（园林植物与观赏园艺专业论文）黄连木初代培养及褐变影响因子的研究.pdf

摘要 随着能源消耗量的不断增加，常规能源的不可再生性和环境恶化效应，迫 使人类不得不重新审视和调整能源发展战略，于是可再生的生物能源成为人类 2 1 世纪能源研究发展的热点。黄连木( p i s t a c i ac h i n e n s i sb u n g e ) 属漆树科黄连 木属落叶乔木，原产我国，是我国珍贵木本用材树种和生物能源树种。 本实验以黄连木茎段为外植体，研究外植体最佳灭菌方法、腋芽诱导最佳培 养基配方及褐变影响因子。在黄连木组培快繁初代过程中，外植体易发生褐变， 导致外植体生理功能衰退，严重阻碍黄连木组培快繁的正常进行。本文对黄连木 外植体褐变相关的影响因子进行了比较系统研究，目的在于从理论上认识外植体 褐变，通过各因素对褐变的影响，找到影响褐变的主导因子，以期为抑制黄连木 外植体褐变提供技术支持。 研究结果表明： 1 黄连木外植体最佳灭菌方法是：黄连木茎段_ 洗衣粉上清液浸泡1 0 m i n 并 用软刷刷去表面污垢_ 自来水冲洗3 0 r a i n - - - * 超净台上用7 0 酒精浸2 0 s _ 无菌水 冲洗2 次卅1 升汞浸8 m i i l _ 无菌水冲洗8 次_ 接种到培养基上。 2 影响黄连木腋芽萌发的主要因素有：基本培养基、6 一b a 、n a a 。黄连木 ”腋芽诱导最佳培养基是：i 2 d k w + b a l 0 m g l - 1 + n a a 0 0 5 m g l 1 + i b a 0 3 m g l 1 + 食糖3 0 9 + 琼脂8 9 ，p h 值5 8 。 3 黄连木外植体的取材季节和部位是影响褐变的主要因子，5 月中旬是取材 的最佳时期。琼脂浓度对黄连木外植体褐变有显著影响，添加8 9 l - 1 琼脂的培养 基防止褐变的效果最佳。低温处理对减缓褐变有一定的影响，但会影响外植体生 活能力。水解乳蛋白防止外植体褐变的最佳浓度为3 0 0 m g l - 1 。缩短转接周期可 以减轻褐变的发生，转接周期越长褐变程度越严重。不同种类抑制剂对褐变有着 不同的影响，活性炭抑制褐变效果明显，常规褐变抑制剂硫代硫酸钠、v c 、p v p 对黄连木外植体褐变效果影响不显著。 关键字：黄连木褐变外植体 a b s t r a c t a st h er e s u l to fe v e r - i n c r e a s i n ge n e r g yc o n s u m p t i o n ，c o n v e n t i o n a ln o n - r e n e w a b l e e n e r g yr e s o u r c e sa n de n v i r o n m e n t a ld e g r a d a t i o ne f f e c t , t h eh u m a nh a dt or e e x a m i n e a n da d j u s tt h ef o s s i le n e r g yd e v e l o p m e n ts t r a t a g e ma n dr e n e w a b l eb i o e n e r g yb e c o m e t h e2 1s tc e n t u r yh o te n e r g yr e s e a r c h p i s t a c i ac h i n e n s i sb e l o n gt oa n a c a r d i a c e a e p i s t a c i a , i sad e c i d u o u st r e ew a so r i g i no fo u rc o u n t r y , w a sav a l u a b l et i m b e rt r e e s p e c i e sa n db i o e n e r g ys p e c i e si nc h i n a t h ee x p e r i m e n ti no r d e rt os t e me x p l a n t st o s t u d yt h eb e s te x p l a n t ss t e r i l i z a t i o n m e t h o d s ，t h eb e s tm e d i u mi n d u c e da x i l l a r yb u da n di m p a c tf a c t o ro fb r o w n i n g i nt h e e a r l y - g e n e r a t i o np r o c e s so fp i s t a c i ac h i n e n s i st i s s u ec u l t u r e ，e x p l a n t sp r o n et o b r o w n i n g ，r e s u l t i n gi np h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n se x p l a n t sr e c e s s i o n ，b r o w n i n gi sa s e r i o u so b s t a c l et ot i s s u ec u l t u r e i nt h i sp a p e r , c a r r i e do u ts y s t e m a t i cr e s e a r c ht ot h e f a c t o r st oe x p l a n t s b r o w n i n go fp 括m c mc h i n e n s i s , a i m e d a t u n d e r s t a n d i n g t h e o r e t i c a l l ye x p l a n t sb r o w n i n g ，f r e e db r o w n i n gt h ed o m i n a n ti n f l u e n c i n gf a c t o r , w i t h av i e wt op i s t a c i ac h i n e n s i si n h i b i tb r o w n i n gt op r o v i d et e c h n i c a ls u p p o r t 1 t h er e s u l ts h o w st h a tt h ee f f e c t i v ep r o c e d u r eo fs e r i n gu pa s e p s i ss h o o t si s f o l l o w ：t h ea x i l l a r yb u d so ft h ep i s m c mc h i n e n s i sp e d i c e l s - - - , w a s h e db yt a pw a t c ：r d i p p e di nt h ed e t e r g e n tw a t e ra b o u t10 m i na n du s e das o f tb r u s ht oc l e a nt h es u r f a c e d i r t w a s h e da b o u t3 0 m i nb yt a pw a t e r d i p p e di n7 0 a l c o h o l8 st oc l e a n w a s h e d2 t i m e sb ya s e p s i sw a t e f 一d i p p e di nt h e0 i h g c i 也8 m i n - , w a s h e d8t i m e s b ya s e p s i sw a t e r _ i n o c u l a t e di nt h em e d i u m 2 t h es i g n i f i c a n tf a c t o r so fg e r m i n a t i o na x i l l a r yb u d si sm e d i u m 、6 一b a 、n a a t h e b e s ti n d u c e m e n tm e d i u mi s i 2 d k w + b a l 0 m g l - 1 + n a a 0 0 5 m g l - 1 + i b a 0 3 m g l 一+ s u g a r 3 0 9 + a g a r 8 9 ，p h5 8 。 3 t h es i g n i f i c a n tf a c t o r so fb r o w n i n ga r et h ea c q u i s i t i o ns e a s o na n dp o s i t i o n so f t h ee x p l a n t s ，i nm i d - m a yt h eb e s tt i m e a g a rc o n c e n t r a t i o ns i g n i f i c a n ti m p a c to n e x p l a n t sb r o w n i n g ，a d d i n g8 9 l 1a g a rm e d i u mt op r e v e n tb r o w n i n gi st h eb e s t c a r b o n , s o u r c ei sn o ts i g n i f i c a n t l ya f f e c t e d l o w t e m p e r a t u r ep r o c e s s i n go fac e r t a i n d e g r e ew i l ls l o wb r o w n i n g ，b u tw i l la f f e c tt h ea b i l i t yo fe x p l a n t so fl i f e h y d r o l y s i s t h eb e s tc o n c e n t r a t i o ni s3 0 0 m g l t op r e v e n te x p l a n t sb r o w n i n g t os h o r t e n s w i t c h i n gc y c l ec a nb et or e d u c et h eo c c u r r e n c eo fb r o w n i n g ，t h el o n g e rt h es w i t c h i n g c y c l e ，t h em o r es e r i o u st h ed e g r e eo fb r o w n i n g t h et e s tp r o v e dt ob eah i g h c o n c e n t r a t i o no fs a l t si n c r e a s e de x p l a n t sb r o w n i n g b r o w n i n gi n h i b i t o r so i lt h e d i f f e r e n tt y p e sh a v ed i f f e r e n te f f e c t s ，t h ee f f e c to fa c t i v a t e dc a r b o ns i g n i f i c a n t l y i n h i b i tb r o w n i n g ，t h ec o n v e n t i o n a lb r o w n i n gi n h i b i t o r sn a 2s 2 0 s ，v c ，p v pe x p l a n t s o fp i s t a c i ac h i n e n s i sb r o w n i n ge f f e c tw a sn o ts i g n i f i c a n t k e y w o r d s ：p i s t a c i ac h i n e n s i se x p l a n t sb r o w n i n g u i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：年月同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师签名： 时间：年月日 时间：年 月 日 1 文献综述 1 1 植物组织培养外植体褐变的研究进展 植物组织培养中所说的褐变是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身 组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进 一步变褐而死亡的现象【i l 。褐变在植物组织培养过程中普遍存在，这种现象与菌 类污染和玻璃化问题并称植物组织培养的三大难题。目前已在许多植物的组织培 养过程中发现材料有褐变现象，木本植物尤为严重【2 l 。 褐变现象主要是由p p o ( 多酚氧化酶) 作用于天然底物酚类物质而引起的。 鞠志国 3 1 研究发现，果实内总酚含量与其褐变密切相关。m a g e r 和h a r e l 4 l 进行组 培时发现酚类物质的含量与其褐变率成正相关，与成活率成负相关。中科院北京 植物研究所指出鸭梨的褐变是由于低温冷害所致，褐变的底物是以绿原酸为主的 酚类物质，p p o 是催化褐变反应的关键酶。m a g e r 和h a r e l 研究表明正常果实组 织中虽然存在有酚类物质和p p o ，却并不发生褐变，并指出果实中酚类物质和 p p o 在细胞中可能是区域化状态分布。鞠志国 5 1 1 6 1 等实验证明莱阳梨细胞中酚类 物质集中于液泡中，而p p o 主要分布细胞质中。m a g e r 和h a r e l 详细综述了植物 界的p p o ，阐述了p p o 的性质、类型、结构和作用。陈秀芳等【7 l 在果实成熟过 程中某些酚含量和p p o 活性变化的研究，证明了褐变程度与总酚含量以及p p o 活性之间的关系因品种而异。有些品种与p p o 的活性相关，有些则与总酚含量 有关，也有人认为褐变程度与两者均呈显著相关。罗晓芳等【s l 研究表明，多酚氧 化酶的活性与组织培养材料的褐变不呈正相关，但酚类物质的含量与褐变有一定 的相关性。 从现有的研究来看，一般认为外植体的褐变是酶促褐变，主要是由p p o 和它 的底物进行作用的，p p o 是植物体内普遍存在的一类含铜的末端氧化酶，它催化 天然底物酚类化合物，使其发生氧化而形成棕褐色的醌类物质和水，醌又再经非 酶促聚合，形成深色物质( 羟醌与黑色素等) ，它们会逐渐扩散到培养基中抑制其 他酶的活性，并对外植体材料产生毒害作用，严重时可使其死亡9 i t l o l 。 1 2 影响组培外植体褐变的因子 1 2 1 外植体的生理状态 一般来说，褐变随着材料的年龄和组织木质化程度增加而增加。g a n n o u n 1 1 l 等报道阿月浑子2 年和4 年生材料培养获得成功，但8 年和2 6 年生材料则出现褐变 现象。说明幼年材料酚类化合物含量少，而成年材料比较多。引起褐变的物质也 因生长季节的不同而有差异。卡特兰在新茎生长旺盛的6 9 月间褐变物质显著增 加，在生长较弱的冬春季则减少。巴拉圭冬青采自温室的茎段比采自田间的进行 培养时褐变轻【1 2 j 。 不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、 严重程度都存在很大差别【l3 1 。人们注意到，木本植物、单宁含量或色素含量高 的植物容易发生褐变，这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成 前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形成就多，而酚类化合物含量高 同时也导致了褐变的发生，因此，木本植物一般比草本植物容易发生褐变。从现 有的报道中发现发生褐变的植物中大部分是木本植物。在木本植物中，核桃单宁 含量很高，在进行组织培养是难度大，不仅接种后的初代培养期发生褐变，而且 在形成愈伤组织以后还会因为褐变而出现死亡【2 l 。苹果中普通型品种金冠茎尖培 养时褐变相对较轻，而柱型的4 个“芭蕾 品种褐变现象严重，特别是色素含量 高的“舞美 品种。橡胶树的花药培养中，海垦2 号褐变比其他品系轻。d a l a i 等 4 】在比较2 个葡萄品种“p u s as e e d l e s s 和“b e a u t ys e e d l e s s 的褐变时，发现后 者l t - f i i i 者褐变严重，酚类化合物含量也是后者明显高。 取材时期不同外植体褐变程度不同，夏季材料褐变程度最强，而冬季进入休 眠，不太容易生长，所以最好选用早春和秋季的材料作为外植体【1 5 l 。 外植体组织受伤程度直接影响褐变。为减少褐变，切割时应尽可能减小伤口 面积，剪切尽可能平整些，并缩短暴露在空气中的时间【1 5 1 。除了机械伤害外， 接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变，且不同种类及其不同浓度 对不同外植体伤害的程度也不尽相同。一般来讲外植体消毒时间越长，消毒效果 越好，但褐变也越严重，因而消毒时应针对不同外植体掌握不同的最佳消毒方法 和时间，才能保证较高的外植体存活率i i 剐。 1 2 2 培养基 在樱花和油棕的离体快繁中发现，高浓度无机盐培养基容易导致培养材料的 褐化【1 8 1 。但在柿树组织培养中发现，改良m s 培养基能促进外植体分化，并减 轻外植体褐变程度【1 9 l 。此外，激素也影响材料的褐变。在同种培养基上，6 - b a 的添加量与外植体的褐化率呈正相关。张卫芳等 2 0 1 在对一年生薄壳山核桃的茎 尖培养时发现，随着6 b a 浓度升高，褐化率增高，褐化的反应时间也随之提早， 同时发现较低浓度的6 一b a 适宜茎尖的分化生长，褐化反应慢，部分培养基已无 明显褐化现象，添加2 ，4 - d 、i a a 的组合中，褐化反应稍有些推迟。这说明，6 - b a 能促进酚类化合物的合成并具有刺激多酚氧化酶活性的作用，同时也表明，选择 适当的培养基以及选择最佳的生长调节物质可以有效地抑制褐变。培养基中适量 的添j j i i a c 也能有效抑制外植体褐化产生，但应当注意的是a c 也能吸附培养基中 2 的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用a c 时，需适当提高培养基 中激素的浓度。邱璐等【2 i j 研究发现培养基的硬度对褐变也有一定的影响，在一 定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低，这可能是培养基的硬度影响 了酚类物质的扩散速度的缘故。 1 2 3 培养条件 培养条件如温度、光照、c 0 2 浓度等对褐变均有影响。温度过高或光照过强， 都可以提高多酚氧化酶的活性，从而加速被培养组织的褐变2 2 j 【3 0 1 。如甘蔗胚性 细胞在过强的光照下，细胞团表面容易褐变，弱光条件下出现绿色芽点l 。高 c 0 2 浓度会促进褐变，原因是环境中c 0 2 向细胞内扩散，细胞内积累过多的碳酸 根离子，碳酸根离子与细胞膜上的钙离子结合使钙离子减少，导致内膜系统紊乱 和瓦解，使酚类物质外渗，与p p o 相互接触，从而褐变发生【4 1 。 1 3 克服外植体褐变的措施 1 3 1 外植体的选择及预处理 成功经验表明，选择适当外植体与最佳培养条件是克服材料褐变的重要手 段。d a n h u ay u 【2 4 l 研究了外植体的起源与组织褐变的关系，他们认为生长在庇荫 条件下的外植体比生长在全光下的外植体褐变率底，腋生枝上的顶芽比其他部位 枝的顶芽褐变率低。外植体材料应具有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化 和再分化条件下，外植体处于旺盛的生长状态，这样可减轻褐变。 苹果防褐有效的措施是对母株遮光，母株经温室一般栽培后外植体在固体培 养基培养前先在液体培养中短期培养，外植体采自热处理母株【2 5 1 。为了使细胞 的伤害降到最低，用于切割的解剖刀必须尽可能地锐利，解剖刀的消毒不能过分 灼烧，否则会使刀刃变钝1 2 6 1 。将核桃2 1 、巨桉【2 6 1 等外植体在5 。c 下进行低温预处 理一段时间均有助于减轻褐化。红豆杉采用4 5 预处理对克服褐变也有效，但对 组织的活力有较大的损伤，影响愈伤组织的发型2 7 】。切割外植体时在抗氧化剂 或吸收剂中进行，或用这些药剂保存刚切下来的组织，由于隔离了切面伤口的氧 气和抑制活性等原因，而使褐变减少，油棕、红豆杉、香蕉、魔芋等组织培养前 可采用此法。但对那些组织快速氧化的植物，如苹果、油橄榄用抗氧化剂处理则 没有效果。核桃【2 j 外植体预先应在只含蔗糖的培养基中培养5 7 天：茶树带少量 叶的茎段预培养1 5 天1 2 8 】；板栗最初2 3 天用含有0 4 的咖啡碱或含有石灰的培养 基，使形成层伤口排出的单宁沉淀，均有助于减轻褐化四l 。 1 3 2 添加抑制剂和吸附剂 在植物组培中用于抑制剂有：抗坏血酸( v i t a m i nc ) 、硫代硫酸钠( n a 2s 2 0 3 ) ， 此外还有柠檬酸、l 广半胱氨酸( l - c y s ) 、谷胱甘肽、芸香苷、二硫苏糖醇、酪 氨酸、巯基乙醇、卵清蛋白、维生素b 、维生素e 、有机酸、蛋白质水解产物、 3 氨基酸、亚硫氢酸钠、氰化钾、多胺等【3 。关于用抑制剂来防止褐变的报道有 很多，何琼英【3 2 1 用抗坏血酸( v c ) 对香蕉吸芽外植体预处理阻止褐变的研究发现， v e 处理外植体，能减轻外植体褐变，提高芽丛诱导率。这种褐变抑制作用主要 是通过将多元酚氧化酶作用下形成的醌类物质，重新还原为酚。但邱璐【2 i 】等认 为v c 虽能有效地减弱褐化，但会影响培养材料的生长速度。刘淑兰等【3 3 l 在培养 基中添加硫代硫酸钠( n a 2s 2 0 3 ) 抑制褐变试验，结果表明，n a 2s 2 0 3 能有效地控制 核桃外植体的褐变。另外在荔枝细胞悬浮培养过程中，力l , n 5 0 m m o l l - 1 的a g n 0 3 可部分抑制p p o 的活性，防止细胞褐变的发生。 常用的吸附剂有聚乙烯吡咯烷酮( 乙烯聚合p o l y v i n y l p y r m l i d o n e ，p v p ) 、活 性炭( a c ) 等。p v p 是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质 和细胞器的保护剂，可用于防止褐变3 4 j 【3 卯。然而，有些学者通过实验证明t p v p 没有防止褐变的效果，原因是在植物体内存在着不同的酚类物质，而p v p 也存在 不同的分子量类型。活性炭( a c ) 是一种吸附性很强的无机吸附剂，能吸附各种 微量物质和微小颗粒，粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般 在培养基中加入l - 4 9 l 1 的活性炭【3 。利用活性炭良好的吸附特性及时吸附植物 材料分泌出的褐色物质，减少褐变外植体的抑制作用，使外植体尽快分生，进入 分化阶段。在使用过程中，应注意尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生， 因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附褐变物质的同时，也会吸附培养 基中的其他成分，因而对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响1 3 引。 1 3 3 其他方法 将外植体很快转移到新鲜培养基上2 3 次，在某些情况下可以缓解褐化，这 段时间内外植体的切口愈合，外渗停止【3 刀。 有研究表明，热激可以影响植物多酚氧化酶类活性，在植物体中多酚氧化酶 活性与多酚含量是平行的。采用4 5 热激处理多酚氧化酶4 5 m i n ，对克服褐变也 是有效的，因该酶不耐热，在4 5 - - 5 0 ( 2 以上活性迅速下降，4 0 以下则保持稳 定活性【3 酊，但是对组织的活力有较大的损伤。因此使用热激处理方法抑制褐变 时，应谨慎选择温度和处理时间，以保证既可减轻褐变，又不致造成过重的伤害。 目前，研究热激对组织培养中酚类物质引起的褐变现象的影响已经成了一个热点 课题，尤其是热激蛋白在信号传导方面的机制更是受到重点关注p 纠。 选择适宜的接种方式也能减轻褐变，把培养体切面浸入培养基中，减少了褐 化发生的表面积，且较大组织切块的创伤面积相对较小，有利于保持转接初期切 块浅表层细胞或组织处于原来的生长发育状态，从而减轻了因切面褐化带来的毒 害作用3 1 i 。 4 1 4 褐变的机理 褐变分为酶促褐变和非酶促褐变两种【9 l ，目前认为植物组织培养中的褐变主 要是由酶催化引起的。归纳现有的对酶促褐变的研究，可有以下3 种假说。 1 4 1 自由基伤害假说 自由基伤害学说认为，逆境胁迫使植物自由基产生和清除的平衡系统遭到破 坏，自由基积累的增加超过某一阈值，将袭击生物大分子和膜脂，导致膜脂过氧 化加剧，并由此导致膜系统结构和功能的破坏，膜透性增大，进而导致代谢障碍 和膜系统的破坏和解体 4 0 j 。 自由基是机体正常代谢产物，虽然它在细胞代谢过程中连续不断地产生，由 于机体内存在防御系统，故正常情况下其代谢保持平衡状态。但在干旱、高盐分、 s 0 2 、0 3 、低温、衰老情况或水分亏缺时，由于自由基产生过多，此时活性氧的 产生和清除平衡体系被打破，就会导致植物细胞受到伤害。如水分亏缺时气孔保 卫细胞关闭以减少水分丢失，但同时也减少了光合作用所需的c 0 2 ，是卡尔文循 环的阻塞导致了光合电子的堆积而诱发产生高度反应性氧自由基，或由于抗氧化 防御系统作用减弱时，体内自由基不能被完全清除而造成自由基的累积，进而会 危害生物体【4 。 细胞内受自由基伤害最敏感的部位是细胞膜，这是因为细胞膜含有较多的不 饱和脂肪酸，加之在膜的结构中非极性区的氧的溶解度较大，因而膜中局部氧浓 度较高，超氧自由基较易产生。自由基可直接作用于蛋白质，使多肽链断裂，也 可作用于多价不饱和脂肪酸，启动脂质过氧化，同时产生的丙二醛使膜中的酶蛋 白发生交联、聚合，以致使膜产生空隙，透性增强。同时，在水分胁迫下，膜透 性的增加，对为膜所束缚的膦酸酯酶起明显的增溶溶解，从而促进了膜磷脂的脱 酯化反应，其结果导致叶细胞膜膨散，断裂，以至解体，膜脂质从膜脂相中大量 游离出来，并聚集而成脂类小滴，致使膜结构和功能的破坏，引起代谢失调和细 胞内含物大量外渗和降解，液泡化加剧，最终导致细胞死亡，从而引起褐变的发 生4 2 1 。 1 4 2 酚一酶区域性分布假说 质膜是活细胞与环境之间的界面和屏障，其选择通透性能有效保证膜内外物 质交换有效的进行，各种不良因素的影响，往往先作用于这层细胞膜。在正常发 育的植物组织中，底物、氧气、p p o 同时存在并不发生褐变，这是因为在正常的 组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液胞内，而p p o 则分布在各种质体或细 胞质内，这种区域性分布使底物与p p o 不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和 破坏时，酶与p p o 接触，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的 脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变【9 1 1 4 0 1 。 5 1 4 3 保护酶系统假说 植物组织褐变与细胞内的还原水平和保护酶系统有关。在通常情况下，组织 中有较高的还原势；正常的氧化还原代谢平衡使已经氧化的醌类物质通过还原氧 化或转化而未聚和。保护酶系统包括两类物质：一是氧化酶系统，主要有超氧化 歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( g s h p x ) 等，它们可以清除自由基、活性氧，以防止其对细胞膜的攻击，防止 膜脂过氧化；二是抗氧化酶系统，主要有谷胱甘肽还原酶( g s h ) 、抗坏血酸、 维生素e e ) ，类胡萝i - 素( c a r ) 、细胞色素f ( c y t f ) 、氢醌和含硒化合物等，它 们不但能清除自由基和活性氧，同时也可以作为抗氧化剂，对酚类物质的氧化起 抑制作用。在逆境下，超氧化歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 三者作用失调导致h 2 0 2 积累，从而引起褐变的发生1 4 3 1 。 1 5 黄连木概况 漆树科黄连木属有9 个种和1 个变种，中国仅有1 种黄连木即中国黄连木 ( p i s t a c i ac h i n e n s i sb u n g e ) ，根据全国普查结果，中国黄连木分布广，遍布华北、 华中、华南2 3 个省、区，一般分布在海拔2 0 0 0 m 以下的山地与滩地，以海拔7 0 0 m 以下的山地、丘陵分布最多，多数为零星分布，也有大面积的纯林或混交林1 4 4 1 。 黄连木是“四旁 绿化和荒山、滩地重要造林树种，亦可作观赏树种，也是优良 的油料及用材林树种。 1 5 1 黄连木的形态特征及生物学特性 黄连木属漆树科黄连木属，高达3 0 m ，胸径2 m ，树冠近圆球形；树皮薄片 状剥落。叶繁茂而秀丽，通常为偶数羽状复叶，叶互生，小叶1 0 - - 1 4 枚，披针 形或卵状披针形，长5 - - , 9 c m ，宽约2c m 先端渐尖，基部偏斜，全缘。雌雄异株， 圆锥花序，雄花序淡绿色，雌花序紫红色。核果径约6 m m ，初为黄白色，后变 红色至蓝紫色，若红而不紫多为空粒。花期3 - - 4 月，先叶开放；果9 - - - 1 1 月成 熟。黄连木木材坚韧挺直，黄色耐腐，易加工，可供建筑、家具、雕刻等用。根、 枝、叶、皮可制药；鲜叶可提取芳香油：嫩叶有香气，可制茶或腌制做蔬菜。种 子富含油脂，含油率高达4 2 5 ，供食用或工业用，是制取生物柴油的上佳原料 4 5 1 1 4 6 1 o 黄连木喜光，幼时稍耐阴；喜温暖，畏严寒；耐干旱瘠薄，对土壤要求不严， 微酸性中性和微碱性的沙质、粘质土均能适应，以在肥沃、湿润而排水良好的石 灰岩山地生长最好。 1 5 2 黄连木的经济价值 黄连木木材峰韧致密，黄褐色，有光泽，易干燥，好加工，抗压耐腐，油 漆和胶粘性能好，可供民用建筑、制造加工家具、美术工艺雕刻、镶嵌之用，还 6 可制作玩具、文具工艺装修饰品等。黄连木是一种重要的药用植物，树皮、树叶 含有没食子酸、间双没食子酸等，用来治疗痢疾、霍乱、风湿等症；精制种子油 治疗牛皮癣；叶上寄生的虫瘿，称“五倍子”，入中药，治肺虚咳嗽、久痢、多 汗、刀伤出血等症。枝、叶、皮根可用来调制土农药，防治作物病虫危害，可杀 各种水稻害虫、蚜虫、螟虫等4 5 】i 砌。 另外，黄连木果、叶、树皮含单宁3 0 - - 4 0 ，可提取栲胶：果、叶还可提 取黑色染料 4 7 1 。黄连木是嫁接阿月浑子( 开心果) 的适宜砧木，嫁接亲和力高， 大树及幼苗均有较高的成活率，嫁接后植株生长旺盛，表现良好，通过嫁接可提 高阿月浑子的抗性，有利于发展开心果干果经济林【4 引。 黄连木油脂中所含7 种脂肪酸中，油酸、亚油酸、棕榈酸含量占脂肪酸总量 的9 5 7 3 ，其脂肪酸碳链长度集中在c 1 6 - 1 8 之间，由中国黄连木油脂生产的生物 柴油的碳链长度集集中在c 1 7 1 9 之间，理化性质与普通柴油比较接近【4 9 】。 1 5 3 黄连木的观赏价值及在园林中应用 黄连木寿命长达几百年，是城市及风景区的优良绿化树种。树冠浑圆，枝叶 繁茂而秀丽，早春嫩叶红色，入秋叶又变成深红或橙黄色，红色的雌花序也极美 观，不同季节色态不一，四季有特殊香气，宜作庭荫树、行道树及山林风景树， 常作“四旁”绿化及低山区造林树种，也可用于滨海盐碱地防护林造林刚。在 园林中植于草坪、坡地、山谷或于山石、亭阁之旁配植无不相宜。若要构成大片 秋色红叶林，可与槭类、枫香等混植，效果更好。据云南名树古木记载，兰 坪县石登乡仁甸河村一棵黄连木高2 3 m ，胸径3 2 0 c m ，树龄高达1 5 0 0 年，被当 地群众视为“神树”。 黄连木对二氧化硫等有毒气体有着较强的抗性，因而在城市绿化美化的同 时，可以明显的改善市区的生态环境，为城市增添靓丽的风景，提高城市的消灾 抗灾能力。用于居住区绿化，提高植物覆盖率，为居民休闲休憩提供良好的场所， 也作为主要绿化树种，配合小区绿化，提高区域景观质量，美化环境，营造浓郁 的自然和人文气息 4 4 1 【4 5 1 。 1 5 4 黄连木繁殖方式及研究现状 黄连木可播种繁育，也可以采用扦插、嫁接、组织培养等方式进行繁育，具 体介绍如下： ( 1 ) 播种育苗 黄连木种子成熟期在每年9 月底至l o 月初，未成熟的种子呈红色，成熟的 种子呈绿色，采种后避免暴晒，应在荫凉通风处阴干。播种不要用隔年的旧种子， 因黄连木种子有仁率低，富含油脂，容易走油，会大大降低种子的发芽率o lt 5 1 1 。 又由于黄连木种子外被蜡质，直接播种发芽比较困难。在沙藏前必须对种子进行 7 脱蜡处理。其脱蜡方法为：用1 0 石灰水浸泡种子2 h ，再用清水浸泡2 4 h 后去 皮，在去皮过程中取少量洗洁精清除油垢，再用清水泡2 4 h 后沙藏。因黄连木种 子属深度休眠类型必须经过3 0 6 0 天以上的低温层积处理【5 2 l 。用l 份种子与 3 份湿沙混匀，装入棉沙布袋放人温度o 5 的地窖中，四周用湿沙覆盖，或 在室外地势高燥处挖5 0 c m 6 0 c m 深的坑埋藏。为了尽快均匀出苗，应对种子 进行催芽，一般播种前一周将处理的种子放入温度为2 5 的温室内催芽，一周 后当约有5 0 的种子开始吐白时便可以播种晡3 1 。 ( 2 ) 扦插育苗 秋季落叶后，采集母树上的根蘖条或一年生枝条作为种条，截成1 5 2 0 c m 长， 分级后，每5 0 根或1 0 0 根为一捆，竖立在露天的沙坑中，一层插穗一层湿沙， 至坑口2 0 c m 处盖土，要根据天气情况增添土层，坑中每隔l m 竖一个草把，提 高通气性 5 4 1 。 扦插季节以春季为好，在土壤解冻树后芽尚未萌动的3 、4 月份进行，为保 证扦插的成活和生长，要加强田间管理，早春可以采用小弓棚等保温措施促进生 根发芽。 1 9 9 5 年，杨镇等【5 5 1 进行黄连木嫩枝扦插育苗试验，结果表明：嫩枝插穗首 先用清水浸泡2 h ，然后再用n a a 、i b a 、a b t 等植物生长调节剂处理，窖棚内 扦插生根率可达9 2 以上，其中i b a 2 0 0 p p m 浸蘸插穗5 s ，生根率可达9 2 。牛 正田、李涛等【4 5 l 认为黄连木硬质扦插育苗，插穗极难生根，嫩枝扦插育苗，宜 在5 月下旬至7 月中旬进行，以5 6 月间顶端嫩叶显红色的半木质化枝条生根效 果最佳。嫩枝插穗基部先经清水浸泡2h ，再用植物生长调节剂处理，可促进生 根。其中，4 0 0 p p m i b a 速蘸、6 0 0 p p m n a a 速蘸、2 0 0 p p m i b a 浸蘸5 s 或3 0 0 p p m n a a 浸蘸5 s ，促根效果显著，插穗生根率均在9 0 以上。宋宏伟、刘俊磊掣刈 的研究，硬枝扦插成活率为零，嫩枝扦插除用a b t 生根粉6 号浸泡2h 处理有2 株成活，其余处理未见成活。惠晓萍等【57 】研究，嫩枝扦插诱导生根率低，n a a 和i b a 混合生根率为11 7 ，清水对照无生根。 ( 3 ) 组培快繁 组培快繁是迅速扩大种质资源的重要手段之一，目前国内在黄连木组培快繁 方面的研究很少，至今没有生产上的实例。北京林业大学的刘洋1 5 研研究发现， 以黄连木茎段为外植体，建立黄连木的再生体系，筛选出诱导不定芽生长分化的 培养基为1 2 d k w + 6 - b a l m g l 1 + i b a 0 1 m g l 1 + n a a o 1 m g l - 1 + p v p l 3 9 - l 1 ；种 子壮苗培养基为 i 2 d k w + 6 b a 4 m g l - 1 + i b a 0 0 5 r a g l - 1 + n a a 0 0 2 m g l 1 + p v p l 3 9 l - 1 + 叶酸l m g l 1 + 泛酸钙l i n g l 1 。 国外学者也有所研究，t r u j i l l o ，m i 5 9 将t e r e b i n t h u s 和l e n t i s c u s 黄连木灭菌 8 后接种到改良的h e l l e r 培养基上，培养2 3 天后获得了7 5 9 2 的发芽率。 b e h b o o d i ，b s 1 6 0 以黄连木为材料，发现n a a 和6 - b a 更有利于愈伤组织的形成， i b a 和6 - b a 对茎段生长也更有效。 9 2 引言 由于全球矿物燃油的不可再生，污染环境并且储量有限，因此发展更具环保、 有再生性能的生物能源，得到全世界的高度重视，我国也不例外。生物柴油具有 很好的安全性能，由于闪点高，生物柴油不属于危险品。因而，在运输、储存、 使用方面的安全性是显而易见的。同时，生物柴油具有良好的燃料性能，由于十 六烷值高，使其燃烧性明显好于普通柴油。最为显著的优点在于作为可再生能源， 与石油储量不同，其供应量不会枯竭。生物柴油具有可再生、清洁和安全显著的 三大优势，在目前开发的各类生物能源中，木本生物能源树种一黄连木，成为极 富开发潜力的亮点。国家林业生物柴油原料林基地“十一五”建设方案中明 确规定，要迅速扩大黄连木种植面积，将重点在河北、安徽、陕西、河南等省发 展黄连木2 5 万h m 2 。国家有关部门专家近期考察结果表明，安徽省黄连木资源丰 富，且具有扩大栽培的条件。 但由于黄连木属雌雄异株，花单性，在自然授粉情况下，其后代多为异交系， 自然类型很多，各种性状变异幅度很大，表现良莠不一。因此，开展黄连木组培 快繁技术的研究，不仅可保持其优良品种的特性，也可进一步提高黄连木的开发 利用水平，对促进黄连木生物能源的开发，实现良种高效集约化经营，充分发挥 该树种的潜能等具有重要的意义。 目前在生产中黄连木的繁殖仍然还是沿用传统的繁殖方法，即扦插繁殖，其 生产周期相对较长。黄连木组培快繁的进展严重影响并制约着黄连木的商品化、 产业化、规模化生产。植物组培快繁是植物无性繁殖快速、有效的重要手段，在 短时期内可以提供优良种苗。而且通过组培快繁获得的苗木能够保持其亲代的优 良性状，比通过其他方式繁育的苗木更整齐。因而，组培繁育黄连木已成为生产 上亟待解决的问题。 黄连木属漆树科，其次生代谢物含量高，组培快繁存在很多困难，至今未见 在生产上应用的报道。在黄连木的组织培养实践中，首先遇到的问题是大部分种 类在初代培养过程中，外植体易发生褐变，影响了培养材料的生长和分化，严重 时甚至导致死亡，阻碍了组培快繁的进行。基因型、品种、母株年龄、灭菌剂、 灭菌时间、光照、温度等多种因素影响着褐变的发生频率和严重程度，可以认为 初代培养中能否有效的控制外植体褐变是黄连木组织培养能否成功的关键之一。 因此，找到影响褐变的主导因子和克服褐变的有效措施，从实践上防止褐变的发 生，促进组织培养技术的日臻完善，具有重要的意义。本文针对黄连木在组织培 养启动培养阶段存在的对外植体的灭菌途径以及外植体褐变影响因素进行了比 较深入的研究，以便为下一步的工作奠定基础。 1 0 3 试验材料和研究方法 3 1 初代培养设计 3 1 1 供试材料 以安徽省林科院苗圃发育良好的黄连木优株茎段为试验材料 3 1 2 外植体最佳灭菌措施的筛选 消毒方法：取尚未木质化黄连木的嫩枝将其下端插在水中带回组培室，以防 枝条失水。将嫩枝上叶及叶柄剪除，切成l c m - 2 c m 长的茎段，为备用外植体并 浸泡于清水中，先用毛刷刷去外植体表面污垢及绒毛，再用洗衣粉上清液浸泡 1 0 分钟，清水冲洗。然后用自来水冲洗3 0 分钟，再后将外植体材料经过如表l 所示的6 种不同的灭菌方式处理，每个处理接种2 0 瓶，接种时将灭菌后的茎段， 茎段两端各切去0 5 c m 左右，接种于相同的培养基： 1 2 d k w + 6 - b a l 0 m g l 1 + i b a o 1 m g l - 1 + n a a o i m g l ，培养条件相同。其后每 两天调查记录一次材料的污染情况，两周后统计接种材料的灭菌效果，从而筛选 出最佳的灭菌措旌。 表i 黄连术茎段外植体灭菌措施 t a b l e ls t e r i l i z a t i o np r o c e d u r e so fs h o o t s 处理序号灭菌措施 7 0 酒精l o s + o 1 升汞6 m i n 7 0 酒精2 0 s + o 1 升汞8 m i n 7 0 酒精3 0 s + 0 1 升汞l o m i n 7 0 滔精2 0 s + o 1 升汞8 m i n + l o o m g l p v p 浸泡5 分钟 7 0 酒精2 0 s + 0 1 升汞8 m i n + 1 0 0 m g l p v p 浸泡l o 分钟 酒精棉球擦拭外植体+ 0 1 升汞8 r a i n + 1 0 0 m g l 。p v p 浸泡1 5 分钟 堵养条件：光照强度2 0 0 0 - 2 5 0 0 1 x ，光照时网1 2 h d 、昼溢2 5 2 c - 硬温2 2 2 c 3 1 3 腋芽诱导最佳培养基的筛选 为了解基本培养基、植物激素组合对黄连木诱导腋芽的影响，本试验采用4 因素3 水平正交设计b ( 3 4 ) ，如表2 所示。每瓶接种一个