6 4 5 - - - c ( g c c - - c c c ，a l a 2 6 7 - - - + p r o ) ，t 1 0 8 4 7 _ c ( g t c - - * g c c ， 3 3 4 一a 1 a ) 和a 1 1 1 7 2 缺失。其中t 1 1 0 6 6 _ c ( i l e 4 0 7 _ 1 1 曲和a l0 5 9 8 - g ( s e t 2 5 2 - - - g l y ) 这两个突变均造成氨基酸侧链化学性质的剧烈变化，氢键数 目及类型也发生明显变化，这种剧烈变化进而会影响蛋白质的空间构象自 由能( c o n f o r m a t i o n a lf r e e d o m ) ，使蛋白c 酶原分子不能正确折叠，导致 蛋白c 分子结构异常，不能被内质网或高尔基体上的下游作用蛋白识别， 使得这些异常的蛋白c 分子从内质网或高尔基体上脱落下来，来不及与 i 东北师范大学硕士学位论文刘景河 分子伴侣结合完成分泌过程，因此长时间停留在细胞内，最终被降解掉。 另外，蛋白c 重链区结构类似球形，氨基酸侧链化学性质的剧烈变化也 可能会引起相应氨基酸残基位置的移动，导致蛋白c 分子局部结构发生 异常，进而影响整个蛋白c 分子的结构。 a 川7 2 缺失突变非常接近多聚腺苷酸化位点( p o l y a d e n y l y l a t i o n ) ： a t t a a ab o x ( n t l l l 5 3 1 1 1 5 8 ) 和a l l m ，这两个位点参与蛋白cm r n a 的多聚腺苷酸化和m r n a 拼接。依据g e h r i n g 等的研究结果，同时由于 a 1 1 1 7 2 缺失非常接近多聚腺苷酸化位点，我们推测该突变可能会影响蛋白 cm r n a 前体的加工和蛋白c 的最终合成。 相对突变t l1 0 6 6 - - - + c ( 1 l e 4 0 7 一t l l r ) 和a i0 5 9 s - - - , g ( s e r 2 5 2 _ g 1 y ) 而言，突变 g 1 0 6 4 5 - - - c ( a l a 2 6 7 - - + p r o ) 、t 1 0 8 4 7 _ c ( v a l 3 3 4 _ a l a ) 和a 1 0 7 8 9 _ g ( 1 h 3 1 5 _ + a l a ) 对蛋白c 结构产生的影响可能较为微弱，这些突变在氨基酸性质、氢键 数目及类型和残基位置等方面的变化都不如前两个突变剧烈。 外显子8 、7 和3 表现很强的保守性，编码区未发现任何变异。外显 子8 和3 是蛋白c 重要的功能区，前者与外显子9 共同构成丝氨酸蛋白 酶活性中心，后者与外显子4 共同构成y 羧基谷氨酸结构域( g l a d o m a i n ) 。 综合以上分析结果和临床资料，我们认为这些突变中的t l l 0 6 6 一c ( i l e 4 0 7 一t 1 l r ) 、a 1 0 5 9 8 一g ( s e t 2 5 2 一g l y ) 会对蛋白c 分子的结构产生较为 明显的影响，使之不能正确折叠，因而不能和相关的下游蛋白作用，不能 正确合成并完成分泌过程，最终在细胞内被降解。a 7 2 缺失则可能使蛋 白cm r n a 前体的结构异常，引起3 端的剪切位点异常，导致m r n a 和 蛋白c 合成异常，但这一推测尚需进一步的实验加以验证。我们认为这 三个蛋白c 异常可能是造成该家系下肢静脉血栓高发率的主要因素之一。 该家系成员的蛋白c 基因外显子9 表现很强的易变性，这六个蛋白c 基 因突变均是首次报道。 关键词：蛋白c ，蛋白c 缺陷，深静脉血栓，基因突变 ” a b s t r a c t a b s t r a c t p r o t e i nc ，av i t a m i nk - d e p e n d e n tg l y c o p r o t e i na n daz y m o g e no fa s e r i n ep r o t e a s e ，p l a y sac r i t i c a lr o l ei nt h er e g u l a t i o no fb l o o d c o a g u l a t i o n a c t i v a t e dp r o t e i ncc a ns p e c i f i c a l l yd e g r a d ef a c t o r v ( v 旺) a n d ( 旺) g e n e t i ca b n o l t n a l i t yo rs o m e a c q u i r e d f a c t o r sm a yc a u s e p r o t e i n c d e f i c i e n c y ，w h i c hm a yb eac o n t r i b u t i n gc a u s eo fd e e pv e i nt h r o m b o p h i l i a o f t e ni nc o n j u n c t i o nw i t l lo t h e rg e n e t i co ra c q u i r e dr i s kf a c t o r s p r o t e i nci sac o m m o nc a u s eo fr e c u r r e n td e e pv j i nn l r o m b o s i s ( d v t ) w h i c hw a sf i r s tr e p o r t e db yg e r i 伍ne ta 1 u pt on o wm o r et h a n 3 0 0c l i n i c a lc a s e sa n d1 3 0u n i q u em u t a t i o n sa b o u th u m a np r o t e i nc d e f i c i e n c yw e r er e p o r t e d d u et o s om a n yu n i q u em u t a t i o n sa n dl i m i t e d m e a s u r e m e n to fd e t e c t i n gp r o t e i nc d e f i c i e n c y , t h em o l e c u l a rm e c h a n i s m o fd e e pv e i nt h r o m b o s i sc a u s e db yp r o t e i ncd e f i c i e n c yi sn o tc l e a r r e s e a r c hi nt h i sf i e l dm a i n l yw a sd o n ei na m e r i c aa n d e u r o p e f o r t u n a t e l y , w ef o u n daf a m i l yw i t hah i s t o r yo fd v t w h i c hh a p p e n e dw i t h o u te v i d e n t c a u s e a n dt h e nw et r i e dt of i n do u tw h e t h e rt h e r ea r es o m eg e n e t i c d i s o r d e r so f p r o t e i ncg e n ei nt h i sf a m i l y b yd n as e q u e n c i n g w ef o u n d f i v em i s s e n s em u t a t i o n sa n dad e l e t i o ni ne x o n 9f r o ms e v e n sf a m i l y m e m b e r sw i m i nt h r e e g e n e r a t i o n s s i x m u t a t i o n sa r e t 1 1 0 6 6 - - * c ( a t c _ a c c ，i l e 4 0 7 - - - * t h r ) ，a 1 0 7 8 9 - g ( a c c - - g c c ，t h r 3 1 s - - a l a ) ， a 1 0 5 9 8 - - - - g ( a g c - - - , g g c ，s e r 2 5 2 - - * g l y ) ，g t 0 6 4 5 _ c ( g c c _ c c c ， a 1 a 2 6 7 p r o ) ，t 1 0 8 4 7 c ( g t c - - - , g c c ，v a l 3 3 4 a 1 a ) i nc o d i n gr e g i o na n d a na 1 1 17 2d e l e t i o ni n3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ( u t r ) o f e x o n 9 m u t a t i o n st l l 0 6 6 - - c ( i l e 4 0 7 - - * t h r ) a n da 1 0 5 9 8 - - _ g ( s e r 2 5 2 - - * g l y ) c a u s e r a d i c a lc h a n g e si nc h e m i c a lp r o p e r t i e sr e g a r d i n gt ot h ea m i n oa c i ds i d e c h a i n w h i c ha l s ol e a d st od i f i e r e n tt y p ea n dn u m b e ro f h b o n d s ( h y d r o g e n b o n d s ) a n dc h a n g et h ec o n s e q u e n t i a lp r o t e i nc o n f o r m a t i o n a lf r e e d o ma n d m a k et h e p r o t e i n cm o l e c u l a r sf o l d i n c o r r e c t l y s u b s e q u e n t l y t h e s e a b e r r a n tm o l e c u l a r sc a n ti n t e r a c tw i t hs o m ed o w n s t r e a mp r o t e i n sa n df 甜l o f ff r o mg o l g i o s o m eo re n d o p l a s i m i cr e t i c u l u m ，w h i c hm a yc a u s et h e s e p r o t e i nc m o l e c u l a r su n a b l et oi n t e g r a t ew i t hc e r t a i nm o l e c u l a rc h a p e r o n s a n df i n a l l yd e g r a d ei nc e l l sb e f o r et h e i rs e c r e t i n gi n t op l a s m a a d d i t i o n a l l y , t h ef i g u r eo f h e a v yc h a i no f p r o t e i nci sl i k ea b a l l ，r e s i d u ei l e 4 0 7a n d8 e r 2 5 2 l i eo nt h es u r f a c eo fh u m a n p r o t e i nc s o 也er a d i c a lc h a n g e so f c h e m i c a l p r o p e r t i e so ft h e s et w oa m i n oa c i dr e s i d u e sm a ya l s oc h a n g et h el o c a l d o m a i ns t r u c t u r e a n dt h e nm a yi n f l u e n c et h ew h o l es t r u c t u r eo fh u m a n v 东北师范人学硕士学位论文刘景河 p r o t e i n c m u t a t i o na 1 i1 7 2d e l e t i o n1 i e si nu t r w h e r e a si ti ss oc l o s et ot h es i t e o fp o l y a d e n y l y l a t i o no rc l e a v a g eo fh u m a np r o t e i ncm r n a p r e c u r s o r a c c o r d i n g t oan o v e l g e n e t i c m e c h a n i s m c o m t r i b u t i n g t o h e r e d i t a r y t h r o m b o s i sr e p o r t e db yg e h r i n ge ta l ，w es p e c u l m e dt h a tm u t a t i o na 1 1 1 7 2 d e l e t i o nm a ya f f e c t st h em r n a p r e c u r s o rp r o c e s s i n ga n df m a lp r o t e i nc s y n t h e s i s b u ti ts t i l ln e e df u r t h e rp r o o f i nc o n t r a s tt ot h ea b o v et h r e e m u t a t i o n s ，m u t a t i o ng 1 0 6 4 5 - - - - c ( a l a 2 6 7 - - - + p r o ) ，t 1 0 8 4 7 _ c ( v a l 3 3 4 一a 1 a ) a n da 1 0 7 8 9 _ g ( t h r 3 1 5 叶a l a ) m a y h a v el e s sd r a m a t i ce f f e c to nt h es t r u c t u r eo f p r o t e i nc b e c a u s et h ec h a n g e o fc h e m i c a lp r o p e r t i e so fa m i n oa c i dr e s i d u e s ，t h ec h a n g eo ft y p ea n d n u m b e ro f h b o n da n dt h ee f f e c to f p o s i t i o n sc h a n g ea c c o r d i n ga m i n oa c i d r e s i d u e sa r el e s sd r a m a t i ct h a nt h ea b o v et h r e em u t a t i o n s i na d d i t i o n ，w ef o u n dn om u t a t i o ni nt h ec o d i n gr e 函o no fe x o n 8 ，7 a n d3 c o m b i n a t i o nw i t ha b o v er e s u l t sa n de l i h i e a lr e s o u r c e s ，w ec o n c l u d e d t h a tm u t a t i o nt 1 1 0 6 6 - - c ( i l e 4 0 t - - * t h r ) ，a 1 0 5 9 8 - - g ( s e r 2 5 2 - - * g 1 y ) m a yc a u s e p r o t e i nc m o l e c u l a r sc a n tf o l dc o r r e c t l ya n dd e g r a d ei nc e l l sb e f o r et h e i r s e c r e t i n gi n t op l a s m a m u t a t i o na l l l 7 2d e l e t i o nm a yc h a n g et h es t r u c t u r eo f m r n a p r e c u r s o r , 1 e a d i n gt ot h ea b e r r a t i o no f m r n a p r e c u r s o rp r o c e s s i n g a n dt h ef i n a lp r o t e i nc s y m h e s i s s ow et h o u g h tt h e s et h r e en m t a t i o n sm a y a c c o u n tf o rt h eh i g hr i s ko f d v ti nt h i sf a m i l y t h es e q u e n c eo fe x o n 9s h o w e dh i g hv a r i a b i l i t ye i t h e ri np a t i e n t sw i t h d v to ra s y m p t o m a t i cr e l a t i v e si nt h i se x p l o r e df a m i l y i t st h ef i r s tt i m e 廿l a tw e r e p o s e d t h e s es i xm u t a t i o n sa b o u th u m a n p r o t e i ncg e n e k e y w o r d s ：p r o t e i nc ，p r o l e i ncd e f i c i e n c y , d e e p v e i l lt h r o m b o s i s ， g e n em u t a t i o n ， 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师 范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：荔l 星约f i 期：边：虽 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文 学位论文作者签名 i = i期 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话：厦应蚴 邮编： 第1 章前言 第1 章前言 蛋白c ( p r o t e i n c ) 是一种维生素k 依赖性的抗凝血蛋白，在止血 系统中起重要作用。蛋白c 缺陷与静脉血栓形成有关，先天和后天的 蛋白c 缺陷均有报道。但目前临床上尚未形成完善的分析和鉴定蛋白 c 缺陷的方法，分析和鉴定蛋白c 缺陷通常只能在实验室中小规模进 行。 1 1 蛋白c 的研究概况 1 1 1 蛋白c 生理学特性 蛋白c 是一种维生素k 依赖性血浆酶原，分子量为6 2 0 0 0 d ，主要 在肝脏中产生，活化后形成丝氨酸蛋白酶，对控制血液凝固一抗凝平 衡起着重要的调节作用。另外蛋白c 能够抑制细胞因子( c y t o k i n e ) 的 活性，降低因内皮细胞程序性死亡引起的炎症和局部缺血 1 , 2 1 。新翻 译形成的蛋白c 经谷氨酸y 羧基化、p 羟基化、糖基化和切除前导肽 形成成熟的蛋白c 。人成熟蛋白c 包括一条重链( 2 5 0 个氨基酸， 4 1 ，0 0 0 d ) 和一条轻链( 1 5 5 个氨基酸，2 1 ，0 0 0 d ) ，通过一个二硫键连 接( f i g 1 - j ) 。它有5 个功能区：一个y 羧基谷氨酸结构域( g l a 结构 域，氨基酸1 4 5 ) ，两个表皮生长因子结构域( 氨基酸4 6 9 1 ，9 2 1 3 6 ) ， f i g 1 一，t h et h r e e - d i m e n s i o n a lh u m a np r o t e i ncs t r u c t u r e ( a ) ：w i r em o d e ，r e d ：a - h e l i x , y e l l o w ：p - s h e e t ，g r a y ：c o i l i n g ( b ) ：r i b b o nm o d e 东北师范大学硕士学位论文刘景河 一个连接区( 氨基酸1 3 7 18 4 ) 和一个含有催化活性中心的丝氨酸蛋 白酶结构域( 氨基酸1 8 5 4 1 9 ) 。 蛋白c 与蛋白c 受体( e n d o t h e l i a lc e l lp r o t e i ncr e c e p t o r , e p c r ) 、 凝血酶( t h r o m b i n ) 、凝血调节蛋白( t h r o m b o m o d u l i n ，t m ) 以及蛋白s ( p r o t e i ns ) 等其它辅助因子构成蛋白c 系统，调节血液的凝固抗凝 的平衡。在蛋白c 活化过程中，蛋白c 的g l a 结构域和凝血酶分别 与位于内皮细胞表面的e p c r 和t m 结合形成复合物，凝血酶和t m 复合物的表面可结合阴离子( a n i o n - b i n d i n ge x o s i t e ) 引起自身构象改 变，从蛋白c 重链a r g l 6 9 位置切掉一个十二肽， 形成活化的蛋白c ( a c t i v m e d p r o t e i n c ，a p c ) ，这是蛋白c 活化的一个重要生理步骤【3 】。 a p c 与蛋白s 等其它维生素k 依赖性蛋白因子共同作用形成的a p c 复合物，能专一地降解凝血因子v a 和n a ，调节抗凝和凝血系统的平 衡，抑制血栓的形成( f i g 1 - 2 ) 。如果没有蛋白s 作辅助因子，凝血 活化辅因子i x a 可保护a 不被a p c 降解，同样凝血活化辅因子x a 可保护v a 。p e l l e q u e r 等人发表了a p c 结合凝血活化辅因子v a 的3 d 分子模型【4 1 。 另外a p c 也可抑制纤溶酶原活化抑制物1 ( p a i - 1 ) 的活性，促进 纤溶蛋白的溶解作用。1 一抗蛋白酶抑制物和以巨球蛋白可失活 a p c 。t m 可能是蛋白c 的主要生理激活剂，因为凝血调节蛋白基因 f i g j - 2a c t i v a t i o na n df u n c t i o no f h u m a np r o t e i nc 2 第1 章前言 突变的小鼠表现出静脉血栓症状【5 1 。凝血酶和t m 复合物除了可激活 蛋白c ，还可激活凝血酶活化的纤维蛋白降解抑制物( t h r o m b i n a c t i v a t a b l ef i b r i n o l y s i si n h i b i t o r , t a f i ) ，导致纤维蛋白无法降解。 蛋白c 要达到最佳活性，必须具有结合凝血酶、蛋白c 受体、凝 血调节蛋白、c a 2 + 、磷脂尤其是磷脂乙醇胺的能力。蛋白cg l a 结构 域中t 一羧基谷氨酸( 尤其是g l a 7 、g l a 2 0 、g l a2 5 、g l a2 6 和g l a2 9 ) 例、金 属离子结合位点、b 羟基天冬氨酸以及n 端的疏水结构域与蛋白c 的活性密切相关【”。 1 1 2 蛋白c 缺陷 ( 1 ) 遗传性蛋白c 缺陷 人的蛋白c 基因位于2 号染色体q 1 3 - 1 4 ，长约1 l k b ，包括9 个外 显子和8 个内含子。蛋白c 基因的顺式调控元件包括肝细胞核因子i 结合位点、肝细胞核因子i i i 结合位点和一个肝脏专一性结合位点 ( 1 i v e r s p e c i f i cb i n d i n gs i t e ) ，一个s p l 结合位点，一个沉默子和2 个增 强子1 2 l 】。 1 9 8 1 年g r i f f i n 等首次报道了蛋白c 缺陷是引起血液高凝聚状态的 一个的原因。到目前为止，根据r e i s t m a 等的统计共有3 0 0 多例蛋白 i 日一j 蛋白c 缺陷类型及发生率( 引自r e i s t m a e t 口d 东北师范大学硕士学位论文刘景河 c 缺陷病例，涉及1 6 0 多种突变( 衰) ，如此多的突变类型使得基 因诊断蛋白c 缺陷变得棘手【8 j 。 蛋白c 缺陷可分为i 型和l i 型。i 型较为常见，约占全部病例的 7 6 ，i i 型约占1 1 4 。i 型患者通常是由于蛋白c 表达量减少，引 起蛋自c 总量和抗凝活性的降低约5 0 。大多数i 型蛋白c 缺陷都 是由碱基缺失或无义突变引起的；蛋白c 基因启动子的突变可破坏转 录调节因子与之结合。i i 型缺陷是由于产生了功能异常的蛋白c ，造 成抗凝血活性下降，但蛋白c 的表达量正常。所有1 i 型蛋白c 缺陷 的突变都是错义突变，如g l a 结构域或活性位点中氨基酸改变、前导 肽切除位点处的突变等。 除了前面两种较为简单的蛋白c 缺陷类型，还有复合蛋白c 缺陷 ( c o m p o u n d p r o t e i n cd e f i c i e n c y l ，复合蛋白c 缺陷个体同时携带两种 或两种以上蛋白c 基因突变。其有三种类型：i 型、型和i i i 型， 发生率分别为3 2 、o 6 和1 6 。b o v i l 等在研究复合蛋白c 缺陷 家系时发现携带g l u 2 0 a l a 和v a l l 3 4 一m e t 两种突变的成员都患过动 脉或静脉血栓p j 。 蛋白c 缺陷的是一种常染色体显性遗传病，但不同个体外显率不 同，其发生率为o 2 0 5 【1 0 】。有证据显示约3 0 蛋白c 缺陷杂合体 曾经患过静脉血栓【1 1 j 。近1 0 0 0 0 名健康苏格兰献血者中有o 2 是蛋 白c 缺陷杂合体【1 2 l ；5 0 0 0 名美国献血者中有o 4 是蛋白c 缺陷杂合 体1 1 1 。尽管在健康人中也能检测到蛋白c 缺陷，但没有其它与血栓形 成有关的先天或后天因素的存在，这些人并没有出现血栓症状。 对很多家系的研究今人信服地证明蛋白c 缺陷是形成静脉血栓的 一个危险因素。例如，与未受累亲友相比，蛋白c 缺陷杂合体患静脉 血栓的机率分别增加了7 8 或8 8 倍；而5 0 的蛋白c 缺陷杂合体在 4 5 岁前曾患过静脉血栓( p h u m a n p r o t e i n cn e u c l e o t i d e ( 序列名称) c 1 、a a g c c t a t g c c c n f a t g a c c a g g g a a c c c a g g a a a g t g c a t a t g a a a c g c c c a t a t g a c c a g g g a a c c c a g g g g a a c ( 要提交的序 列1 最后将文件保存为纯文本格式( t x t ) b 1 。 双击c l u s a t lw e x e 文件，进入c l u s a f lw 界面( d o s 环境) 。 显示对话框，1 表示从磁盘输入序列文件，2 表示输入多序列比对 文件，3 表示输入序列比对结果的文件，4 表示对序列进行系统树分析。 选择1 后，出现对话框，按提示输入待分析文件地址，如：e f l h u m a n p r o t e i ncn u c l e o t i d e t x t 。 接着对话框将会显示文件中所含的序列个数和残基数目。如果选 择2 则进行多序列比对；选择4 进行系统树分析。如多序列比对则选 择2 后回车。 显示对话框，l 表示进行完全的序列比对分析，2 表示进行进化树 分析，4 ，5 ，6 ，7 ，8 ，9 则是相关参数的设置，建议初学者按其默认 设置进行操作。若进行序列比对可选择l ，此时会询问你将输出结果 保存途径及文件保存的类型，【 内的文件是其默认途径及文件保存的 类型，也可人工输入，如e ：p r o t e i nc n u c l e o t i d e a l n ，则输出结果保存 到e 盘根目录下p r o t e i n cn u c l e o t i d e a l n 文件，文件类型为也a l n 。或者 也可输入e ：p r o t e i ncn u c l e o t i d e t x t ，这样输出结果就会以文本方式保 存，可直接在w i n d o w s 下打开和编辑。继而询问系统树文件保存途径， 回车则保存到默认文件，也可人工输入途径。后车后则序列比对的结 果就会显示出来。 退出软件，到e ：p r o t e i ncn u c l e o t i d e t x t ，打开该文件，就可见到 序列比对的结果。 ( 2 ) s e q u i n 的使用 s e q u i n 是向n c b i 提交序列一种常用软件，可适合于提交较大的序 1 7 东北师范大学硬士学位论文刘景河 列信息。一般来说较小的序列可用b a n k l n 软件以网页的形式直接提交 到n c b i 。提交者也可在本地电脑中用s e q u i n 编辑要提交的序列，最 终会生成一个序列提交文件，将此文件经e m a i l ： g b s u b n c b i n l m n i h g o n 寄到n c b i ，经工作人员核对后即可输入数据 库。到此即完成序列提交任务。具体操作如下。 进入h t t p ：w w w n c b i a l t o n i h g o v f t p i n d e x h t m l 点击s e q u i n 下载文 件，保存至本地磁盘。 双击图标和。启动s e q u i n ，点击按纽“s t a r t n e w s u b m i s s i o n ”。 点击“s u b m i s s i o n ”栏，在空白处填写所提交序列的题目；接着点击 “c o n t a c t ”填写相关的联系方式；再点击“a u t h o r ”，依次填写作者姓 名。点击“n e x t p a g e ”。 出现”s e q u e n c ef r a g m e n t ”对话框，提交者需要根据自己的所提交的 序列，选择不同的类型，不同类型所支持的序列格式也不同，如“s i n g l e s e q u e n c e ”只支持f a s t a 格式。一般提交的序列可采用f a s t a 格式， 见c l c u s t a lw 使用说明部分。选择适当的类型和格式后，点击“n e x t p a g e ”。 出现“o r g a n i s ma n ds e q u e n c e ”对话框，在“s c i e n t i f i cn a l t l e ”栏可 选择序列来源的物种名称，如果是人则可在下框中选择“h o m o s a p i e n s ”，如没有相应物种名称则需人工输入序列来源的物种的打丁学 名。继而点击 n u c l e o f i d e 和 p r o t e i n ”，按提示填写完相关信息后，点 击“i m p o r t n u c l e o t i d eo r p r o t e i n f a s t a ”，即可将d n a 和蛋白质序列信 息分别调入s e q u i n 中，并显示序列相关的信息如碱基个数等。点击 “n e x tp a g e ”a 填写基因名称及表达的蛋白质信息，点击“n e x tp a g e ”后即可出 现最终的结果，如对其中某些选项需要修改，可通过工具栏中各命令 进行。如果点击“d o n e ”，则软件会提示你保存结果并给出e m a i l 地址。 通过以附件方式将结果文件寄至n c b i ，收到信息后他们会通过 e - m a i l 与提交者保持联系直到最终数据公布，同时会将序列的i d 告知 向提交者。 ( 3 ) s w i s s p d bv i e w e r 的使用t 3 5 1 8 第2 章材料和方法 s w i s s p d b v i e w e r 是一个对蛋白进行显示和分析的软件。界面非常 友好，使用起来比r a s m o l 方便，它直观地提供了大量的菜单以满足 查看显示蛋白的结构。s w i s s p d b v i e w e r 可以同时导入和显示多个p d b 文件的分子。每个分子有自己的“层”。可以很简单地通过菜单选择是 否显示分子中的原子，显示那些原子、用什么颜色显示，显示主链骨 架还是所有的原子都显示。通过鼠标可以实时旋转移动以显示分子位 置。可以对活性部位及相关结构比较。使用直观图形和菜单可以简单 地查看氢键、原子间距离、转折角度氨基酸突变等信息。到目前为止， s w i s s p d b v i e w e r 软件只能打开p d b 格式的文件。 s w i s s p d b v i e w e r 可以直观的给研究者提供蛋白质各级结构的信息， 因此可从理论上为研究者提供重要的信息，如笔者在研究该家系的过 程中，可在图中找到有义突变引起氨基酸改变的残基，可直接观察到 该氨基酸残基是否位于一螺旋或b - 折叠中，并可观察氨基酸残基突变 前后氢键数目与类型的改变。但是需要指出的是，s w i s s p d b v i e w e r 给 出的结果是理论上的，最终还需要在实践中加以验证。笔者利用 s w i s s p d b v i e w e r 软件模拟了氨基酸突变对蛋白质产生的可能影响。 进入w w w b i o s o f t c o r n 后，点击“三维分子视图”后，点击 s w i s s p d b v i e w e r 可下载至本地磁盘。双击下载的文件( 扩展名是e x e ) ， 丌始安装s w i s s p d b v i e w e r 。 安装后，打开“程序“，启动s w i s s p d b v i e w e r ，由“f i l e ”一“o p e n p d b f i l e ”打开相应的p d b 文件，可显示图像，同时出现一个文本对话框。 可用工具栏中的常见命令实现对图像的基本操作，如图，国固回国 点击l 则图像还原至中点；点击2 后可对图像进行拖拉移位；点击3 后可对图像进行缩放；点击3 后可对图像进行任意旋转。 由“w i n d o w s ”一”c o n t r o lp a n e l ”可打开控制台，控制台是控制蛋白质 图像的核心，如点击“g r o u p ”栏中的某个氨基酸残基，再点击“c o l ” 栏中的相应方框，即弹出颜色对话框，可将该残基改为其它颜色，从 而易于找到；如果用鼠标左键点击各栏中的“v ”，则相应的残基或参 数不会显示，但若右键，则相应栏中的所有残基或参数均消失。右键 l a b e l 栏则显示所有的氨基酸残基标记和位置；右键点击鱼：则显示 r 1 9 东北师范人学硕上学位论文刘景河 电子分布；右键点击r i b n 栏则以带状模式显示( r i b b o n ) 蛋白，此时若 打开“d i s p l a y ”- u s eo p e n g lr e n d e r i n g 选项，则图像呈现出非常漂 亮的3 d 图形。 打开“c o l o r _ ”b ys e c o n ds t r u t u r e ”后，会发现图像，由灰、黄和红三 种不同的颜色组成，其中灰色代表相应区域为自由回转；黄色则代表 b 折叠；红色代表旺- 螺旋( f i g 1 - ) 。 执行“t o o l ”一“c o m p u t eh b o n d s , 会发现图像中出现绿色的虚线， 此即代表氢键。有时也可看到灰色的虚线，它表示该氢键形成的可能 性较小，因为参与氢键形成的两个残基距离较远。 将图像适当放大后，找到发生突变的氨基酸残基( 该残基的位置一 定要清析可见并便于选择，最好开启l a b e l 选项) ，并在控制台中找到， 点击后呈现红色，然后点击工具栏中的m u a t a t i o n 图标，如图；圈 继 而点击发生突变的氨基酸残基，会自动弹出一个菜单，上面有2 0 种氨 基酸，选择相应的氨基酸残基，点击后，原来的氨基酸残基将会被取 代掉，至此氨基酸残基即发生了突变；重新执行“t o o l ”一”c o m p u t e h b o n d s ，可发现突变的后氨基酸残基形成的氢键的数目发生了变化。 同样研究者还可观察到突变前后蛋白质电子分布及分子表面等特征的 变化。 研究者用s w i s s p d b v i e w e r 可同时模拟多个氨基酸突变，在突变下 一个位点时，s w i s s p d b v i e w e r 会询问是否保存上一个突变，若此时点 击取消，则上一个突变位点氢键不能正常显示，可能该软件的不太完 美之处，使用时应注意一点，此时最好重新打开原文件。 保存文件，退出。 第3 章结果 第3 章结果 3 1 目的片段的扩增 3 1 1 外显子9 用引物s 9 一l a 9 1 和s 9 2 a 9 2 可分别扩增出蛋白c 基因外显子9 编码区和5 端区域，大小分别为6 5 0 b p 和7 4 5 b p ，包括该家系的成员 i1 、i i1 、1 1 2 、i i3 、1 1 6 和i i l 2 ，以及两个非家系成员的个体c o n l 和c o n 2 ( f i g 3 - ) 。 f i g 3 - 1p e ra m p l i f i c a t i o no fe x o n 9 t h et e m p l a t eo f l a n e l ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7a n d8r e s p e c t i v e l yc o m ef r o mt h ei n d i v i d u a li 1 ，1 1 1 ，1 1 2 ( 1 1 2 - 2 ) ，i i3 ( i i3 一1 ) ，1 1 6 ( 1 1 6 - i ) ，1 1 6 ( 1 1 6 - 2 ) ，1 2a n d1 1 2 ( 1 1 2 - 1 ) i n t h i sf a m i l y 。t h et e m p l a t eo f9a n d1 0c o m ef r o mc o n la n dc o n 2