（野生动植物保护与利用专业论文）海南坡鹿hsf1+cdna的克隆与表达.pdf

i y t l l l l l l l i 煳必 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期勘d 年多月砂 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 t 论文作者签名：了双 日冀幽，6 年，月 翩躲a 咿弋h 导师签名：c 入1 p v r 日期p 年j 月衫日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 。认 海南坡鹿h s f ic d n a 的克隆与表达 摘要 对热休克转录因子1 h s f l ，的研究对于热休克反应分子机制的阐释具有重 要的理论意义。本研究通过r t - p c r 和r a c e 方法扩增海南坡鹿h s f l h d h s f l ， e d n a 全长，将扩增产物与p m d 2 0 一t 载体连接，重组质粒酶切鉴定后测序并进行 生物信息学分析；构建p e t 2 8 a h d h s f l 表达载体，经i p t g 诱导表达后，进行 s d s p a g e 、w e s t e r nb l o t 分析。结果显示，克隆的h d h s f l e d n a 全长2 0 3 6b p ，含 有1 个1 5 7 8 b p 的开放阅读框，编码5 2 5 个氨基酸，目的蛋白是一个等电点为4 9 3 的 亲水性蛋白。h d h s f le d n a 与赫里福德牛、小鼠和人h s f lc d n a 的同源性分别 为9 8 9 9 、8 1 7 8 、8 7 8 2 ；相应编码蛋白氨基酸同源性分别为9 8 8 6 、8 3 8 4 、 8 9 0 6 ，根据氨基酸序列构建不同动物h s f l 蛋白的进化树，与采用传统分类法 构建的进化树基本一致，说明实验成功克隆了h d h s f l 基因。经i p t g 诱导表达后， 得到一个带组氨酸标签的约6 2 k d 的融合蛋白，用抗h i s 单克隆抗体进行w e s t e r n b l o t ，得到一条约6 2 k d 的特异性抗体结合带，表明h d h s f l 原核表达载体成功构建 并表达。 关键词：海南坡鹿；h s f l ；克隆；表达 海南坡鹿h s f ic d n a 的克隆与表达 a b s t r a c t t h ei n v e s t i g a t i o no fh e a ts h o c kt r a n s c r i p t i o nf a c t o r1h a sb e n e f i tf o ri n t e r p r e t a t i o nt h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mo ft h eh e a ts h o c kr e s p o n s e ，w i t hs i g n i f i c a n tt h e o r e t i c a lv a l u e f u l ll e n g t ho f h s f lc d n ao fh a i n a ne l d sd e e r - h d h s f l - w a sa m p l i f i e db yr t - p c ra n dr a c e ，a n dc l o n e d i n t op m d 2 0 一tv e c t o r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sc o n f i r m e db ye n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n 、 s e q u e n c i n g t h ep c rp r o d u c tw a st h e ns u b c l o n e d i n t op e t 2 8 av e c t o ra n dt r a n s f o r m e di n t oe c o l i h o s tc e l l s p r o t e i ne x p r e s s i o nw a si n d u c e db yi p t ga n da n a l y z e db ys d s p a g ea n dw e s t e mb l o t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh d h s f lc d n aw a s2 0 3 6b pi nl e n g t ha n dc o n t a i n e da1 5 7 8b po r f e n c o d i n g5 2 5a m i n oa c i d sa n dt h ee n c o d e dp r o t e i nw a s ah y d r o p h i l i c i t yp r o t e i nw h i c hi pi s4 9 3 t h eh o m o l o g yo fh s f lg e n eo fh a i n a ne l d sd e e rc o m p a r e dt ot h a to fc a t t l e 、m o u s ea n dh u m a n a r e9 6 2 0 、8 8 3 9 、8 1 5 3 ，a n dt h eh o m o l o g yc o m p a r i s o no fh s f la m i n oa c i ds e q u e n c eo n h a i n a ne l d sd e e rw i t hc a t t l e 、h u m a na n dm o u s ew a s9 7 5 2 、8 9 2 5 、8 3 8 4 r e s p e c t i v e l y p h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do nt h eh s f lp r o t e i no fd i f f e r e n ta n i m a l sw a sm a t c h e d t ot h et r a d i t i o n a l t a x o n o m i cc l a s s i f i c a t i o no ft h ea n i m a l a6 2 k df u s i o np r o t e i nw i t hah i st a gw a si n d u c e db yi p t g a n dc o n f i r m e db yw e s t e r nb l o tu s i n ga n t i h i s 。t a gm o n o c l o n a la n t i b o d y , g e t t i n gas p e c i a l a n t i b o d yb i n d i n gb a n d t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro fh d h s f lw a s c o n s t r u c t e da n de x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y k e y w o r d s ：h a i n a ne l d sd e e r ；h s f1 ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n 海南坡鹿h s f l c d n a 的克隆与表达 英文缩写表 缩写名称英文全称 中文全称 目录 中文摘要，i a b s t r a c t i i 英文缩写表i i i 目录i v 第一章绪论1 1 1 文献综述1 1 1 1h s f 的结构1 1 1 2h s f l 的活化过程2 1 1 3 动物h s f 家族3 1 1 4 与h s f l 相互作用的蛋白5 1 2 本研究的目的与意义9 第二章h d h s f l c d n a 的克隆l l 2 1 材料和方法1 1 2 1 1 材料1 1 2 1 2 方法1 4 2 2 结果2 0 2 2 1h d h s f l c d n a 的分段克隆及全长拼接2 0 2 2 2h d h s f l 的生物信息学分析2 0 2 3 讨论2 6 2 3 1 海南坡鹿外周血白细胞的分离2 6 2 3 2h d h s f l 的生物信息学分析2 7 第三章h d h s f1 的表达2 8 3 1 材料和方法2 8 3 1 1 材料2 8 3 1 2 方法3 1 3 2 结果3 5 3 2 1h d h s f l 原核表达载体的构建3 5 3 2 2h d h s f l 的原核表达与表达条件优化3 6 3 2 3 重组融合蛋白的可溶性分析3 8 3 2 4 重组融合蛋白的w e s t e r nb l o t 分析3 8 3 3 讨论3 9 3 3 1h s f l 研究前景3 9 3 3 2 重组融合蛋白的表达4 0 v 海南坡鹿h s f i c d n a 的克隆与表达 第一章绪论 1 1 文献综述 通过信号传导，细胞将环境信号传递给胞内效应因子，从而调节细胞的增殖、凋亡、 分化等生命活动。蛋白损害休克，如经典的热休克，通过激活e r k 和j n k 激酶途径， 决定细胞的命运一增殖，静止或死亡。细胞对休克的反应，取决于休克的强度和持续时 间。严重高温休克抑制了细胞各项生理活动，如d n a 复制，蛋白合成等。短暂的暴露 于温度升高的环境中，可以使细胞获得热耐受性，从而具有修复一定程度蛋白损害的能 力。如果休克强度超过一定的阈值，就会导致细胞凋亡或死亡。细胞的存活与凋亡，决 定于存活和凋亡信号的强度，许多存活和凋亡通路中的重要调节因子，通过与热休克蛋 白( h e a ts h o c kp r o t e i n ，h s p ) 相互作用而发挥调节功, 日u 匕v - , 【1 1 。 自从1 9 6 2 年r i t o s s a 首次描述了置于高温环境下的果蝇唾液腺染色体上出现蓬突 ( p u f f s ) ，从而预示该区域因为热休克而转录活性增强，并提出热休克反应以来，人们对 热休克的研究不断深入【2 1 。在热休克反应中，机体产生大量保护性蛋白，即h s p ，可以 防止蛋白变性，使变性蛋白解聚，帮助蛋白正确折叠，同时还可以降解不可复性蛋白【3 4 】。 h s p 的表达受到热休克转录因子( h e a ts h o c kt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，h s f ) 的调节，在哺乳 动物已经发现的三个热休克转录因子h s f l 、2 、4 中，h s f l 在热休克反应中的最为重 要。当哺乳动物组织或细胞受到如重金属、紫外线损伤、氨基酸类似物、热休克等休克 时，h s f l 通过一系列的过程而激活，增强h s p 的表达，对细胞产生保护作用。h s f l 调控h s p 的表达的同时，还在细胞凋亡、炎症反应、癌细胞耐药性、胚胎发育等方面 扮演着重要角色【5 ，6 ，7 ，8 1 。 1 1 1h s f 的结构 迄今为止，在许多生物中已经发现了各种各样的h s f 。在众多h s f 中，h s f l 最为 保守，种间同源性在4 0 以上。不同来源的h s f l 都具有两个保守的结构域：一个是位 于氨基末端的d n a 结合结构域( d n a b i n d i n gd o m a i n ，d b d ) ，负责h s f l 与其调控元件 一热休克元件( h e a ts h o c ke l e m e n t ，h s e ) 的结合【9 1 ；另一个是七价重复序列( h e p t a dr e p e a t s ， h r ) ，h s f l 分子间通过这一结构域相互作用，寡聚化后形成同源三聚体【l 叭。 1 1 1 1d n a 结合结构域 d b d 由约1 0 0 个氨基酸残基组成，形成一个“螺旋转角螺旋”的结构，其中一个 螺旋作为识别螺旋，通过与d n a 双螺旋大沟中碱基相互作用而特异性的结合于靶基因 启动子上游h s e 上。h s e 核心序列为“n g a a n ”( n 代表任意碱基) ，三个或三个以上 的核心序列反向重复排列，被寡聚体化的h s f l 的各d b d 分别识别和结合。在不同靶 海南坡鹿h s f l c d n a 的克隆与表达 基因上游，随着h s e 的保守程度不同，其转录强度各异，从而实现一种序列依赖性的 转录调节。 1 1 1 2 三聚化结构域 三聚化结构域位于d b d 的n 末端，与d b d 相邻，是另一个保守的结构域，含有 三个重叠的亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r ) 结构，是一种进化上高度保守的疏水性七氨基酸 重复序列h r a j b 。亮氨酸以近似于每七个氨基酸出现一次的频率出现，从而使其在0 【 螺旋一侧呈线性样排列，形成疏水面，不同单体通过疏水作用形成三聚体。一般来说， 这一结构主要是使转录因子间形成二聚体，而如h s f l 这样形成三聚体的比较少。在脊 椎动物h s f l 的羧基术端，还有一个疏水性七价重复序列h r - c ，在酵母h s f 中，没有 这一结构域，从而使酵母h s f l 在非休克条件下就可以形成三聚体，组成型结合于h s e 上，形成基础水平的转录。因此有人推测，该区域可能通过与h r a b 作用，形成分子 内作用，从而抑制形成三聚体的分子间作用，对h s f l 进行负调节【1 1 , 1 2 1 。 1 1 1 3 其它结构 在h s f 中，核定位序列( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns e q u e n c e ，n l s ) 是另一类保守的结构， 但其位置不固定，在拟南芥a t h s f a l a 中，n l s 位于多肽链中部，而在a t h s f b l 中，n l s 位于多肽链c 末端【1 3 】。这个重要结构使在胞质中活化的h s f 转移到细胞核内，启动下 游基因的转录。 转录激活域( t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n ，t a d ) 也是h s f 较重要的结构之一，但其 种间的同源性不高，位置也不十分固定【1 4 】。人h s f l 有2 个独立的转录激活域，分别位 于n 末端和c 末端1 3 处，其活性受调节区域( r e g u l a t o r yd o m a i n ，r d ) 的调节。该调节 区域位于三聚区域与该活化区域之间，对热刺激信号敏感 ”1 。 d b d h r - a t br dh r - c t a d 图l 一1h s f l 的结构 d b d ，d n a 结合结构域；h r - a b ，七价重复序列a b ；r r 调节区域；h r - c ，七价重复序列c ；t a d ，转录激活结构域 f i g 1 1 t h es t r u c t u r eo f h e a ts h o c k t r a n s c r i p t i o nf a c t o r1 d b d ，d n a b i n d i n gd o m a i n ；h r a b ，b e p t a dr e p e a t sa b ；r d ，r e g u l a t o r yd o m a i n ；h r c ，h e p t a dr e p e a t sc ；t a d ， t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n 1 1 2h s f l 的活化过程 2 海南坡鹿h s f l c d n a 的克隆与表达 多种休克因素可以活化h s f l ，如高温、错误折叠蛋白的大量积累、紫外线损伤等， 其中，以热休克最为典型。细胞受高温休克后，h s f l 被活化，其过程大致分为三个阶 段： 1 1 2 1 由无活性的单体形成有活性的三聚体 在通常情况下，h s f l 与h s p 9 0 等蛋白结合，以无活性的单体形式存在于胞质与细 胞核中。当细胞受休克条件刺激后，细胞中产生的大量变性或错误折叠的蛋白，竞争性 与h s p 9 0 结合，最终解除了对h s f l 的活性抑制，使h s f l 由单体转变成三聚体【l 6 1 。 1 1 2 2 核转移后与热休克元件的结合 活化后的h s f l ，其n l s 被细胞输入蛋白所识别，由胞质中转移到细胞核中【17 1 。在 靶基因启动子上游，通常有多个拷贝的h s e ，而h s f l 单体与h s e 的亲和性很低，只 有形成三聚体后，通过三聚体中每个h s f l 识别一个保守序列“n g a a n ”，两者的亲和性 才大大增强。果蝇h s p 7 0 启动子上游含四个h s e ，每个h s e 有3 - 5 个保守序列组成， 通过对上游h s e 的缺失突变，仅保留一个h s e ，突变体在热休克下转录活性比野生型 低1 8 】。实验结果同时表明，不仅h s e 数目对转录强度有很大影响，而且h s e 中序列的 保守程度也极大的影响下游基因的转录。h s e 中h s f l 三聚体结合位点之问存在协同效 应，一个h s f l 三聚体结合后，可提高下一个三聚体与相邻h s e 的结合能力，这种协同 作用在激活下游基因的转录中发挥重要的作用 1 9 , 2 0 。 1 1 2 3 激活下游基因的转录 在较低等的真核生物中，h s f 与h s e 的结合过程与h s f 促进转录过程是耦联的， 即三聚体化的h s f l 结合于h s e 上后，即使h s f l 转录激活域暴露，促进下游基因转录。 而在高等真核生物中，h s f l 的活化还涉及特定氨基酸的磷酸化等过程【2 1 ，2 2 1 。 图1 - 2 假设的h s f l 的激活过程 f i g 1 - 2 a p u t a t i v em o d l ef o rh s f l a c t i v a t i o n 1 1 3 动物h s f 家族 在脊椎动物中，自第一个热休克转录因子发现后，相继发现了四种热休克转录因子， 3 海南坡鹿h s f i c d n a 的克隆与表达 h s f l 、h s f 2 、h s f 3 、h s f 4 ，其中h s f l 、h s f 2 和h s f 4 在所有的脊椎动物中广 泛存在，h s f 3 则具有种属特异性，仅在鸟类中发现【l6 1 。h s f l 、h s f 2 、h s f 3 在动 物体内各器官均表达，而h s f 4 在动物体内分布具有组织特异性，主要表达于心脏、骨 骼肌、大脑、水晶体等【2 3 2 4 1 。尽管对于众多热休克转录因子的功能及复杂调节机理的了 解还不全面，但研究显示，不同h s f 识别同样的或特异的休克信号，在控制热休克基 因转录的同时，还与其它调节因子相互作用，进而将细胞休克和其它信号网络联系起来。 1 1 3 1h s f l 在脊椎动物的各种h s f 中，h s f l 同酵母和果蝇中唯一的h s f 同源，是最主要的受 休克诱导的转录因子 2 5 , 2 6 , 2 7 1 。h s f 对果蝇是必需的，缺失h s f 的果蝇表现出过早的发育 表现型。同时，h s f 对热休克反应的诱导以及休克的耐受性起着关键作用【2 8 2 9 1 。虽然缺 少h s f l 的基因敲除小鼠可以正常发育为成体，但是，来自这种缺失h s f l 小鼠的成纤 维细胞不能通过休克来诱导热休克基因的转录，这与h s f l 在热休克反应中起关键作用 的结论一致【3 0 1 。 1 1 3 2h s f 2 与对h s f l 在热休克反应中的作用所做的大量研究相比，人们对h s f 2 的研究还比 较少，对h s f 2 在基因表达调控中的作用还不是非常清楚。与h s f l 不同，h s f 2 以无活 性的二聚体存在，激活后形成三聚体，获得与d n a 结合的能力，在小鼠胚胎发育、精 子生成和经氯化血红素( h e m i n ) 诱导的人红白血病细胞k 5 6 2 中调节基因的表达 3 1 , 3 2 , 3 3 , 3 4 。尽管各种实验结果显示，h s f 2 在生物发育和细胞分化中发挥作用，但h s f 2 的激活机制还不清楚。m a t h e w ”】等研究提示，h s f 2 的激活与依赖于泛素的蛋白降解途 径相关。通过将乳胞素( 1 a c t a c y s t i n ) 泛素蛋白酶体通路抑制因子，与表达h s f 2 的哺乳 动物细胞一起温育，可以使h s f 2 获得非细胞类型依赖性的d n a 结合活性。h s f 2 比较 不稳定，其在胞内的浓度随蛋白酶体活性的抑制而升高【3 6 1 。因此，h s f l 能够迅速的对 休克做出反应，而h s f 2 对休克的反应则是滞后的【3 7 】。k r o e g e r l 3 8 等人对热休克转录因 子最佳核酸结合位点的研究发现，h s f l 和h s f 2 结合所需的h s e 保守核苷酸和h s e 的 数量均不一样，从而提示，h s f 2 有可能与h s f l 识别不同的靶基因。 1 1 3 3h s f 3 在鸟类细胞中，h s f l 和h s f 3 共表达，并被化学的或生理的休克共同激活，发挥 作用 1 1 , 3 9 , 4 0 1 。h s f 3 与h s f l 的活性动力学和温度阈值均不相同，在鸟类未分化细胞和胚 胎组织中，h s f 3 的d n a 结合活性受到抑制。h s f l 只在鸟类大脑组织中对严重的热休 克产生应答反应，而h s f 3 在血细胞中广泛表达，对光照、热休克等应答，调节基因转 录。在血细胞的细胞核中，h s f l 以颗粒形式存在，提示其调节另一类基因的转录【4 。 4 海南坡鹿h s f l c d n a 的克隆与表达 在缺失h s f 3 的鸟类细胞中，即使h s f l 正常表达，也不能激活细胞正常的热休克反应 4 2 1 。h s f 3 还可以同其它转录因子作用，如通过与m y b 癌基因结合域之间的蛋白相互 作用而被激活。这种相互作用，揭示了一条细胞生长和细胞休克间产生联系的新途径【4 3 1 。 1 1 3 4h s f 4 h s f 4 主要在水晶体中表达【2 3 彤】，由于缺乏抑制三聚体形成的结构域，h s f 4 一般以 可以与h s e 结合的三聚体的形式存在 4 5 , 4 6 】。水晶体中有两种类型的细胞，即上皮细胞 和纤维细胞。h s f 4 在两种细胞的早期发育阶段表达，并且对两类细胞正常生长和分化 起重要作用【4 7 1 。研究发现，h s f 4 在体内结合于水晶体细胞基因组上的很多位点，其中 5 3 的位点位于内含子和外显子区，4 0 位点位于基因编码区的末端附近，只有5 的结 合位点位于启动子附近，其中有许多位点同时被h s f l 和h s f 2 结合。当h s f l 和h s f 2 表达降低时，h s f 4 在发育阶段调节一些基因的表达。虽然h s f 4 的结合不改变基因的 表达水平，但却使其结合区内产生一定程度的去甲基化。h s f 4 的许多靶基因的表达受 热休克的诱导，一些非典型的热休克基因的激活，需要h s f 4 对染色质结构进行如去甲 基化等修饰，以利于h s f l 与h s e 结合【2 3 1 。 1 1 4 与h s f l 相互作用的蛋白 1 1 4 1 热休克蛋白 热休克蛋白普遍存在于各种原核和真核细胞中，并且结构高度保守。在真核生物间， h s p 的同源性可达6 0 8 0 0 0 4 8 , 4 9 】，这种结构上的高度保守提示其在功能上的高度一致。 根据分子量大小可分为h s p l l 0 、h s p l 0 5 、h s p l 0 0 、h s p 9 0 、h s p 7 0 、h s p 2 5 等，不同 h s p 各具有不同的功能。 h s p 9 0 是研究得比较多的一种热休克蛋白。在哺乳动物细胞中，h s p 9 0 占到细胞胞 浆总蛋白1 2 ，而在肿瘤细胞中，其含量较正常细胞高出2 1 0 倍，提示h s p 9 0 对肿 瘤细胞的增殖和存活起着重要的作用。真核细胞中近1 0 0 种蛋白质受到h s p 9 0 的调节 5 0 l 。这些蛋白质多与信号转导作用有关，它们与h s p 9 0 一起进入一个以h s p 9 0 h s p 7 0 为 主的伴侣复合体，在复合体内完成信号转导作用【5 1 1 。h s p 9 0 发挥分子伴侣功能需要a t p 的结合和水解，同时依赖于和不同的辅助伴侣分子构成伴侣蛋白复合体。由于结合 a t p a d p 状态的不同以及辅助伴侣分子的不同，h s p 9 0 对底物蛋白发挥着截然相反的 调节作用1 5 2 j 。 h s p 7 0 是最保守和最重要的热休克蛋白家族，也是研究最多的h s p 。迄今已经发现 4 种类型的h s p 7 0 。第一种是h s p 7 0 ，仅在热休克后出现于细胞中，而在正常细胞中不 表达或表达量很少，故被称为诱导型h s p 7 0 ；第二种为热休克同源蛋白7 0 ( h e a ts h o c k c o n g n a t ep r o t e i n7 0 ，h s c 7 0 ) ，在正常生长的细胞中含有很高比例的h s c 7 0 ，在热休克或 其它休克后其含量也会增高，也称做组成型h s p 7 0 1 5 3 】。h s c 7 0 除在包被网格蛋白小泡 海南坡鹿h s f i c d n a 的克隆与表达 去包被过程和蛋白折叠过程中充当a t p a s e 作用外，还可以调节促凋亡蛋白( p r o a p o p t o t i c p r o t e i n ) b i m 的m r n a 的稳定性【5 4 1 。另外两种类型是存在于内质网腔内的葡萄糖调节蛋 白7 8 ( g l u c o s er e g u l a t e dp r o t e i n 7 8 ，g r p 7 8 ) 和位于线粒体内的g r p 7 5 ，两者均具有分子伴 侣功能【5 5 1 。 细胞受到热休克后，h s f l 由无活性的单体转变为具有d n a 结合能力的三聚体，再 通过如磷酸化一类的修饰后，迅速激活热休克基因的转录，对机体起到保护作用。在热 休克反应的恢复过程中，热休克基因表达恢复到正常水平，h s f l 也重新转变为无活性 的单体。这一过程伴随着如h s p 7 0 这样一些分子伴侣基因表达的升高。y a n h o n gs h i 5 6 】 等研究显示，h s p 7 0 同其辅助伴侣分子h s p 4 0 直接作用于h s f l 转录激活域，抑制h s f l 活性。在细胞内过表达两者中任何一个分子伴侣基因，都可以抑制内源性h s f l 的活性。 同时，h s f ld n a 结合活性以及h s f l 的诱导磷酸化均受到抑制。h o n g y a nx i n g ，7 1 等人 研究发现，h s f l 通过与偶对蛋白( s y m p l e k i n ) 以休克依赖性的方式相互作用形成复合物， 调节h s p 7 0m r n a 的多聚腺苷酸化。同时，在休克细胞中，h s f l 存在于多聚腺苷酸化 因子c s t 一6 4 中。通过在细胞内过量表达没有d n a 结合活性的h s f l ，可以抑制h s f l 一 s y m p l e k i n 复合物的形成，从而使h s p 7 0r n r n a 的多聚腺苷酸化水平和蛋白水平均降低。 提示了h s f l 不仅可以作为转录因子激活转录，还是一个多聚腺苷酸化的刺激因子。 与原核生物相比，真核生物基因表达调控涉及更多环节，在成熟m r n a 从细胞 核被运输到细胞质过程中，涉及易位启动子区( t r a n s l o c a t e dp r o m o t e rr e g i o n ，t p r ) 蛋 白的参与。t p r 是一种由核篮伸出一直延伸到核仁的丝状蛋 5 8 , 5 9 】，可以促进核孔复合 物与细胞核内部物质的双向运输【6 0 1 。h o l l i es s k a g g s 们】研究发现，细胞受休克因素刺激 后，t p r 蛋白与h s f l 相互作用，被募集到h s p 7 0 启动子区，将从该启动子转录出的 m r n a 转运到胞质中。h s p 7 0 作为分子伴侣，可以和一些细胞中的蛋白质结合，并帮 助这些蛋白质穿过内质网腔或线粒体膜。细胞内有很多蛋白合成后即和h s p 7 0 暂时结 合，以保证其适宜的结构状态。当蛋白质的细胞内转移完成后，蛋白与h s p 7 0 解离， 折叠弯曲成最终的形式。近年来，陆续有研究发现，h s p 7 0 可被机体主动释放到细胞外 并进入血液循环，成为细胞外h s p 7 0 ( e x t r a c e l l u l a r h s p 7 0 ，e h s p 7 0 ) ，参与免疫细胞活化， 免疫因子释放，激活与疾病相关的细胞信号通路等一系列重要的细胞生命活动【6 2 1 。 小分子h s p 是一个极富多样性的家族，不同种属生物体有不同的种类。但小分子 h s p 有其共同的特点，不同分子量h s p 的氨基酸序列及蛋白质结构都有一定相似性， 它们在细胞内的分布相同，可以形成大小和结构相似的颗粒。小分子h s p 的功能之一 是参与聚合蛋白质的解聚和异常蛋白质的降解。 h s p 8 又称为“泛素”( u b i q u t i n ) ，是一种非常保守的蛋白。目f j 认为，泛素主要参 与细胞内异常蛋白质的降解。休克状态下，变性的蛋白作为靶蛋白首先被泛素化，然后 6 海南坡鹿h s f l c d n a 的克隆与表达 通过特定的门控通道被转运至蛋白酶体内进行蛋白酶解，或者降解为短肽并释放出泛素 分子，或者去泛素化后蛋白被回收利用，从而迅速清除细胞中由休克引起的大量变性蛋 白，维持细胞内环境的稳定【6 3 1 。 同样属小分子h s p 家族的h s p 2 7 ，其多肽链c 末端具有0 【一晶体结构域，该结构域 内氨基酸残基磷酸化水平的改变可调控h s p 2 7 的聚合；多肽链n 末端富含脯氨酸、苯 丙氨酸残基，序列相对保守。与其它主要的分子伴侣不同，h s p 2 7 活性的发挥不依赖于 a t p ，它能够同未折叠蛋白结合，并使其保持折叠状态。生理状态下，h s p 2 7 呈组成型 表达，参与调控细胞的增殖、分化等生理过程；而在休克状态下，h s p 2 7 表达呈诱导型 表达，通过调节细胞凋亡的关键信号通路，如抑制凋亡、减少活性氧物质形成等方式发 挥保护作用。h s p 2 7 活性受热诱导的磷酸化和寡聚化的调节，其中，磷酸化是在热休克 中，由促分裂原活化蛋白激酶激活蛋白2 ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s a c t i v a t e d p r o t e i n ，m a p k a p2 ) 催化【6 训。 h s p 2 7 在细胞的热耐受性中也起着重要的作用。细胞过表达h s p 2 7 ，可以使由热诱 导引起的核蛋白的聚集更迅速的解离。h s p 2 7 结合于纤维状肌动蛋白，使肌动蛋白纤维 可以抵抗热诱导的或细胞松弛素d 诱导的降解作用。在多种耐药性肿瘤细胞中，h s p 2 7 的表达水平均比癌旁正常组织高，应用r n a 干扰特异性地阻断耐药性卵巢癌细胞中的 h s p 2 7 表达后，细胞在原耐受药物作用后凋亡增加，存活率明显下降，对药物的耐受程 度大大降低。而在卵巢癌细胞、骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞等细胞中过表达h s p 2 7 ，可提 高肿瘤细胞对药物的耐受性。 芷+ ， h s p 在通过负反馈机制抑制h s f l 的表达同时还可以激活h s f l 的表达。h a e n gr a n s e o 6 5 】等在辐射诱导的纤维肉瘤细胞( r a d i a t i o n i n d u c e df i b r o s a r c o m ac e l l ，r i fc e l l ) 中稳定 过表达h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 ，结果促进了内源性的热休克蛋白的表达( 包括h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 ) ，从而说明，过量表达h s p 2 5 和诱导型h s p 7 0 可以提高内源性h s p 2 5 和诱导型h s p 7 0 启动子活性。凝胶阻滞实验结果表明，在稳定过表达h s p 2 5 或诱导型 h s p 7 0 的r i f 细胞中，h s f l 的活性也明显提高。与非过表达h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 的细胞相比，h s f l 和h s f 2 基因表达强度在转录水平上没有明显差别、，但在过表达 h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 细胞中，h s f l 和h s f 2 蛋白的表达明显高于非过表达细胞，且 半衰期更长，更稳定。这说明，h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 通过转录后调控增强h s f l 和 h s f 2 活性。激活态的细胞外信号调节激酶( e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e g u l a t e dk i n a s1 2 ， e r k l 2 ) 可以使h s f l 的3 0 7 位丝氨酸残基磷酸化，抑制h s f l 的活性。而在过表达h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 的细胞中，m k p l 磷酸化水平升高，抑制了e r k l 2 的活性。在高表达 h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 的人骨肉瘤细胞( h u m a no s t e o s a r c o m a ，h o s ) 并n 人非小细胞肺癌 ( h u m a nn o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r ) 细胞n c i h 3 5 8 中，通过r n a 干扰抑制h s p 2 5 或诱导 7 海南坡鹿h s f i c d n a 的克隆与表达 型h s p 7 0 的表达，明显抑制了内源性热休克蛋白以及h s f l 的表达，同时e r k l 2 磷酸 化得到恢复，从而提示，h s p 2 5 或诱导型h s p 7 0 通过引起e r k l 2 去磷酸化而激活h s f l 。 1 1 4 2 细胞凋亡蛋白 t 细胞死亡相关基因5 1 ( t - c e l ld e a t ha s s o c i a t e dg e n e5 1 ，t d a 9 5 1 ) 最初在突变的淋巴 瘤细胞中被克隆出来，可以调节活化t 细胞表面f a s 蛋白的表达，从而在维持免疫自稳 中发挥作用。除了在活化的免疫细胞中表达，t d a 9 5 1 基因在体内广泛表达，特别在脑、 肾等1 6 州。h s f l 通过增强热休克蛋白表达发挥抗凋亡作用的同时，还可促进特定类型细 胞的死亡。h s p 通过直接结合于t d a 9 5 1n 末端的血小板白细胞c 激酶底物同源结构域 样结构域( p l e c k s r t r i n - h o m o l o g yl i k ed o m a i n ，p h ld o m a i n ) ，抑制c 一末端富脯氨酸谷氨酰 胺组氨酸( p r o l i n e g l u t a m i n e h i s t i d i n e r i c h ) 结构域的促细胞死亡活性，发挥抗凋亡作用。 在不同类型细胞中，热休克和其它休克对h s p 和t d a 9 5 1 表达的作用不同。在暴露于高 温下的雄性生殖细胞中，h s f l 通过直接作用于t d a 9 5 1 ，使t d a 9 5 1 表达水平升高。同 时，h s p 表达却没有受到热的诱导。对t d a 9 5 1 基因敲除小鼠的研究表明，t d a 9 5 1 在促 进热休克诱导的睾丸细胞的死亡中发挥着重要作用。而细胞中h s p 和t d a 9 5 1 的相对表 达水平，都受到h s f l 的调节【6 7 】。 4 - h y d r o x y n o n e n a l ( h n e ) 是在氧化脂质的自发分解中产生的一种促凋亡的亲电子试 剂，h n e 可以激活h s f l ，并诱导h s f l 基因沉默的结肠癌细胞r k o 的凋亡。在r k o 细胞中，抗凋亡蛋白b c l x l 、m c l 1 和b c l 。2 表达水平较正常细胞低，分析基因表达谱 发现，h s p 7 0 的辅助伴侣分子b c l 2 相关永生基因结构域3 基因( b c l 2 a s s o c i a t e d a t h a n o g e n ed o m a i n3 ，b a g 3 ) 在h n e 诱导的对照细胞中表达增强，而在r k o 中无变化。 在结肠癌细胞中通过r n a 干扰使b a g 3 基因表达沉默，降低了b c l x l 、m c l 一1 和b c l 2 蛋白表达，促进细胞凋亡。免疫沉淀实验提示，h s p 7 0 、b a g 3 以及b c l 一2 家族的b c l x l 三者之间存在相互作用。这些结果显示，h s f l 诱导b a g 3 的激活，而激活的b a g 3 诱 导b c l 2 的表达，抑制癌细胞的凋亡【6 8 】。 1 1 4 3 多药耐药性蛋白 多药耐药性( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ，m d r ) 是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药 性的同时，对作用和结构机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉抗药性，从而大大降低了 抗肿瘤药物的疗效，导致化疗失败。肿瘤耐药机理复杂多样，而由m d r l 基因及其编码 的p 一糖蛋白( p - g l y c o p r o t e i n ，p g p ) 介导的耐药机制一直被认为是经典的耐药机制。p g p 是一种能量依赖性药物外排泵，能在环境休克下保护细胞，避免受到有害的化学物质和 代谢产物的损伤。n u r i ae 等研究发现，在h e l a 细胞中表达组成型活性的h s f l ，可以 提高m d r lm r n a 转录水平，并增加细胞内p g p 蛋白量。进一步研究表明，在m d r l 启动子区存在h s f l 的特异性绪合位点h s e ，h s f l 通过直接结合到h s e 上的方式，启 海南坡鹿h s f i c d n a 的克隆与表达 动m d r l 的表达1 6 9 1 。 1 1 4 4 细胞因