（分析化学专业论文）微流控电泳芯片通道质量及谱带增宽研究.pdf

浙江大学硕士学位峨文 v7 8 1 1 6 6 摘要 玻璃芯片上的琵细管电泳分离是微流控系统研究和发展的重点。本论文以提 毫徽流控芯片电泳分离效率为鹭躲，进行了玻璃芯片的通道质囊秘芯片魄泳谱带 璜宽魏研究。论文鼹嚣蘸分缀簸。 第一章综述了玻璃的性质，玻璃微流控芯片的加工工慧，扩散系数的测定方 法以及芯片毛细管电泳分离效率和谱带增宽的研究进展。 第二章通过优化亥l 蚀条律，箍高了玻璃芯片通道船工磺鬟：用芯片麓细管电 泳测恣了扩散增宽、进样增宽和检测增宽之和以及荧光素钠和罗丹明1 2 3 的动态 扩散系数；发现芯片毛细管电泳豳于分离通邋短、分离场强高和速度快，检测系 统懿骥痘速度秘扩教壤宠是影桶蔼缨警芯片奄溶分离效率瓣主要嚣素。 馓刻液的组成对玻璃芯片通道质量会产擞较大的影响。通过对玻璃芯片蚀刻 液的对比、选择和优化，将蚀刻液配方确定为1 ：0 5 ：0 7 5m o l lh f n h 4 f h n o ， 在4 0 。c 下 垒裹l 速凄您l 掣r c m i n ，褥婺了惠游戆芯片逶遘。实验结豢表翻，撵品 在粳糙通道中扩散糕度增加。用3 5c m 分离长度的芯片罨细管电泳分离荧光素 钠时，光滑通道的遐论板数比粗糙通道提高1 7 ，达到4 8 万米的理论檄数。 惩改变捻溺点使嚣夔方法，在不霹分离长度捡测搀品潦宠，镬用攮黪熬谱豢 增宽公式，计算得到荧光紊钠的渤态扩散系数d i = 3 4 士o ，2 x1 0 - ：m 2 ，s ，与文献值 相符。 躁录像j 8 实黼撵盛分离静方法鼹察_ 程磷究了芯片电溶避撵和分惑拜雩粒谱考 增宽行为。实验中发现检测系统嬲响应速度辩稔测增宽有较大影响。分离场强越 高，样晶迁移速度越快，系统晌威时间对检测增宽的影响越大。我们、测定得到本 系统的响应时间为o 3 5 秒，它限制了通过提离分离场强来避一步提高芯片毛细 警电溶翡分蹇效率鼹分离发。对予芯片毛缨譬瞧滚系统，爨舞缝溅系统熬麓瘟速 度是进行高速、高效分离必不可少的条件。 关疆谪：激流控葱嚣玻璃键测谱带理 宽扩散系数狻溺璃应薅溺 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t e l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o n0 1 3 g l a s sc h i pi sa n _ e s s e n t i a la s p e c t i i lt h ed e v e l o p m e n to f r a _ i c r o f l u i d i cs y s t e m t h ea i mo ft h i ss t u d yi st oi m p r o v et h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c yo f c h i p - b a s e dc e c h a n n e lq u a l i t yo ft h eg l a s sm i c m c h i pa n db a n db r o a d e n i n gi n c h i p - b a s e dc ew e r es t u d i e d i nt h ef i r s t c h a p t e r , t h el i t e r a t u r e sa b o u tp r o p e r t i e so fg l a s s ，t h ef a b r i c a t i o n t e c h n o l o g yf o rp r o d u c t i o no fg l a s sm i c m f l u d i cc h i p s ，t h em e t h o d sf o rm e a s u r i n g d i f f u s i o nc o e f f i c i e n ta n dp a r a m e t e r se f f e c t i n gt h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c ya n db a n d b r o a d e n i n gi nc h i p b a s e dc es y s t e ma r er e v i e w e d i nt h es e c o n dc h a p t e r , t h ee c h i n gs o l u t i o nh a sb e e l lo p t i m i z e df o ri m p r o v i n gt h e m i c r o f l u i d i cc h a n n e lq u a l i t y n l ed i f f u s i o nv a r i a n c e s ，t h es u mo ft h ei n j e c t i o na n d d e t e c t i o nv a r i a n c e sa n dt h ed v n a m i cd i f f u s i o nc o c 伍c i e n t sf o rf l u o r e s c e i ns o d i u ma n d r h o d a m i n e1 2 3h a v eb e e nm e a s u r e di nm i c r o f l u i d i cc h i p s e x p e r i m e n ts h o w e dt h a t t h ed i f l u s i o nv a r i a n c e sa n dv a r i a n c e sf r o md e t e c t i o ns p e e dw e r et h ek e yf a c t o r sf o r b a n db r o a d e n i n gi nc h i p - b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sd u et ot h es h o r ts e p a r a t i o n c h a n n e ll e n g t h ，h i g he l e c t r i cf i e l ds t r e n g t ha n dh i 曲s e p a r a t i o ns p e e d m i c r o f l u i d i cc h a n n e lq u a l i t yw e r ei m p r o v e db yw e te t c h i n gi nt h es o l u t i o no f 1 ：0 5 ：0 7 5m o t lh f n i - h f h n 0 3a t4 0 。c e x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h es e p a r a t i o n e f f i c i e n c yi ng l o s s i l yc h a n n e lf o rf l u o r e s c e i ns o d i u mw a s 4 8 xl0 5 p e rm e t e r , u n d e r t h ee l e c t r i c f i e l d2 0 0v c ma n dt h es e p a r a t i o nl e n g t h3 5c m 1 7 h i g h e rt h a ni 1 1 r o u g h c h a n n e l d i f f u s i o nc o e f f i c i e n tc a nb ee a s i l ym e a s u r e do nm i c r o f l u i d i cc eb yc h a n g i n g s e p a r a t i o nl e n g t h t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n tf o rf l u o r e s c e i ns o d i u mo b t a i n e db yt h i s m e t h o d w a s3 4 士o 2 x 1 0 - 6 c m ：s a g r e e w e l l w i t h t h e v a l u e i n l i t e r a t u r e b a n db r o a d e n i n gd u r i n gi n j e o t i o na n ds e p a r a t i o nw e r ei n v e s t i g a t eb ym i c r o s c o p e p h o t o g r a p ha n ds a m p l es e p a r a t i o ne x p e r i m e n t e x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ev a r i a n c e f r o md e t e c t i o ns p e e di st h em a i np a r to f t h ed e t e c t i o nv a r i a n c e s i f t h er e s p o n dt i m eo f d e t e c t i o ns y s t e mi sn o tf a s tc n o u g h h i g h e re l e c t r i cf i e l da p p l i e da n dh i g h e rm o b i l i t y o fc o m p o n e n ti n c r e a s e di n f l u e n c ef r o mv a r i a n c e sf r o md e t e c t i o ns p e e d b y e x p e r i m e n ta n dc a l c u l a t i o n ，t h er e s p o n dt i m eo fo u r d e t e c t i o ns y s t e mw a sf o u n dt ob e o 3 5s e c o n d ，w h i c hl i m i t e dt oi n c r e a s i n gt h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c ya n d r e s o l u t i o nb y u s i n g6 秘e l e c t r i cf i e l d d e t e c t o r 耐凼f a s tr e s p o n d 例r e s u t tmb o t hf a s ta n d e f f i c i e n ts e p a r a t i o n k e y w o r d ：m i c r o f l u i d i cc h i p s ，g l a s se t c h i n g ，c h a n n e lq u a l i t y , b a n db r o a d e n i n g ， d i f f u s i o nc o e f f i c i e 嫩s ，r e s p o n dt i m e 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 9 9 2 年，m a n z 和h a r r i s o n 1 l 发表了首篇在微芯片上进行毛细管电泳分离的 论文，标志着以芯片为核心的微流控分析系统的出现。微流控分析系统高速、高 效、低消耗及微型化的优点，使其成为分析科学的前沿技术和研究热点，也使分 析系统实现既“微”又“全”的目标更进了一步。 近十几年，微流控系统的研究和发展重点一直定位在玻璃芯片上的毛细管电 泳分离系统。玻璃电泳芯片也因此成为发展最快、理论与应用技术最成熟的微流 控分析芯片。 玻璃具有良好的电渗和光学性质，加工工艺简便，是首选的芯片材料。芯片 加工是微流控系统发展的基础和前提条件，对微流控芯片的加工技术和结构性能 的研究，为微流控分析系统的快速发展、广泛应用和产业化奠定了电好的基础。 以电场作为流体的驱动力，通过调节场强大小和方向可以方便地进行芯片电 泳的进样和分离操作。芯片通道良好的散热性能和通道结构的多样性，使电泳和 芯片的结合实现了高效和多功能的分离，与传统毛细管电泳一样，芯片毛细管电 泳的分离效率的表示方法也来自色谱理论。但由于微流控芯片的材质、进样方法， 分离通道长度和分离场强等方面不同于毛细管电泳，因此进一步研究影响芯片电 泳分离效率的主要因素，对进一步提高芯片毛细管电泳的分离效率有重要意义。 下面对玻璃芯片的加工及芯片毛细管电泳分离中扩散系数测定、谱带增宽的 研究做出综述。 1 1 玻璃及其性质 微流控分析芯片的常用材料由起始的硅片，己发展到玻璃、石英、有机聚合 物等，其中最常用的是玻璃材料，如钠钙玻璃( 碱石灰玻璃，s o d a 1 i m eg l a s s 2 】) 、 显微镜载玻片( g l a s sm i c r o s c o p es l i d e l 3 ) ，白冕玻璃( w h i t ec r o w ng l a s s t 4 】) 、石英 圾端l q u a r t zg l a s s ，s d i c ag l a s s 。1 ，f u s e d s i l i c a 。1j 、硼硅坡璃( b o r o t l o a t y p y r e x g l a s s 【7 , 8 1 ) 等。 1 1 1 玻璃的优点 玻璃和石英具有一定强度，在可见光和近紫外区透明，有较好的电绝缘和电 渗流性能，且它们的表面性质，例如湿润能力、表面吸附和表面反应性等，都有 利于使用不同的化学方法对其进行表面改性。使用微电子加工硅的光刻和蚀刻技 术可以将微通道网络刻在玻璃和石英上，因此玻璃和石英材料已广泛地应用于制 作微流控芯片。 相对于石英，玻璃更加廉价易得，加工条件要求更低，在一般实验室条件下 浙江大学硕士学位论文 即可加工，所以应用更为广泛。 1 1 2 玻璃的化学组成 玻璃是以s i 0 2 为主要成分的质硬而透明的一类无机材料。用来制作芯片最 常用的为钠钙玻璃，主要由s i 0 2 ( 7 0 ) ，n a 2 0 ( 1 5 ) ，c a o ( 1 0 ) 组成，也可 以k 2 0 代替部分n a 2 0 提高硬度及其它性能。常用的光学平板玻璃( f l a t p l a n a r g l a s s ) 如载玻片、抛光片( p o l i s h e dg l a s sp l a t e ) ，白冕玻璃( 加入一定量的b 2 0 3 取代碱金属和碱金属) 均为钠钙玻璃。 硼硅玻璃的主要成分是s i 0 2 和b 2 0 3 ，不含或只含少量的金属氧化物。 石英玻璃则是基本为纯s i 0 2 的玻璃态材料。 玻璃的化学组成的差异会对其性质和加工产生影响。 1 1 3 玻璃的表面结构 h+h+h 丧曲i 卜= _ _ 5 a 图1 1 玻璃表面结构模型 作花济夫【9 】绘制了钠钙玻璃的表面结构模型( 图i 1 ) ，它表示了玻璃的垂直 断面结构。玻璃表面很容易吸附水，与其作用形成羟基团。在水中，由于硅氧结 构与h + 的键合强度远大于与n r 的强度( 约为1 0 1 4 倍) ，水中的一些h + 或水合氢 离子h 3 0 + 与玻璃中的n a + 交换，扩散到玻璃结构中，形成厚度为1 0 4 1 0 。m m 的 水化层： - = s i o n a + h 2 0 一= s i _ o h + n a o h( 1 1 ) = s 卜o n a + 2 h 2 0 一- = s i o h ，o + n a o h ( 1 2 ) 1 1 4 玻璃表面与酸的反应 在酸中，随着p h 值的降低，溶液中 r 扩散速度增加，玻璃中n a + 和c a 2 + 的溶出量增加。酸侵蚀后表面生成的- = s i o h 可发生聚合反应，生成硅氧保护膜， 阻碍侵蚀的继续进行。 e 1 一s h a m y 【9 】测定了不同浓度的h c i 、h n 0 3 和h 2 s 0 4 对钠钙玻璃侵蚀程度。 酸的浓度在i m o l l 左右时，对玻璃的侵蚀量最大；浓度进一步增加时，加速了 硅氧保护膜的形成，侵蚀程度反而下降( 图1 | 2 ) 。 2 浙江大学硕士学镶论文 誊l 锤 芝 瓣 瓣 群 辇 一2- 1 0l2 3 l g ( 1 m ) 图1 2 酸对钠钙玻璃的侵蚀程度( a h c i ，b h n 0 3 ，c h 2 s 0 4 + 。5 玻璃表蚕麓疆韵反应 猩碱中，硅酸盐玻璃发生如下反应f 9 】： - = s i o s i = - + o h 。- s i o h + - ；s i o 。 ( 1 + 3 ) 反应嚣，= s i - o s i x 涟鞭袈，菲氧轿- = s i o - 群增大，绪构被破坏，s i 0 2 溶密， 玻璃袋面不能生成保护膜，所以硅酸盐玻璃受碱侵蚀很大。碱对玻璃的侵蚀程度 与碱溶液的种类、浓度、温度以及时间均有很大关系。 日 譬 撂 w 链 瀵 楚 燃 濑 旅匿( ) 图1 3 碱溶液浓度与玻璃侵蚀速度的关系 嘲图1 3 可以麓蜷不同种类的碱对玻璃经憾能力不同，侵蚀深度隧麓碱浓度 黪增杰霾两增热，但壤幅逐渐减小，在5 左右( n a o h ) 达到最大毽，骤盈是侵 蚀产物硅酸盐降低了碱的侵蚀性能。如果能不断更新碱液的话，碱对城璃的侵蚀 可以随浓度和时间的增加而持续增加。 滠度黠侵蚀邃发戆影骟搬大，疆溶渡对滚翡经锤速嶷v 与湛度t ( 鼬戆关系 为 p i g v 一互虿蠡鬲+ e ( 1 4 ) 式中r 为气体豢数，e 为活识麓，c 菇鬻数，琶、c 睫玻璃种类有所不瓣。一般 来说，温度升高3 0 ，侵蚀遮腋可以提高1 0 倍。 浙江大学硕士学位论文 1 1 6 玻璃表面与氢氟酸的反应 h f 是玻璃蚀刻液的核心成分，它对玻璃的侵蚀作用比碱更为强烈。虽然 _ = s i - o - s i _ = 键很强，但它是极性的( s i s + - - - 8 0 ) 。反应中，亲核的f 攻击硅原子， 硅氧键断裂，同时矿与氧结合成稳定的硅羟基： i s i 一0 一h + h f _ - = s i f + h 2 0 - = s i 一0 一s i i + h f 一= - s i f + - = s i o h ( 1 5 ) ( 1 6 ) 所有的硅酸盐玻璃都能被氢氟酸侵蚀，生成氟化物和氟硅酸盐，侵蚀的速度取决 于氢氟酸的浓度和温度一j 。 氢氟酸蚀刻的玻璃表面，有许多小的凸起。这是因为氟化氢与玻璃作用的产 物中，除了n a f 、k f 和c a s i f 6 ，其它氟化物和氟硅酸盐均不溶于水或溶解度很 小，而这些不溶物会粘附于玻璃表面，阻碍氢氟酸进一步作用，造成玻璃表面的 不均匀侵蚀。 对于石英玻璃和硼硅玻璃，因为其化学组成，使用氢氟酸蚀刻时，不会或只 会产生极少量的盐类，所以蚀刻表面均匀光滑。但是氢氟酸对硼硅玻璃的蚀刻速 度很慢，大约只有钠钙玻璃的1 1 0 ，石英玻璃则速度更慢1 1 。所以这两种玻璃 的蚀刻往往采用不加稀释的高浓度氢氟酸。 1 2 玻璃微流控芯片通道加工技术 微流控分析芯片以微通道为网络，结合流体控制和检测功能元器件，在几平 方厘米的尺度范围内实现一种或几种分析功能。微通道的宽度和深度为微米级， 其加工方法源于微电子工业微机电加工( m e m s ) ，却又与集成电路芯片加工的微 细加工技术有所区别。 一光胶层一尸岬，匕皎层 基竹一e ：! ! ! ：= = i 一金属磺e ：兰= = 兰= = ! 一金属胰 a d f t v 璃：一半竺坐崔镒王j 勇端 基片一芒! = = ! ! ! ! ! ，一金属曩亡= = 二= = = ：二： “” 一e 兰虽缆三三三二： 。匕= = = = = = = j 一基片 图1 4 玻璃微流控芯片加工的主要步骤1 1 】 a 在干净的玻璃基片表面上镀上一层铬，再用甩胶机在铬层上均匀地 涂布一层光胶；b 将光刻掩模覆盖在基片上，用紫外光照射涂有光胶 的基片，光胶发生光化学反应：c 用显影的方法除去经曝光的光胶： d 采用化学腐蚀的方法在铬层上腐蚀出掩模上平面二维图形；e ，使 用适当的蚀刻剂在基片上蚀刻所需的通道；f 蚀刻结束后，除去光胶 和牺牲层：g 打孔后和玻璃盖片键合 4 浙江大学硕士学位论文 由于前述的性能优点，玻璃基片成为加工微流控芯片的基本材料，其加工技 术是微分析系统研究和发展的基本技术和前提条件。玻璃芯片的微加工技术很 多，但应用最普遍的是源于制作集成电路芯片所广泛使用的光刻( 1 i t h o g r a p h y ) 和 蚀刻( e t c h i n g ) 技术 1 2 l 。图1 4 概括了玻璃微流控芯片加工的主要步骤。 1 _ 2 1 光刻技术 1 2 1 1 光刻掩模 用光刻和蚀刻技术加工微流控芯片，必须先制备光刻掩模。光刻掩模的基本 功能是当光线照射其上时，图形区和非图形区对光线的透射能力不同。通过曝光 成像的原理，可将光刻掩模上的图形转移到基片表面的光胶层上。 对掩模有如下要求； 掩模的图形区和非图形区对光线的吸收或透射的反差要尽量大 十掩模的缺陷如针孔、断条、桥连、脏点和线条的凹凸等要尽量少 掩模的图形精度要高 通常的用于微电子行业的掩模材料有镀铬玻璃板或镀铬石英板，在它们表面 均匀地涂上一层对光敏感的光刻胶。用计算机制图软件绘制微流控芯片的设计图 形，再通过专用的接d 电路控制图形发生器进行光刻，可在掩模材料上得到所需 的图形。 用图形发生器加工的掩模，线宽和线距的精度能达到0 5u m ，可以满足微 流控分析芯片的加工要求。但由于图形发生器等专用设备价格昂贵，光刻掩横需 号业厂制造，加工费用高，加工周期长。 由于微流控芯片的分辨率远低于大规模集成电路的要求，普通实验室一般使 用简单的方法和设备制备掩模b 】，用微机通过c a d 软件将微结构的设计图转化 为图像文件后，用高分辨率的影像输出机将图像打印到印刷制版软片( f i l m ) 上， 可作为光刻用的掩模，基本能满足线宽和线距大于2 0 岬的微流控分析芯片对掩 漠口j 要求。 1 2 1 2 薄膜沉积 在加工微流控分析芯片时，需要在基片上沉积某些材料的薄膜作为牺牲层， 从而提高蚀刻时的选择性。玻璃基片上薄膜沉积的常用材料为铬、钛和金等，制 造加工薄膜的主要方法有蒸发( e v a p o r a t i o n ) 和溅射( s p u t t e r i n g ) ”1 。用溅射法制造 的薄膜均匀性好、可以覆盖有台阶的表面，内应力小，现已在很大程度上取代了 蒸发镀膜。 1 2 1 3 光刻 用光刻机曝光时常采用接触式曝光方式。接触式曝光是将掩模与待加工基片 浙江大学硕士学位论文 的光胶层直接接触进行曝光；掩模和基片通过机械装置压紧或通过真空吸住等方 法实现两者紧密接触。这种曝光方式的优点是设备简单、造价便宜、分辨率较高， 约1 - 2 岬。由于掩模与光胶层紧密接触，所以像差小，分辨率高。但是，这种 曝光方法的缺点是掩模与基片紧密接触，容易损坏掩模与光胶层。通常，一块掩 模只能用l o 次到2 0 次。过多地使用同一块掩模版会影响光刻的质量和成品率。 在光刻过程中，仔细地清洁基片表面是十分重要。基片表面的微量杂质会大、 大影响光刻的质量。 1 1 2 2 芯片蚀刻 在光刻过的基片上可通过蚀刻的方法将光胶层上的平面二维图形加工成具 有一定深度的立体结构。为了达到向下蚀刻的目的，首先利用未曝光的光刻胶的 保护作用，选用合适蚀刻剂，除去已曝光处的牺牲层，例如玻璃基片上的铬薄层 可以用硝酸铈铵和高氯酸的混合液除去。然后，再利用未曝光光刻胶和牺牲层共 同的保护作用，在基片主体上蚀刻一定深度的微结构。 在基片蚀刻时，蚀刻剂必须对牺牲层和被蚀刻的材料有足够的选择性。根据 所选蚀刻剂的不同，可分为湿法蚀刻( w e t e t c h i n g ) 和干法蚀刻( d r ye t c h i n g ) 0 4 1 。 虽然于法蚀刻加工的微结构可满足更高要求，但使用低压反应气体产生等离子 体，需用专f 1 的设备，其成本很高。所以用的最普遍的还是湿法蚀刻。 湿法蚀刻玻璃和石英时使用含氢氟酸的溶液。湿法蚀刻可以批量生产，一次 可加工多片，成本较低。 从所产生通道截面形状分类，蚀刻又可分为各向同性和各向异性二类。如果 蚀刻剂从基片表面开始向下腐蚀的速率与在其他各方向大至相同，这种蚀刻是各 向同性的。例如，含氨氟酸的溶液蚀刻玻璃和石英就是各向同性的：如果蚀刻荆 在某一方向的蚀刻速率远大于其它方向时是各向异性的，用氢氧化钠、氢氧化钾 等碱金属的氢氧化物或季铵碱蚀刻硅片时是各向异性。 用于硅片蚀刻的化学试剂既有各向同性的蚀刻剂，又有各向异性的蚀刻剂。 与硅片蚀刻不同，玻璃湿法蚀刻时，只有各向同性的含氢氟酸的蚀刻剂可用，如 h f h n 0 3 i i a 5 i ，h f n h 4 f 1 1 1 6 l 。因此，通道刻得越深，通道宽度也越大，r - - 壁 的不平行度增大，导致通道上宽下窄，例如，起始宽度w 为8 4 岫的通道，蚀 刻深度d 为5 5i x m 时，通道上部的宽为1 9 4u m 【1 7 1 ( 图1 5 ) 。这一现象限制了用 湿法在玻璃上蚀刻高深宽比的通道。 浙江大学硕士学位论文 图1 5 各向同性蚀刻通道横截面示意图和玻璃通道截面照片 玻璃芯片的蚀刻剂由硅片加工的二氧化硅蚀刻剂b o e ( b u f f e r e do x i d e 、 e t e h a n t ) 借鉴而来。b o e 为不同比例n 地f 缓冲的h f 溶液，通常有商品出售， 使用前加以适当稀释即可。由于b o e 是用来蚀刻二氧化硅的，用于蚀刻玻璃需 要加以适当调整。 国内外各研究小组蚀刻芯片采用的蚀刻剂有所不同，r a m s e y 小组1 3 , 1 6 , 1 8 1 使用 h f n h 4 f 蚀刻液在水浴中摇动蚀刻通道，材料包括载玻片、石英玻璃；h a r r i s o n 小组使用h f h n 0 3 在抛光片上蚀刻通道。m a t h i e s 小组研究了玻璃基片上 制备阵列毛细管电泳芯片的方法，指出缓冲的h f 对碱石灰玻璃有较高的蚀刻速 度，4 9 的h f 溶液在硼硅玻璃上可达到7p m m i n 蚀刻速度。汤扬华等【lo 】使用 h f h n 0 3 对p y r e x 和白冕玻璃进行了蚀刻实验，并指出h c i ：b o e ( 5 ：1 6 ) 蚀刻白冕 玻璃会得到粗糙的通道表面。 可以看出，湿法蚀刻加工微流控玻璃芯片，国内外各研究小组，均采用以 氟化氢为蚀刻液核心成分的工艺，但各小组方法有所不同。蚀刻液有两种： h f n h 4 f 和h f h n 0 3 ，基片则主要为钠钙玻璃和硼硅玻璃。 f a n i8 】在进行通道蚀刻时，发现不同的硼玻璃蚀刻质量差别较大，抛光的玻 璃蚀刻后通道边缘粗糙，退火后则可得到光滑的边缘( 图1 6 ) 。他认为退火可以 释放抛光带来的机械应力。 图1 6 同样的硼玻璃退火前( 左) 、后( 右) 的蚀刻结果 浙江大学硕十学位论文 1 2 3 不使用牺牲层的光刻、蚀刻技术 随着感光高分子材料的发展，出现了一些对玻璃蚀刻液耐受型较好的光胶， 薄膜沉积可以省去微流控芯片加工中的薄膜沉积步骤。z h a n g 2 0 】等使用s u 一8 作 保护光胶，对硼玻璃进行湿法蚀刻，得到1 0 0 哪以上的蚀刻深度( 图1 7 ) 。 图1 7s u 一8 作保护胶的硼玻璃湿法蚀刻 l i n 2 1 】等使用a z 4 6 2 0 正光胶对钠钙玻璃进行湿法蚀刻，对光胶采用了两级 后烘，先在1 2 0 下烘1 分钟，然后升温到1 4 5 下烘1 分钟，再恢复到1 2 0 下烘1 分钟。这样处理后光胶粘附良好，蚀刻深度3 6 岫( 图1 8 ) 。“n 的蚀刻 液采用6 ：1 的b o e ，每蚀刻5 分钟使用lm o l l 的盐酸冲洗通道1 0 秒，以除去 蚀刻中产生的不溶颗粒。 图1 8a z 4 6 2 0 作保护胶，蚀刻钠钙玻璃 1 2 4 非光刻蚀刻技术 r o d r i g u e z 等 2 2 1 提出了一种通过使用p d m s 模版紧压在玻璃表面，在其中的 通道里抽取h f 溶液快速制备玻璃芯片微结构的方法( 图1 9 ) 。 浙江大学硕士学位论文 图1 9 用p d m s 模版蚀刻玻璃芯片 12 5 键合 最简单的电渗流驱动的微流控芯片，也需要将刻有通道并加工好储液孔的基 片和盖片键合后才能使用。玻璃芯片实验室键合的方法有热键合和低温键合等。 1 25 1 热键合 含二氧化硅材料之间的热键合也称为硅熔键合。将贴合在一起的基片放在高 温炉中加热到5 0 0 1 0 0 0 。c 退火，界面上发生化学反应，使两块基片牢固地键合 在一起： s 卜o h h o s i + s i o s i + h 2 0 ( 1 7 ) 基片的洁净度和平整度是键合能否成功的关键。 玻璃和石英材质的微流控芯片一般使用热键合方法封合。将加工好的基片和 相同材质的盖片洗净烘干对齐紧贴后平放在高温炉中加热键合。玻璃芯片键合 时，高温炉升温速度为1 0 。c 分，在6 0 0 时保温3 5 小时，再以l o 分的速率 降温f 19 1 。石英玻璃芯片的键合温度高达1 0 0 0 。c 以上。末键合的区域会有明显的 干涉条纹。 热键合能否成功的关键是待键合的硅片、玻璃和石英片的洁净度和平整度。 在普通的化学实验室中，通过将洗净的基片和盖片在超纯水环境中直接贴合后再 键合，由于避免了空气中微粒对键合的影响，可大大提高芯片的键合质量和成品 率 1 3 】。h a r r i s o n 研究n t 2 3 1 使用专门的高压水冲洗器严格地清洗基片和盖片后使键 合温度大大降低。热键合的缺点是不能用于装有温度敏感试剂、电极和波导管的 芯片，也不能用于不同热膨胀系数材料的封接口”。 9 浙江大学硕士学位论文 1 - 2 5 3 低温键合 高温键合要使用箱式电阻炉进行温度程序控制，而且一般需要升温至 5 0 0 - - 6 0 0 c 。贾志舰等发展了低温键合的技术，使用普通烘箱即可完成玻璃芯 片的键合。 l - 3 溶液中分子扩散系数的测定 在溶液中，溶质分子存在扩散现象，其扩散系数d f 可由下式估算口6 】： d i = k t 6 m l n a f 1 8 1 式中t 为b o l t z m a r m 常数，r 为温度， 为溶液粘度，为a v o g a d r o s 数，a 为分 子体积。从此公式可以得到，温度越高，溶液粘度越低，分子体积越小，则扩散 系数越大。 ， 实际的分子扩散系数往往通过实验得到。测定分子扩散系数常用的的方法有 测定微孔膜两侧不同浓度溶液随时间浓度变化的膜池法、测定溶液浓度分布的光 干涉法、测定滞流流动溶液中溶质浓度分布的t a y l o r 分散法、极谱法、核磁共振 法和光散射法，其中t a y l o r 分散法在普通实验室即可实现，且操作简单快捷【2 ”。 t a y l o r 分散法【2 8 1 是将溶质( 或浓溶液) 注入到细长管中层流流动的溶剂中， 测量流动相中溶质的浓度分布，进而由t a y l o r 导出的计算公式计算扩散系数 d i = q n ( 2 4 ；r l )( 1 9 ) 式中口为分子扩散系数，q 为体积流速，为理论板数，为管长。t a y l o r 分散 法是基于抛物线流型的测定计算方法。 毛细管电泳的塞流和层流特性，可以避免样品分子扩散以外的分散，减小测 定扩散系数的误差。毛细管电泳测定分子扩散系数可以看作t a y l o r 分散法的改 进。毛细管电泳测定分子扩散系数的基本原理为： 通道中的溶质谱带由于扩散而增宽，根据e i n s t e i n 公式 2 9 1 ： 盯新2 d f ( 1 1 0 ) 式中d i 为溶质分子的扩散系数( c m 2 s ) ，t m 为保留时间( 8 ) 。 在谱带增宽的其它因素不变时，谱带总宽度随时间的变化即为扩散增宽 4 方刊叻矿= 2 d i ( t m 2 一k ( 1 11 ) 每个时间的谱带总宽度可由电泳谱图样品峰的半峰宽算出 研2 = ( w l a 1 2 3 5 5 ) 2( 1 1 2 ) 式中w l ，2 l 为长度单位的半峰宽( 厘米) 。 毛细管电泳应用较多的是测定d n a 分子的扩散系数2 9 - 3 i 】，实验方法有停流 法和改变场强法。 1 0 浙江大学硕士学位论文 停流法是在固定的场强下测定扩散系数的方法，当样品带迁移到通道的中间 位置时，撤去施加电压，经过一段时间后重新旌加电压，样品带经过检测点时得 到样品峰。通过停流时间长短得到不同的样品峰宽，计算扩散系数。如n k o d o p o 】 使用直径2 0 f a n 长6 0c i n 的毛细管在2 5 0 v e r a 场强下停流o 5 2 小时，测定7 5 b p 的d n a 片段的扩散系数。同时证明在此场强下不存在热扩散效应。s t e l l w a g e n t 3 1 1 使用涂覆的毛细管减小电渗流，通过对比停流1 5 0 m i n 和未停流的样品峰宽测定 了2 0 b p 低聚体的扩散系数( 图1 1 0 ) 。 。j “厂 “础 ：二、= ! 竺：竺； 。i 。ll 竺竺：二= = ：一 图1 1 0 停流( 下线) 和未停流( 上线) 的电泳图( 2 0 0v c m ) g i b s o n 和s e p a n i a k 2 9 】利用具有扫描检测功能的毛细管电泳仪测定了 1 3 5 3 b p d n a 分子的静态扩散系数( 图1 1 1 ) 。样品谱带停流在毛细管的某一位置 后，检测器以1 0c r n m i n 速率扫描样品谱带，间隔一段时间后再次扫描，从谱带 宽度的变化即可计算分子扩散系数。 一 “ 。0 函 ”2 一 图1 1 l 停流谱带的扫描谱图( a 0m i n , b 2 7m i n ，c 9 3 r a i n ) 改变场强法测定扩散系数时液流一直流动p ，它通过改变毛细管中施加的场 强改变样品迁移速度，得到不同样品迁移时间的样品峰宽。n k o d o l 3 0 j 同时应用此 方法在1 3v c m 场强下进行了测定。由于此法测定的是液体流动状态下的扩散 系数，结果略大于停流法的测定结果。 使用电泳芯片测定扩散系数与传统毛细管电泳测定扩散系数原理相同，一般 均采用改变场强法，测定分子量较小的样品嵋，3 2 ，”】。 h a r r i s o n 3 2 1 利用公式玩自俨2 d 批，改变分离电压，在6 5c m 距离检测。6 5 到：二y ，“- ：；分高场强范围内j ，t 。呈线洼，占直线斜率换算得到p i a 8 5 缓冲液 浙江大学硕士学位论文 中钙黄绿素的扩散系数2 4 , - t ：0 3 1 0 6 c m 2 s ，荧光素的扩散系数3 3 4 - 0 2 1 0 6 c l - f 1 2 s ， 与文献值相符。 在h a r r i s o n 的另一次实验中嫡1 ，以h 对施加电压的倒数作图( 图1 1 2 ) ，计 算得到荧光素的扩散系数4 5 4 - 0 2 x1 0 6 c m 2 s ，高于正常值。作者认为可能是通道 壁对样品产生作用造成的。 1 v 罅 图1 1 2 扳高与施加电压倒数的回归线 a l a r i e 和r a m s e y 3 3 1 在不同分离电压条件下测定了罗丹明b 的谱带总方差， 对保留时间作图( 图1 1 3 ) ，直线斜率的一半即为罗丹明b 的扩散系数( 4 5 1 0 6 c m ! s ) 。 o 0 4o 册0 , 1 z0 1 b w m e 扭j 图1 1 3 谱带总方差与保留时间的关系 ( 直线上的各数据点分离场强依次为4 0 0 、3 0 0 、2 0 0 、1 5 0 、1 0 0v c m 分离通道和分流通道的场强比e a 僵b ：t o ，1 8 ，0 3 3 ，a 0 4 6 ，e 0 5 4 ) 图1 1 3 的分离场强的改变是通过分离分流电压按比例变化得到的，由此得 到的谱带总方差与保留时间的回归线呈线性且斜率相等。因此作者认为十字通道 分流进样的进样量( 表现为直线截距) 仅由分离通道和分流通道的场强比( 分流 比) 决定；在同样分流比下，不同分离场强( 表现为样品保留时间) 进样量相等。 ej皇li 薯3uc旦 浙江大学硕士学位论文 1 4 芯片毛细管电泳的分离效率和谱带增宽 与传统毛细管电泳一样，芯片毛细管电泳的分离效率的表示方法也来自色谱 理论。表示形式有三种，理论板数n ( 无量纲) ，理论板高h ( p m 或c m ) 和谱 带宽度的方差0 - 2 ( c m 2 ) 。其中，n 越大、h 和a 2 越小，系统的分离效率越高。 三者之间可以相互换算，根据g i d d i n g s 方程，理论板数 n 三l 2 泞 n 1 3 ) 式中，l 为迁移距离( 对于十字通道芯片，即为十字口到检测点的距离，c m ) 。 理论板高 h = l i n = 孑| l n i 4 ) 前人文献中对以上三种分离效率的表示形式均有使用。由于谱带宽度方差a 2 可直接表达样品谱带增宽的程度，本文中较多的使用这一形式。为了与引用文献 的表示形式一致，引用文献时对一和n 、h 进行了公式形式的转换。 1 4 1 毛细管电泳谱带增宽的基本规律 毛细管电泳中引起谱带增宽的因素很多，从实验观点，最大分离效率限制来 源于谱带增宽三个不可避免的主要因素【3 4 1 吖。a d j + 巩彳+ o d e t ( 1 1 5 ) 式中，o t 2 为谱带总方差，右边各项依次表示分子纵向扩散、进样、检测所引起 的谱带增宽。 如果仅考虑这三个谱带增宽因素以及它们最简单的形式，可以得到电泳中谱 带增宽的一些基本规律。 对于扩散增宽，根据e i n s t e i n 公式： = 2 d i t t o( i 1 6 ) 背由d ：南檄鼎辞子的扩势系数c m 27 s 、，t i l l 为牲戛；乏移时间71 、 样品迁移时间t 。由迁移距离l 、场强e ( v c m ，迁移距离l 上的压降v 。) 和 t 一。”j - n 1 i 千h 日j - 西1 唰倪肛f 伏a t _ t m = l 胁e = l 忸f k ( 1 1 7 ) 进样增宽与样品塞长度( w q ) 和初始形状有关【3 2 l 。对于矩形样品塞，谱带长 度引起的增宽为 d 毒= l i 0 i 2 同样，检测带来的谱带宽度与检测窗口宽度的关系为 叮蛔= l 抽2 ( 1 1 8 ) ( 1 1 9 ) 浙江大学硕士学位论文 在分离过程中， 由式1 1 4 - 1 1 9 ， 进样和检测带来的增宽不再改变，可用a 。d 2 表示它们的和 i = + ，( 1 2 0 ) 谱带总方差砰可写为 疗= 2 d 正以毋( 1 2 1 ) 式1 2 1 表明：分子扩散系数较大的样品谱带增宽程度较大：谱带宽度随迁移距离 增加，施加高分离场强可以减少谱带增宽程度。在使用高场强、短分离长度高速、 分离时，扩散增宽影响较小。此时，谱带总方差a t 2 的最小值受到进样和检测带 来的增宽限制。 结合式1 1 3 和1 1 4 ，理论板数n 和理论板高h 的计算公式分别为 j v 鼍l 2 ( 2 d 正亿e + d )( 1 2 2 ) 肛2 d ，, 届十t i d g l( 1 2 3 ) 从e f f e n h a u s e r r 3 4 l 和j a c o b s o n 3 1 绘制的芯片毛细管电泳理论板数n 和迁移距离 l 的关系图( 图1 1 4 ) 可以看出分离距离对分离效率的影响。 3 o 2 5 0 o o o 1 s 0 0 d o 01 03 0柏8 0 l t m 删 图1 1 4 理论板数n 和迁移距离l 的关系 图1 1 4 左为根据g i n f i t c 的d 和“，数据在场强1 0 6 0 v e m 绘制，线1 假设 进样和检测增宽降为0 ，分子扩散是谱带增宽的唯一来源，则劫i e l 2 d i ，板数 随迁移距离线性增长；线2 考虑了进样和检测带来的增宽，样品分离距离越短， 对分离效率的影响越大。 图1 1 4 右为罗丹明b ( 圆点，上) 和磺基罗丹明( 方点) 1 7 0 v c m 场强下 分离的理论板数n 和迁移距离l 的关系，罗丹明b 迁移速度较快，可以获得较 高的理论板数。 由场强和板高曲线口4 】( 图1 1 5 ) 可以看出，随着分离场强增加，板高迅速下 降，随后斜率逐渐减小，趋近至一个定值。分离场强的提高使样品迁移速度加快， 扩散程度减小，分离效率提高。随扩散增宽的贡献减少，进样和检测宽度成为谱 带宽度主要因素，成为板高的下限。 1 4 l*t。ltt 浙江大学硕士学位论文 童 量 l 图1 1 5 分离场强与板高的关系( g l n - f i t c ，l = 2 4c m ) 上面对芯片毛细管电泳谱带增宽的分析中，仅考虑了分子纵向扩散、进样、 检测三个谱带增宽基本因素以及它们最简单的形式，下面对芯片电泳中的其它增 宽因素进行逐一讨论。 1 42 焦耳热效应导致的谱带增宽 提高分离场强可以缩短样品迁移时间，从而减少分子扩散导致的谱带增宽。 在焦耳热可以忽略的条件下，通道内的电流、样品迁移速度与理论