（食品科学专业论文）鸡蛋蛋清溶菌酶分离纯化及其抗原性评估.pdf

摘要 摘要 鸡蛋溶菌酶是一种天然存在的具有杀菌抑菌作用的碱性蛋白酶，在食品行 业中得到了广泛的应用，然而作为鸡蛋中的一种主要过敏原，约有3 5 的鸡蛋过 敏患者对溶菌酶过敏。另外，食物过敏是一种复杂的网络免疫失调症，多种抗 原抗体之间相互作用，探明各种过敏原在食物过敏反应中的相互关系，对于低 过敏或无过敏食品的开发具有重要的指导意义。因此，本论文分离纯化高纯度 鸡蛋溶菌酶，并对其抗原性进行初步评估，这不仅为溶菌酶的工业化生产提供 一定的技术支持，还能够为低过敏性或无过敏性蛋制品的开发提供一些基本的 实验参数。 本研究的主要内容包括鸡蛋溶菌酶的分离纯化、溶菌酶酶活性质研究、兔 抗溶菌酶多克隆抗体的制备以及溶茵酶抗原性评估。 在鸡蛋溶菌酶分离纯化过程中，建立了c m s e p h a r o s ef a s tf lo w 离子交换 层析分离溶菌酶的方法。分离得到的样品经5 一1 5 s d s p a g e 电泳进行鉴定，结 果表明，溶菌酶纯度在9 0 以上，回收率在3 1 1 左右。 在溶菌酶酶活性质研究过程中，以枯草芽孢杆菌及其细胞壁作为研究对象， 研究了鸡蛋溶菌酶的部分酶活性质。研究结果表明，鸡蛋溶菌酶对枯草芽孢杆 菌的生长具有明显的抑制作用，在5 0 环境中，溶菌酶对枯草芽孢杆菌细胞壁 具有明显的降解作用，但是在2 5 时的作用并不明显，这说明温度对溶菌酶酶 活有很大影响。 在兔抗溶菌酶多克隆抗体制备过程中，通过弗氏佐剂来加强免疫，采用皮 下多点免疫的方法免疫日本大白兔，分离血清，然后用间接e l i s a 检测了兔抗 溶菌酶血清效价的变化。在测定效价之前，先通过方正滴定建立了间接e l i s a 法的工作条件：抗原最佳包被浓度o 5ug m 1 ，二抗稀释倍数1 ：1 0 0 0 0 。免疫 结果显示，不同个体对溶菌酶的敏感不同，兔b 2 、c 1 对溶菌酶较为敏感，效价 达到了1 ：1 5 0 0 0 0 ，相反，兔b 1 、c 2 的反应较为迟钝。 在溶菌酶抗原性评估试验中，采用间接e l i s a 、间接竞争e l i s a 、w e s t e r n b l o t t i n g 等方法检测了兔抗溶菌酶血清与溶茵酶、卵运铁蛋白、卵白蛋白、卵 类粘蛋白和a 一乳白蛋白之间的免疫反应。试验结果说明，兔抗溶菌酶血清与卵 摘要 运铁蛋白、卵类粘蛋白之间有非特异性免疫反应，与a 一乳白蛋白无任何反应， 只与溶菌酶发生特异性反应，具有高度专一选择性。 关键词：溶菌酶；分离纯化；抗原性；鸡蛋过敏；过敏原 a b s t r a c t a b s t r a c t h e ne g gl y s o z y m ei san a t u r a la l k a l i n ep r o t e a s e ，w h i c hh a sa na b i l i t yt oi n h i b i t t h eg r o w t ho fb a c t e r i a , a n di sw i d e l yu s e di nf o o dp r o d u c t s h o w e v e r , a so n eo ft h e m a j o ra l l e r g e n si ne g g ，a b o u t3 5 p a t i e n t sa r es e n s i t i z e dt oi t f o o dh y p e r s e n s i t i v i t y i sac o m p l e xi m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e ，i nw h i c hm a n yk i n d so fa n t i g e n sa n d a n t i b o d i e sr e a c tw i t he a c ho t h e r , s ot om a k et h er e l a t i o no ft h e mc l e a r l yc a no f f e r s o m ei m p o r t a n tg u i d a n c e sf o ri n v e s t i g a t i o no nh y p o a l l e r g e n i co rn o n - a l l e r g e n i cf o o d s t h e r e f o r e ，t h i sp r o j e c ta i m st op u r i f yt h eh e ne g gw h i t el y s o z y m ew i t hh i g ha c t i v i t y , a n dt oe v a l u a t ei t sa n t i g e n i c i t y , w h i c hc a nn o to n l yd e v e l o ps o m ea p p r o a c ht o s e p a r a t el y s o z y m ei ni n d u s t r y , b u ta l s om a yg i v es o m eu s e f u l lp a r a m e t e r sf o rf u t u r e w o r ko nd e v e l o p i n gh y p o - a l l e r g e n i co rn o n - a l l e r g e n i ce g g p r o d u c t i o n s t h ei n v e s t i g a t i o ni sc o m p o s e do ft h ep u r i f i c a t i o no fh e ne g gl y s o z y m e ，t h e c h a r a c t e r i z a t i o no fl y s o z y m e ，t h ep r e p a r a t i o no fr a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s t l y s o z y m e ，a n dt h ee v a l u a t i o no fl y s o z y m e sa n t i g e n i c i t y h e ne g gl y s o z y m ew a sp u r i f i e db yc m s e p h a r o s ef a s tf l o wc a t i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , a n dw a sd e t e c t e db y5 - 15 s o d i u md o & c y ls u l f a c ep a g e i tw a s s h o w nt h a tt h el y s o z y m ep u r i t yw a so v e r9 0p e r c e n t ，a n dt h er e c o v e r yr a t ew a sa b o u t 3 1 1 p a r t i a lc h a r a c t e r i z a t i o no ft h el y s o z y m ew a si n v e s t i g a t e du s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s a n di t sc e l lw a l la sr e s e a r c ho b j e c t t h er e s u l ti m p l i e dt h a th e ne g gl y s o z y m ec o u l d i n h i b i tt h e g r o w t ho fb a c i l l u s s u b t i l i ss i g n i f i c a n t l y m o r e o v e r , l y s o z y m ec o u l d d e g r a d a t ei t sc e l lw a l lc o n s p i c u o u s l ya t5 0 c ，w h i l e n o ta t2 5 ( 2 i nc o n c l u s i o n ， t e m p e r a t u r eh a dag r e a te f f e c to i lt h ea c t i v i t yo fl y s o z y m e t h ep r e p a r a t i o no fr a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tl y s o z y m ew a sp e r f o r m e d b yt h em e t h o do fm u l t i p l es u b c u t a n e o u ss i t e si n g e c t i o ni n j e c t i o n , u s i n gf r e u n d s a d j u v a n tt oe n h a n c et h ei m m u n er e s p o n s e ，t h e ni n d i r e c te l i s aw a su s e dt od e t e c tt h e v a r i e t yo ft i t r eo ft h es p e c i f i cr a b b i ts e r u m b e f o r et h ed e t e c t i o no ft i t r e ，w eo p t i m i z e d t h eo p e r a t i n gc o n d i t i o no ft h ei n d i r e c te l i s ab yc h e s s b o a r dt i t r a t i o nf i r s t l y ：t h e o p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fc o a t i n ga n t i g e nw a s0 5 肛g m l ，a n dt h eo p t i m a ld i l u t i o no f i v a b s t r a c t h r p - i g gw a s1 ：10 0 0 0 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es e n s i t i v i t ya g a i n s tl y s o z y m ef o r e a c ha n i m a lw a sd i f f e r e n t ，t h er a b b i tb 2a n dc1w e r em o s ts e n s i t i v ew i t ht h e i rt i t r e s g r o w i n gu p t o1 ：15 0 0 0 0 ，o nt h ec o n t r a r y , r a b b i tb 1a n dc 2w e r ev e r ys l o w f o rt h ee v a l u a t i o no fl y s o z y m e s a n t i g e n i c i t y , i n d i r e c te l i s a ，i n d i r e c t c o m p e t i t i v ee l i s aa n dw e s t e r nb l o t t i n gw e r eu s e dt od e v e l o pt h ei m m u n o r e a c t i o n b e t w e e nt h es p e c i f i cr a b b i ts e r u ma n ds e v e r a la n t i g e n si n c l u d i n gh e ne g gl y s o z y m e ， o v o t r a n s f e r r i n , o v a l b u m i n , o v o m u c o i da n dg t - l a c t a l b u m i n a st h e e x p e r i m e n t e x p l a i n e d ，t h e r ew e r en o n s p e c i f i ci m m u n o r e a c t i o na m o n gt h e r a b b i ts e r u mw i t h o v o t r a n s f e r r i na n do v o m u c o i d ，b u t1 1 0r e a c t i o nw i t ha - l a c t a l b u m i n , i to n l ya r i s e d s p e c i f i cr e a c t i o nw i t hl y s o z y m e ，w h i c hh a dh i 曲s p e c i f i cs e l e c t i o n k e yw o r d s ：l y s o z y m e ；p u r i f i c a t i o n ；a n t i g e n i c i t y ；h e ne g gh y p e r s e n s i t i v i t y ；a l l e r g e n v 目录 目录 第l 章引言1 1 1 溶菌酶性质1 1 1 1 溶菌酶的物理性质1 1 1 2 溶菌酶的抑茵作用1 1 1 3 溶菌酶的抑菌机制2 1 1 4 溶菌酶的抗病毒作用2 1 1 5 溶菌酶的免疫学功能2 1 2 溶茵酶在食品工业中的应用3 1 2 1 溶菌酶在乳制品中的应用3 1 2 2 溶菌酶在肉制品中的应用4 1 2 3 溶茵酶在饮料中的应用4 1 2 4 溶菌酶在发酵食品中的应用4 1 2 5 溶菌酶在其他食品中的应用5 1 3 溶菌酶分离纯化的研究进展5 1 3 1 离子交换法5 1 3 2 凝胶层析法6 1 3 3 反胶束萃取法7 1 3 4 结晶法8 1 3 5 亲和层析法8 1 3 6 其他9 1 4 鸡蛋过敏及其免疫学机制9 1 4 1 鸡蛋过敏反应9 1 4 2 鸡蛋过敏的免疫学机制1 1 1 5 溶菌酶过敏及其研究现状1 2 1 6 研究内容和意义1 4 第2 章鸡蛋溶菌酶的分离纯化1 5 目录 2 1 引言1 5 2 2 材料与设备1 5 2 2 1 试剂与材料1 5 2 2 2 设备1 5 2 2 3 溶液配制1 6 2 3 试验方法1 7 2 3 1 蛋清分离1 7 2 3 2 蛋清预处理1 7 2 3 3 柱材预处理1 7 2 3 4 装柱及平衡1 8 2 3 5 上样及洗脱1 8 2 3 6 溶菌酶成分及纯度的鉴定1 9 2 4 结果：2 2 2 4 1 鸡蛋溶菌酶柱层析分离洗脱曲线2 2 2 4 2 溶菌酶成分的鉴定2 2 2 4 3 溶菌酶纯度及回收率的测定2 3 2 5 讨论2 5 2 6 本章小结2 6 第3 章溶菌酶酶活性质研究2 7 3 1 引言2 7 3 2 材料与设备2 7 3 2 1 试剂2 7 3 2 2 实验仪器2 7 3 2 3 试剂配方2 8 3 3 试验方法：2 8 3 3 1 溶茵酶的抑菌作用2 8 3 3 2 溶菌酶对细菌细胞壁的溶解作用2 9 3 4 结果2 9 3 4 1 溶菌酶抑菌效果2 9 i i 目录 3 4 2 溶茵酶溶解曲线的测定3 0 3 4 3 温度对溶菌酶酶活的影响3 1 3 5 讨论3 2 3 5 1 鸡蛋溶菌酶的抑茵效果3 2 3 5 2 温度对溶菌酶酶活的影响3 2 3 6 本章小结3 3 第4 章抗鸡蛋溶菌酶多克隆抗体的制备3 4 4 1 引言3 4 4 2 材料与设备3 4 4 2 1 试剂3 4 4 2 2 仪器与耗材3 5 4 2 3 溶液配制3 5 4 3 方法3 5 4 3 1 实验动物3 5 4 3 2 抗原的配制3 6 4 3 3 动物免疫3 6 4 3 4 血清的分离3 6 4 3 5 间接e l i s a 测抗体效价方法的建立3 6 4 3 6 间接e l i s a 测抗体效价变化3 7 4 4 试验结果3 7 4 4 1 抗血清效价间接e l i s a 检测方法的建立3 7 4 4 2 免疫过程中抗体效价的变化3 8 4 5 讨论3 9 4 5 1 多克隆抗体的制备3 9 4 5 2 抗体效价的检测方法4 0 4 6 本章小结4 l 第5 章鸡蛋溶菌酶抗原性评估4 2 5 1 引言4 2 5 2 材料与设备4 2 i i i 目录 5 2 1 试剂4 2 5 2 2 仪器与耗材4 3 5 2 3 溶液配制4 3 5 3 实验方法4 4 5 3 1 间接e l i s a 法检测抗溶菌酶抗体特异性4 4 5 3 2 间接竞争e l i s a 曲线的制作4 4 5 3 3 免疫印迹4 5 5 4 结果4 6 5 4 1 间接e l i s a 4 6 5 4 2 间接竞争e l i s a 评估抗原特异性4 6 5 4 3 蛋白免疫印迹结果4 7 5 5 讨论4 8 5 5 1 关于间接e l i s a 4 8 5 5 2 关于竞争抑制e l i s a 4 9 5 5 3w e s t e r nb l o t t i n g 4 9 5 5 4 抗体特异性5 0 5 6 本章小结5 0 第6 章结论5 l 致谢5 2 参考文献5 3 i v 引言 1 1 溶菌酶性质 第1 章引言 1 9 0 7 年，n i c o l l e 最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后， l a s c h t s c h e n k o 指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶( l y s o z y m e ， e c 3 2 1 1 7 ) 。紧接着f l e m i n g 和m e y e r 等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对 溶菌酶的特性有了更深入的认识。 1 1 1 溶菌酶的物理性质 溶菌酶又称为胞壁质酶，其化学名为n 一乙酰胞壁质聚糖水解酶，由一条多 肽链组成，分子内有4 个二硫键交联，结构非常稳赳1 1 ，并且耐酸碱，在p h l 2 一 1 1 2 范围内剧烈变化仍能保持良好的稳定性，对热也极为稳定，在p h 3 0 条件下， 沸水浴中加热6 0 m i n 仍保持9 0 以上【2 j 。 不同来源的溶菌酶分子大小不一样，其氨基酸排列顺序也有所不同，因此， 它们的理化性质有很大差别：t 4 噬菌体溶菌酶由1 6 4 个氨基酸组成，分子量为 1 9 k d a 3 1 ；鸡蛋溶菌酶只有1 2 9 个氨基酸，其分子量约为1 4 3 k d a 4 ；人溶茵酶由1 3 0 个氨基酸残基组成，分子量为1 4 6 k d a 5 ；植物中分离出溶菌酶，其分子量较大， 约为2 4 k d a - - - 2 9 k d a 。各种溶菌酶的等电点在1 0 7 1 1 5 之间。其中，人们研究 最深入的是鸡蛋蛋清溶菌酶。 1 1 2 溶菌酶的抑菌作用 溶菌酶具有广泛的抑菌谱。鸡蛋蛋清溶菌酶能分解溶壁微球菌、巨大芽孢 杆菌、黄色八叠球菌等许多革兰氏阳性菌。不同来源的溶菌酶的抑菌谱不同。 杨向科等通过实验研究表明，海洋微生物溶菌酶对多种鸡蛋蛋清溶菌酶不能直 接作用的微生物如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形链球菌等都有溶菌作用： 并且海洋微生物溶菌酶对一些革兰氏阴性菌也具有明显的抑制作用【6 】。 w h h o l z a p f e l 等推测革兰氏阴性菌可能拥有一层外膜能保护细胞免遭蛋清溶 菌酶作用，这层膜可以被螯合剂e d t a 破坏从而使细菌对溶菌酶敏感【7 】；m o r r is o n 引言 等认为革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖对蛋清溶菌酶有很强的亲和性， 从而阻止溶菌酶的渗透，使蛋清溶菌酶不能分解革兰氏阴性菌【8 】。不同来源的溶 菌酶的酶学性质也有很大差别，人溶菌活性比鸡蛋溶菌酶高3 倍，而植物溶菌活 性比鸡蛋溶菌酶低【3 j 。微生物产生的溶菌酶通常是几种相关酶的混合物，由于彼 此间的协同作用使其对细菌细胞壁的溶解能力增强【9 】。在溶菌酶上连接疏水基团 能明显扩大其抑菌谱，增强对革兰氏阴性菌的抑制作用，并随配基疏水能力的 增强而增强，但对革兰氏阳性菌的抑制作用减弱【l o 】。 1 1 3 溶菌酶的抑菌机制 溶菌酶是一种专门作用于细菌细胞壁肽聚糖的细胞壁水解酶，按照作用方 式不同可以大致分为作用于糖苷键与作用于肽和酰胺两大类，其中糖苷键型是 主要的溶菌酶。它通过肽键上的第3 5 位的谷氨酸和第5 2 位的天门冬氨酸构成的 活性部位，水解切断n 一乙酰胞壁酸与n - 乙酰葡萄糖胺间以及甲壳质中n 一乙酰葡 糖胺残基间的b - i ，4 糖苷键，破坏微生物细胞壁肽聚糖支架。溶菌酶不管以何种 方式作用于细菌，都会使细菌细胞壁出现部分缺失，形成l 型细菌而失去对细胞 的保护作用，在内部渗透压的作用下，细胞膜破裂，内容物外溢而使细菌溶解【l 。 1 1 4 溶菌酶的抗病毒作用 有报道称，溶菌酶还具有抗病毒的作用。口服或局部应用溶菌酶对一些病 毒性皮肤病具有明显的疗效，如疱疹、寻常疣、跖疣、口疮性口炎、渗出性红 斑以及触染性软疣掣1 2 】；配合一些特殊的免疫疗法，溶菌酶还能够治疗病毒性 鼻窦炎和支气管到1 3 】；另外，溶菌酶还能够沉淀病毒颗粒，增强机体对病原体 的免疫应答能力【1 4 】，这其中的原因可能是，溶菌酶是一种碱性蛋白质，在中性 或偏酸性环境中带大量的正电荷，能够与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与 d n a 、r n a 、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活【1 5 1 。 1 1 5 溶菌酶的免疫学功能 溶菌酶不仅具有抗菌、抗病毒的作用，而且还有止血、消肿、防腐、抗肿 瘤及加快组织修复、增强免疫力等功能。溶茵酶作为机体非特异免疫因子之一， 2 引言 参与机体多种免疫反应。溶菌酶具有激活血小板的功能，可以改善组织局部血 液循环障碍，增强局部防卫功能，从而体现出止血、消肿等作用。溶茵酶水解 细胞壁时所释放的肽聚糖碎片是合成与分泌各种抗茵蛋白包括溶菌酶的诱导 物，溶菌酶可清除其它抗茵因子作用后所残余的细菌细胞壁并增强其它免疫因 子的抗菌敏感性，协同抵制外来病原的入侵【1 0 3 。溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗 菌蛋白，对杀死肠道腐败球菌有特殊作用。它可以杀死肠道内的腐败球菌，直 接或间接促进婴儿肠道细菌双歧杆菌增殖，使人工喂养婴儿肠道细菌群的正常 化；促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成徽细凝乳，有利于消化吸收；能够加强血清 免疫球蛋白和体内防御因子对感染的抵抗力，特别是对早产婴儿有预防消化器 官疾病的功效。刘树青等给中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 腹腔注射海藻多糖和北 虫草多糖后，对虾血清中溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活力显著提高，中国 对虾对外源致病菌的抵御能力显著增强，这说明溶菌酶具有增强机体免疫力的 作用【1 7 】。小儿急性鼻窦炎是一种与病毒、细菌感染、免疫功能异常及遗传因素 等有密切关系的疾病。柴向华等通过向小儿急性鼻窦炎患者处方药中添加溶茵 酶来研究溶菌酶的功效时发现，服用溶菌酶的患儿的治愈时间明显短于未服溶 菌酶的患儿，证明溶菌酶能明显增强机体免疫力【l 引。 1 2 溶菌酶在食品工业中的应用 目前溶菌酶已作为一种防腐剂，广泛应用于各种乳制品、肉制品、饮料及发 酵食品中，欧洲已经用其代替亚硫酸盐作为防腐剂。 1 2 1溶菌酶在乳制品中的应用 在食品工业中，溶菌酶可以作为婴儿食品的添加剂，主要用于牛乳的“人乳 化 ( 尤其在欧洲) 。人乳中含有大量的溶菌酶，而牛乳中则甚少，将溶菌酶添 加至牛乳或其乳制品中，可改良牛乳品质，抑制肠道中腐败微生物的生存，同 时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖【1 9 】。在乳粉或鲜乳中添加溶菌酶后， 不但可以起到防腐保鲜和延长保存期的作用，而且还有利于婴儿肠道细菌正常 化，增强婴儿的免疫力。此外，溶菌酶对牛奶中革兰氏阳性菌、好气性孢子形成 菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌等作用非常强。由于溶菌酶具有一定的耐高温 3 引言 性能，飞适用于超高温瞬间杀菌奶，其方法为在包装前添加或在杀菌前添加。 每吨牛奶加入0 0 5 0 1 m g 溶菌酶，3 7 。c 保温3 h ，可使牛奶中双歧杆菌的含量与 人奶无显著差别，从而保证婴儿肠道内双歧杆菌的良好增殖。在半硬干酪中加入 0 0 0 1 的溶菌酶，可防止香味物质丁酸的损失，同时能阻止由于厌氧孢子增殖体 ( 如酪梭杆菌) 的作用所引起的胀气等【2 0 1 。 1 2 2 溶菌酶在肉制品中的应用 溶菌酶可作为冷鲜肉以及香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。在我们的日 常生活中，肉类食品是一类必不可少的食物，为人体提供各种必需氨基酸和矿 物质。然而肉类食品容易遭受各种微生物的侵害变质。溶菌酶的开发利用正好 可以很好地解决这一问题。顾仁勇等研究发现：o 0 5 n i s i n 和o 0 5 溶菌酶混 合液能有效延长猪肉的保鲜期，结合真空包装技术则保鲜效果更好1 2 1 1 。张德权 等选取n i s i n 、溶茵酶、乳酸钠、茶多酚、壳聚糖等5 种天然保鲜剂对冷却羊肉 进行保鲜处理，结果发现溶菌酶的保鲜效果优于乳酸钠、茶多酚、壳聚糖【2 2 1 。 林琳等采用四种防腐剂保鲜红肠，结果表明：当以o 2 的山梨酸钾、4 的乳酸 钠、0 0 4 的溶菌酶和0 0 5 n i s i n 复配时效果最好，且对红肠品质基本无影响 2 3 1 。 1 2 3 溶菌酶在饮料中的应用 溶菌酶在茶饮料生产上也有很好的应用前景。茶汤属于低酸性饮料，引起茶 饮料变质的微生物主要为细菌。为保证饮料安全及贮藏性，必须对茶饮料进行杀 菌处理。常规方法处理后对其品质和风味影响很大。但是，溶菌酶在低酸茶饮 料中仍然保持较高的抑菌活性，并且不会影响饮料口味，是一种理想的茶饮料 防腐剂。在p h 值为6 0 7 5 的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶，具有较好 的防腐作用。此外，溶菌酶还可作为料酒和葡萄酒的防腐剂和澄清剂。 1 2 4 溶菌酶在发酵食品中的应用 四川泡菜、豆瓣等是一类对热敏感的发酵食品，通常采用高盐或高酸抑菌 方法贮藏。高温杀菌以及高盐、高酸等对食品风味的破坏作用较大；溶菌酶具 4 引言 有杀菌功效且无需加热，属于冷杀菌。谷绒等在实验室尝试了采用溶菌酶抑菌 防腐特性对泡菜和豆瓣进行了杀菌防腐实验；结果表明，从感观上很大程度上 减少了发酵产品颜色褐变，保持了发酵原有的色泽；风味上大大降低了泡菜和 豆瓣的咸味，提高了产品风味；而成本上极大减少了食盐使用量，降低了产品 的生产成本【2 4 1 。 1 2 5 溶菌酶在其他食品中的应用 在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐 败，在其中加入溶菌酶可以抑制微生物的繁殖：在生面条、花生酱和色拉等食品 中加入溶菌酶，均可以起到良好的防腐保鲜作用。章银良利用溶菌酶对草莓进行 保鲜时发现草莓的保鲜期明显延长【2 5 1 。 1 3 溶菌酶分离纯化的研究进展 鉴于鸡蛋溶菌酶特殊的理化性质及其在食品中的广泛应用，它的分离纯化 研究也一直受到追捧，已经开发并建立起多种方法，总体说来主要概括有离子 交换法、凝胶层析法、反胶束萃取法、结晶法及亲和层析法等。 1 3 1 离子交换法 因鸡蛋溶菌酶含有大量的组氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺以及天冬氨 酸等碱性氨基酸，其等电点p i 为l o 7 ，是一典型的碱性蛋白质，有别于占鸡蛋 蛋白绝大部分的酸性蛋白质，同时由于离子交换法具有样品处理量大、分离出 的样品比较集中、样品回收率高、活性保持良好、分离周期相对较短等特点， 它已成为分离纯化蛋清溶菌酶的主要方法。依据柱材带电性质的不同，离子交 换层析又细分为阳离子交换法和阴离子交换法。由于鸡蛋溶菌酶为一种碱性蛋 白质，在酸性或近中性环境中带有大量的正电荷，能选择性吸附在阴离子交换 层析介质上，从而跟蛋清中其他蛋白分离开来，因此阳离子交换法在分离鸡蛋 溶菌酶上的应用更为广泛，大量的科研工作已经从分离介质的选择、不同因素 对鸡蛋溶菌酶分离效果的影响、工艺过程控制等不同方面对阳离子交换层析法 做了深入的阐述：史小利等采用7 2 4 型阳离子交换树脂研究了蛋清溶菌酶的提 5 引言 取工艺，其具体流程是先将待分离的蛋清加到预处理好的树脂中，搅拌吸附5 h ， 经p h 6 5 磷酸盐缓冲液除去杂蛋白后，加入等体积的1 0 硫酸铵溶液，搅拌洗 脱3 0 分钟，过滤出洗脱液，再采用硫酸铵沉淀法分离出溶菌酶1 2 6 j 。姜馗以d 1 5 2 阳离子交换树脂为介质，采用n a c l 梯度洗脱法分离蛋清溶菌酶，同时研究了平 衡时间、温度、p h 等因素对溶菌酶回收率的影响，确定出了最佳洗脱液浓度， 分离出的溶菌酶纯度为1 ( 3 0 0 o ( 2 7 】。x u e 等采用c m 阳离子葡聚糖凝胶树脂分离牡 蛎溶茵酶，依次使用p h 5 0 的含o 、o 1 、o 3 和0 6 mn a c l 的醋酸醋酸钠缓冲液 进行梯度洗脱，6 8 的溶菌酶被从溶菌酶的粗提液中回收出来，溶菌酶活性提高 了1 0 0 倍【2 8 】。t i m o t h y 等也采用c m 阳离子交换树脂( 1 5 x 8 c m ) 从棉铃虫血淋 巴中分离溶菌酶，首先用浓度为0 2 5 m 、p h 6 8 的醋酸铵溶液平衡，然后用1 2 m n a c l 的相同醋酸铵溶液进行梯度洗脱【2 9 1 。t h a m m a s i r i r a k 等使用c m t o y o p e a r l 6 5 0m 阳离子交换树脂分离海龟蛋清溶茵酶。首先用浓度为0 0 3 m 、p n7 0 的 磷酸盐缓冲液进行平衡，然后用含0 0 3 mn a c l 的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱， 并取得了较好的分离效果【3 0 】。另外，还有少数文献报道使用阴离子交换树脂分 离溶菌酶。吉林大学的李欣使用d e a e 纤维素阴离子交换层析法分离蛋清溶菌 酶，以p i l l 0 0 的t r i s 缓冲液作为洗脱液p 。 1 3 2 凝胶层析法 凝胶层析法是运用分子筛原理，根据分子量的大小来分离蛋白质。一般而 言，柱长越长，分离效果越好，但这容易造成柱压强过高等问题，因此对设备 要求比较高；另外这种方法的样品处理能力比较小，柱材装柱要求也很高，稍 有结构不均或裂痕都会影响到样品的分离效果。综上这些问题的存在，凝胶层 析法一般不单独使用，而往往作为一种二级纯化手段来制备少量高纯度蛋清溶 菌酶。海洋微生物溶茵酶发酵上清液经超滤、c m s e p h a r o s ef f 阳离子交换层析 和s e p h a r o s eg 1 0 0 凝胶过滤层析纯化得到电泳级溶菌酶，纯化倍数为3 4 7 ，活 力回收为2 4 1 t 3 2 】。蒙古马奶经过硫酸铵沉淀、d e a e s e p h a r o s ea 2 5 、s e p h a d e x g 1 0 0 、c m s e p h a r o s e 2 5 柱色谱等程序分离得到马奶溶茵酶【3 3 】。赵昕等通过硫 酸铵分级沉淀、c m s e p h a r o s ef f 离子交换层析及s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤层析， 从灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e sg r i s e u s ) r x 17 的发酵上清液中分离得到了电泳纯 级溶菌酶r 1 ，其回收率为6 8 9 t 3 4 1 。赵宁利用c ms e p h a r o s ef f 阳离子交换层 6 引言 析和s e p h a r o s eg 7 5 凝胶层析对鹌鹑蛋清溶菌酶进行分离纯化，最终获得的溶菌 酶比活达到1 4 8 2 1 5 u r a g ，纯度提高了2 9 倍，活力回收率为3 8 1 3 5 】。凝胶层析 法分离溶菌酶的大致过程可以概括为：第一步柱材的预处理，这一步主要是保 证柱材的充分溶胀，剔除溶胀液表层漂浮的结构破损的细小颗粒，以免影响柱 子的整体分离效果；第二步装柱与平衡，装柱过程是该方法的关键环节，它决 定了分离得到的蛋白样品的纯度及回收率，整个装柱过程要求不能干柱及断层； 最后一步是上样、洗脱和收集。凝胶层析法的优点在于样品活性保持良好，一 次装柱可重复使用，柱材不用再生。 1 3 3 反胶束萃取法 反胶束萃取技术是继双水相萃取技术之后的又一种适用于生物大分子( 如 蛋白质、核酸等) 分离纯化的新技术。反胶束是指表面活性剂溶于非极性有机溶 剂中，当其浓度超过临界胶束浓度时，在有机溶剂内形成的聚集体。在这个聚 集体的中心有一个小“水池 ，水池的大小一般为几纳米到几十纳米。一般而言， 该萃取技术包括两个过程：第一，蛋白质加速溶于反胶束的“水池”中，这称 为前萃取( 或前萃，f o r w a r de x t r a c t i o n ) ；第二，将含有蛋白质的反胶束溶液 与另一水相接触，通过改变条件使蛋白质从反胶束转移到水相中从而分离出蛋 白质，这称为后萃取( 或后萃，b a c k w a r de x t r a c t i o n ) 。蛋白质在反胶束体系中 的增溶作用与蛋白质表面电荷与内表面电荷的静电吸引作用、反胶束体系对蛋 白质的位阻效应等因素有关。反胶束萃取技术是在温和条件下进行，具有高选 择性、易放大、萃取相可循环利用以及分离浓缩同步进行等优点，特别适用于 蛋白质的分离。目前，应用于蛋白质分离的反胶束萃取技术主要采用由阴离子 表面活性剂或和非离子表面活性剂混合而成的反胶束。刘杨等研究了由阴离子 表面活性剂二一( 2 - 乙基己基) 琥珀酸酯磺酸钠( a o t ) 和非离子表面活性剂聚 氧乙烯基( 聚合度为4 ) 壬基酚醚( o p e 4 ) 组成的一种混合反胶团体系及其萃取 溶菌酶的平衡能力。研究结果表明，该反胶团体系具有较大的含水量，它是由 静电作用和胶束形态改变共同作用的结果1 3 6 。n i s h i k i 等研究了溶菌酶在2 一乙 基己基琥珀酸酯磺酸钠一辛烷反胶束团与k c l 溶液组成的体系中的平衡萃取行 为，在这种反胶束团中后萃取速率非常的缓慢，约是前萃的1 1 0 0 ，萃取过程相 当耗时，大大限制了这种反胶束的应用【3 7 】。而有关用由阳离子表面活性剂形成 7 引言 的反胶束来萃取蛋白质的报道在国内外都还比较少见，k y u n g h y u n 等利用阳离 子表面活性剂十六烷基二甲基铵溴化物形成的反胶束来分离溶菌酶，仅前萃取 就可以把9 6 的溶菌酶从混合溶液中分离出来，无需后萃取过程，大大缩短了萃 取时间【3 8 1 。 1 3 4 结晶法 结晶法是一种比较传统的分离方法。蛋白质为两性物质，它之所以能溶解 于溶液中是受其表面所带的电荷及周围水化膜的保护作用的影响，通过调节溶 液的p h 值或离子强度与种类，改变蛋白质表面的净电荷，破坏其周围的水化膜， 可以使蛋白质靠重力作用从溶液中沉淀下来。典型的结晶法包括食盐结晶法和 等电点沉淀法，前者是利用相反离子来中和蛋白质表面的电荷，而后者则是通 过酸碱平衡来消除其表面所带净电荷，如果将这两者结合起来用在蛋清溶菌酶 的分离纯化上会取得更好的分离效果，具体的操作步骤简要概述如下：将含酶 液超滤处理后，用1 0 m o y l n a o h 溶液调整p h 至1 0 7 左右，然后再向酶液中缓 慢加入一定量的n a c l 至浓度为5 ，4 静置1 2 周，可见晶体慢慢析出，离心 后可获得溶菌酶粗品，将粗品重新溶解后再反复结晶几次可得到纯度较高的样 品。 1 3 5 亲和层析法 亲和层析法是一种利用蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而 设计的色谱技术。首先将配体固定于一定的固性载体上，当含有目标蛋白的溶 液流过这种载体时，目标蛋白会与相应的配体形成一定的复合体从而使其与溶 液中的杂蛋白分离开来，之后再利用另外一种洗脱液将这种复合体解离开来， 这样就能够获得单一的目标组分。常用于蛋清溶菌酶分离纯化的配体有几丁质 及其衍生物。王炜军等采用包埋法制备了具有磁响应性能的几丁质凝胶亲和吸 附介质，所采用的磁性颗粒为f e 3 0 4 ，使得介质复合了特异亲和吸附和磁响应性 的功能。研究结果显示，酶活力回收率可达2 6 ，纯化酶对蛋白的比活性为 5 0 8 9 4 u m 9 3 9 1 。除此之外，王炜军等还首次采用脱氨再生几丁质凝胶亲和柱层析 法直接从鸡蛋蛋清及菜心的茎叶粗提液中纯化溶菌酶。几丁质凝胶的制备过程 大致概括为：先用一定量的乙酸酐将壳聚糖醋酸溶液凝胶化，然后高速组织捣 引言 碎机捣碎至一定大小的颗粒，再经脱氨处理，最后用尼龙布过滤出去碎屑删。 由于受专一性亲和力的影响，这种分离方法往往具有高度专一选择性，纯化出 的样品纯度高，活性保持良好，一直是一种优良简便的纯化方法。 1 3 6 其他 除了以上这些方法，近几年开始兴起一种叫分子印迹的分离方法，它的基 本原理是以溶菌酶作为模板利用功能性聚合物单体分子制备出结构上与模板互 补的具有空腔的分子烙印聚合物，这种聚合体能特异性容纳溶菌酶分子，再在 一定洗脱液的作用下将其洗脱下来。刘秋叶等以溶菌酶为模板分子，丙烯酰胺 和n ，n 亚甲基双丙烯酰胺为聚合基质，二氧化硅为固体制空剂，制备了复合 分子印迹聚丙烯酰胺凝胶，研究结果显示，这种聚合物对溶菌酶有较高的亲和 性、选择性和吸附容量【4 1 】。张茉等分别以牛血红蛋白、牛血清白蛋白和溶菌酶 为模板分子，采用表面涂布的方法制备了在尼龙微孔滤膜表面覆盖有聚丙烯酰 胺凝胶层的分子印迹复合膜，然后分别对其进行了这3 种蛋白的单一组分和双 组分混合溶液渗透试验，结果表明，各种蛋白底物在印迹膜上的渗透规律是特 异性的识别位点和尺寸效应共同作用的结果，特异性识别位点会选择性地识别 模板分子 4 2 1 。闫长领以溶菌酶为模板，通过氧化反应将间氨基笨硼酸聚合到聚 苯乙烯微球表面得到溶菌酶印迹的核壳微球，这种微球对模板蛋白有较好的选 择性识别能力和极高的稳定性，在6 0 m i n 内能够达到吸附平衡，具有较快的物 质传输性能【4