（发酵工程专业论文）聚β羟基丁酸酯对苏云金芽胞杆菌菌体生长特性和抗逆性的影响.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 奄 如需保密，解密时间年月b 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究x - 作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我- n 工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：予遣 时间：2 7 年6 月l ? 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位敝储张了磋导师懿眵淳 签名日期：0 7 年6 月i 弓日签名日期：a 9 d 7 年2 月f 仁日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 摘要 本课题利用苏云金芽胞杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) b m b l 7 1 及其聚- b 羟基丁酸酯( p o l y 3 h y d r o x y b u t y r a t e ，简称p h b ) 合成基因簇( p h a r b c ) 强化菌株 b m b l 7 1 + p 和p h b 合成酶基因( p h a c ) 阻断突变株b m b l 7 1 p 为研究对象，以研 究胞内p h b 对研营养细胞生理功能为目的，比较了三类菌株发酵过程特征，研究 了三类菌株对逆环境抗性的影响( 包括耐热、耐寒冷、抗紫外和耐饥饿和在不同p h 值、不同渗透压、不同有机溶剂浓度的培养基中的生长能力) ，并对其中营养细胞耐 热能力进行了热灭死动力学分析。本研究首次系统的研究了p h b 对苏云金芽胞杆菌 营养细胞生长特性和抗逆性的影响，并从工程学角度阐明了其中的耐热机制，为进 一步研究p i - i b 的生物学功能奠定了基础。 通过研究b m b l 7 1 、b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 - p 三类菌株发酵过程特征，表明( 1 ) 研中p h b 的合成是与菌体的生长相偶联的，处于对数生长期的b m b l 7 1 + p 和 b m b l 7 1 菌株菌体明显比b m b l 7 1 p 粗壮；( 2 ) b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 菌株到达对 数生长期末期时胞内p h b 的量达到最大，分别为1 2 4 8m g m l 和0 8 4 4m g m l ，前 者p h b 最大产量比后者提高了5 0 ，b m b l 7 1 p 菌株在发酵过程中不能生成p h b ； ( 3 ) p h b 的存在与否对m 菌株生长过程中的碳源消耗和有机酸代谢等都有着一定 的影响；( 4 ) b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株能正常形成芽胞，b m b l 7 1 - p 菌株在发酵 后期也不能正常生成芽胞，菌体有自溶现象。 通过菌株营养细胞对环境抗逆性试验，首次考察了胞内p h b 对苏云金芽胞杆菌 营养细胞在逆环境中的生理作用，( 1 ) 比较b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 和b m b l 7 1 p 三 菌株受热死亡特征值d g o 值，发现三菌株的耐热能力强弱为：b m b l 7 1 + p b m b l 7 1 b m b l 7 1 p ；( 2 ) b m b l 7 1 - p 胞内不积累p h b ，菌体极易受低温处理致死，存活 率仅为0 9 3 ；b m b l 7 1 + p 胞内大量积累p h b ，菌体抗冻能力较b m b l 7 1 略有提高， 存活率分别为1 5 9 1 和1 4 9 3 ；( 3 ) b m b l 7 1 - p 菌株菌体极易受紫外辐照致死； b m b l 7 1 + p 菌株和b m b l 7 1 菌株抗紫外能力较强，不论在哪个照射时间，b m b l 7 1 - p 菌株菌体存活率都要明显低于b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株；( 4 ) b m b l 7 1 - p 菌株胞 内不积累p h b ，菌体极易因缺乏营养致死；b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株胞内大量 积累p h b ，菌体抗饥饿能力明显强于b m b l 7 1 - p 菌株，且b m b l 7 1 p 菌体后期出现 自溶现象。 本研究考察了b m b l 7 1 、b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 p 菌株在不同p h 值、不同渗 透压、不同有机溶剂浓度的培养基中生长能力差别，分析了p h b 合成对菌体生长能 力的影响，结果表明：每一种菌株的生长能力都随着环境的恶劣程度而降低，且 b m b l 7 1 和b m b l 7 1 + p 菌株降低的程度差不多，但都比b m b l 7 1 p 菌株生长能力的 降低程度要小得多，这说明能够产生p h b 的菌株比不能产生p h b 的菌株更能适应 环境的改变。 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 从工程学角度阐明了b m b l 7 1 及其p h b 合成增强和缺失菌株营养细胞菌体活 化能厶e 的热灭死动力学。通过分析b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 和b m b l 7 1 一p 菌株在不 同温度下的比热死速率常数k 值和三类菌的活化能e ，结果表明：在同一处理温度 下，七b 地1 7 l + p k b m b l 7 1 b m b l 7 1 - p ；( 2 ) p u tt h r e es t r a i n sv e g e t a t i v ec e l l sa t - 2 0 6c f o rf i v ed a y s ，t h es u r v i v a lr a t eo fs t r a i nb m b l 7 1 + pv e g e t a t i v ec e l l sw e r e1 5 9 1 ；s t r a i n b m b l 7 1v e g e t a t i v ec e l l sw e r e1 4 9 3 ：b u ts t r a i nb m b l 7 1 一pv e g e t a t i v ec e l l sw e r eo n l y 0 9 3 ；( 3 ) t h ea b i l i t i e so fa n t i - u l t r a v i o l e to fb m b l 7 1 + pa n db m b l 7 1w e r eh i g h e rt h a n b m b l 7 1 - p ；( 4 ) b m b l 7 1 + pa n db m b l 7 1h a db i g g e rs t r e s st o l e r a n c et oh u n g e r , b u t b m b l 7 1 一ph a dc e l la u t o l y s i s t h i ss t u d yf i r s ti n v e s t i g a t et h eg r o w t hc u r v eo fb m b l 7 1 、b m b l 7 1 + pa n db m b l 7 1 - p s t r a i n sb yi n o c u l a t e di nt h ed i f f e r e n tp hm e d i u m s ，o s m o t i cp r e s s u r em e d i u m s , d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fo r g a n i cs o l v e n tm e d i u m s ，d i s c u s si n f l u e n c eo fg r o w t hc a p a b i l i t i e so ft h e t h r e ek i n ds t r a i n sr e l a t e dt op h b t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t et h a t ：t h eg r o w t h 3 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 a b i l i t yo fe a c hs t r a i nw a sd e c r e a s e dw i t ht h ed e g r e eo fa d v e r s ec o n d i t i o n s ，t h ed e g r e eo f b m b l 7 1 + pa n db m b l 7 1s t r a i n sr e d u c e da l m o s t ，b u tt h ed e g r e eo fb m b l 7 1 0 ps t r a i n r e d u c e dm u c hm o r et l l a no t h e r s i tp r o v e dt h a tt h es t r a i n sp r o d u c e dp h bw e r em o r ea d a p t t ot h ee n v i r o n m e n t a lc h a n g e st h a nt h a tn op h bs t r a i n s s e l e c to n eo ft h es t r e s st o l e r a n c e - - h e a tr e s i s t a n c e ，t h i sr e s e a r c hf i r s te l u c i d a t e t h e r m a ld y n a m i c so ft h et h r e ek i n ds t r a i n ss t r e s s i n ge n g i n e e r i n gc e n t e r e d b ya n a l y z i n g t h eh e a td e a t hr a t ec o n s t a n tkv a l u e sa n dt h ea c t i v a t ee n e r g y 厶eo fb m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 a n db m b l 7 1 ps t r a i n s ，t h er e s u l t ss h o w ：a tt h es a m et e m p e r a t u r e ，h m b l 7 1 + d j b m b l 7 l b m b l 7 1 - p 。处理温度为 4 5 和5 0 时，b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 菌体的d g o 值( 分别为3 2 5r a i n 、1 1 5m i l l 和2 5m i l l 、9 5m i n ) 远大于b m b l 7 1 p 菌体的d g o 值( 1 2m i l l 、6m i n ) ，较高温度 ( 5 5 、6 0 ) 时，三种菌的d g o 值区别不如较低温度时明显。菌体耐热性与受热 菌体胞内p i - i b 有无以及浓度高低有关系，p h a c 基因受阻断，胞内不积累p h b ，菌 体易受热致死；增加p h a r b c 基因簇拷贝数，胞内大量积累p h b ，菌体耐热性增强。 3 3 1 2p i i b 对营养细胞抗冻能力的影响 由表3 1 可见，将三种茵的菌体在2 0 c 下放置5 天后，b m b l 7 1 + p 的菌体还有 1 0 8 c f u m l 存活，存活率为1 5 9 1 ；b m b l 7 1 菌体也有1 0 8 c f u m l 存活，存活率 为1 4 9 3 ；而b m b l 7 1 - p 菌体的活菌数降为1 0 7c f u m l ，存活率仅为0 9 3 。结 果表明，肋口c 基因受阻断，胞内不积累p h b ，菌体极易受低温处理致死；增加肋4 r 8 c 巾 匮 m 豳 一 虹 日 l m 疆 一 虹邮蠹蕾 m 鏖 b，lk 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 基因簇拷贝数，胞内大量积累p h b ，菌体抗冻能力略有提高。 表3 1 三类菌株营养细胞冷冻耐受存活率 t i a b i e 3 1t h es u r v i v a ir a t i oo f v e g e t a t i v ec e l l so f t h r e ek i n ds l r a l n sa t 恤ee n do f t h e l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s et r e a t e db yf r o z e n 处理 b m b l 7 1 + p b m b l 7 1 b m b l 7 1 - p 菌落数存活率菌落数存活率菌落数存活率 n u m b e ro fs u r v i v a ln u m b e ro fs m v i v a ln u m b e ro f s u r v i v a l c o l o n y r a t i o c o l o n y r a t i o c o l o n y r a t i o 对照8 8 x l 矿1 0 0 1 3 4 1 0 s1 0 0 4 7 1 0 s1 0 0 5 d 后1 4 x 1 0 s1 5 9 1 2 0 x 1 0 81 4 9 3 6 0 1 0 70 9 3 3 3 1 3p i - i b 对营养细胞抗紫外能力的影响 三类菌株对紫外的耐受性见图3 2 ，照射4 0s 时，b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 i 菌体 存活率分别为8 2 1 8 和7 2 6 7 ，而b m b l 7 1 - p 菌株菌体存活率只有4 1 2 。照射 8 0s 后，b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 茵体存活率基本相同，照射1 6 0s 后活菌数为1 d 7 c f u m l ，b m b l 7 1 - p 菌体存活率在照射6 0s 时就降为0 9 1 ，照射1 6 0s 后活菌 数降为1 0 5c f u m l 。以上结果表明，p h a c 基因受阻断，胞内不积累p h b ，菌体极 易受紫外辐照致死；增加p h a r b c 基因簇拷贝数，胞内大量积累p h b ，菌体抗紫外 能力略有提高。 孽1 0 0 巷 ：薹： 篓 2 0 性 o 05 01 0 01 5 02 0 0 照射时间t r e a t m e n tt i m e ( s ) 图3 2 b m b l 7 1 及其p h b 基因强化和缺失菌株菌体在紫外下照射不同时间的存活率 f i g3 2t h e s u r v i v a lr a t i oo ft h r e ek i n dv e g e t a t i v ec e l l st r e a t e db yd i f f e r e n tt i m e s 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 3 3 1 4p h i l 对营养细胞耐饥饿能力的影响 由图3 3 可知，耐饥饿试验处理1 天后b m b l 7 1 的存活率为2 2 4 ，b m b l 7 1 + p 的存活率为2 5 ，b m b l 7 1 - p 的存活率为0 8 2 ；2 天后分别为2 0 9 、2 3 9 和0 2 0 ， 其中，b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株的活菌数仍为1 0 8c f u m l ，而b m b l 7 1 p 菌株 的活菌数降为1 0 7c f u m l ，且b m b l 7 1 p 茵体出现自溶现象。以上结果表明，p h a c 基因受阻断，胞内不积累p h b ，菌体极易因缺乏营养致死：增加p h a r b c 基因簇拷 贝数，胞内大量积累p h b ，菌体抗饥饿能力略有提高。 ，、3 0 琶2 5 巷2 0 童1 5 毒1 0 逛5 0 1 d2 d 处理时间t r e a t m e n tt i m e ( d a y ) 图3 3b m b l 7 1 及其p i t b 基因强化和缺失菌株菌体耐饥饿存活率 f i g 3 3 t h es u r v i v a lr a t i oo fv e g e t a t i v ec e l l so ft h r e ek i n ds t r a i n sa tt h ee n do ft h e l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s eb ys t a r v a t i o n 3 3 2p h b 对三类菌株营养细胞在逆环境中生长的影响 3 3 2 1 在不同n a c i 浓度中p i - i b 合成对营养细胞生长的影响 苏云金芽胞杆菌b m b l 7 1 及其p h b 基因强化和缺失菌株在不同n a c l 浓度环境 中生物量随时间的增长如图3 4 。对每一种菌株而言，培养基中n a a 浓度的增加都 会使菌株在培养基中的生长能力明显减弱，对数生长期细胞最大比生长速率j 减 少，到达稳定期时的最大生物量也明显不如对照( 含1 n a c l ) ，但培养基中盐浓度 的增加没有影响菌株进入稳定期的时间。 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 0 h2 h| h馥虢1 0 h曲2 h4 h曲虢l 强 t n n e o a ) 势o n a ( = l t e n e ( h 、7 n a c i 图3 4 在不同n a c ! 浓度三类菌株的生长 f i g u r e3 4e f f e c t o fc o n c e n t r a t i o no fn a c is o l u t i o no nc e l lg r o w t ho ft h et h r e es t r a i n s 对苏云金芽胞杆菌b m b l 7 1 及其p h b 基因强化和缺失菌株在不同n a c i 浓度环 境中的生物量进行纵向比较可以看到，在相同的n a c l 浓度培养基中，b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株的生物量相差无几，且随着n a c l 浓度的增加越是接近，同时都比 同条件下的b m b l 7 1 - p 菌株的生物量多出许多，且随着n a a 浓度的增加差距也逐 渐拉大。这说明随着培养基中随着n a c l 浓度的增加b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 和 b m b l 7 1 - p 菌株的生长能力都会减弱，但能在生长过程中合成p h b 的b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株生长能力减弱的程度远远不及不能合成p h b 的b m b l 7 1 - p 菌株生 长能力被削弱的程度，但当培养基中n a c l 浓度高出某一特定值后( 如图7 n a c i ) ， b m b l 7 1 及其p i - i b 基因强化和缺失菌株都很难在这种环境中生长生存。 三类菌株在不同n a c l 浓度培养基中生长时，b m b l 7 1 + p 菌株的最大比生长速 率。由对照培养基中的1 1 lh 1 随着n a c l 浓度的增加下降至含有5 n a c l 浓度的培 养基中的0 8 3h 1 ，下降了2 4 5 ，b m b l 7 1 菌株下降了”，而同样培养条件下的 b m b l 7 1 - p 菌株的最大比生长速率由对照时的0 9 31 1 - 1 下降到含有5 n a c l 浓度 的培养基中的o 4 8h ，下降了4 8 2 ( 见表3 2 ) 。 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 3 3 2 2 在不同p h 值中p h b 合成对营养细胞生长的影响 苏云金芽胞杆菌b m b l 7 1 及其p h b 基因强化和缺失菌株在不同p h 值环境中生 物量随时间的增长如图3 5 。对每一种菌株而言，由于对照的p h 值为7 0 ，因此细 胞在p h 值为6 8 的缓冲环境中的最大比生长速率舳最接近对照，其次是在p h 值 为7 8 的缓冲环境中，最大比生长速率。最小是在p h 值为5 8 的缓冲环境中，且 进入稳定期的时间提前了约2 h 。上述说明，相对于中性和偏碱性环境中，b m b l 7 1 + p 、 b m b l 7 1 和b m b l 7 1 - p 菌株更不适宜在偏酸性环境中生长。 2 g 0 i l盐4 h 强 8 h 1 0 h o h2 h| h馥曲l 强 o h盐4h矾铀1 0 h o h盐4h日l曲1 0 h t 功枷删8t m , e ( h ) 艘8 图3 5 在不同p h 值中三类菌株的生长 f i g u r e3 4 5e f f e c to fp hv a l u e so fm e d i ao nc e l lg r o w t ho ft h et h r e es t r a i n s 相对于对照而言，在缓冲体系中，生物量变化的程度依次为b m b l 7 1 + p b m b l 7 1 b m b l 7 1 p 。处理温 度为4 5 和5 0 c 时，b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 菌体的d g o 值( 分别为3 2 5 m i n 、1 1 5r a i n 和2 5m i l l 、9 5m i l l ) 远大于b m b l 7 1 p 菌体的d g o 值( 1 2m i n 、6r a i n ) ，较高温度 ( 5 5 、6 0 ) 时，三种菌的i ) 9 0 值区别不如较低温度时明显。 同时将三种菌的菌体在2 0 。c 下放置5 天后，稀释平板计数计算存活率。结果表 明：三种菌的营养细胞在2 0 下放置5 天后，b m b l 7 1 + p 的菌体存活率为1 5 9 1 ； b m b l 7 1 菌体存活率为1 4 9 3 ；而b m b l 7 1 p 菌体存活率仅为0 9 3 。p h a c 基因 受阻断，胞内不积累p i - i b ，菌体极易受低温处理致死；增加p h a r b c 基因簇拷贝数， 胞内大量积累p i - i b ，菌体抗冻能力略有提高。 在研究菌体对紫外的抗性时发现：照射4 0 s 时，b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌体存 活率分别为8 2 1 8 和7 2 6 7 ，而b m b l 7 1 p 菌株菌体存活率只有4 1 2 。加口c 基 因受阻断，胞内不积累p h b ，菌体极易受紫外辐照致死；增加p h a r b c 基因簇拷贝 数，胞内大量积累p i - i b ，菌体抗紫外能力略有提高。 同时研究三种菌体对饥饿的耐受性时发现：1 天后b m b l 7 1 的存活率为2 2 4 ， b m b l 7 1 + p 的存活率为2 5 ，b m b l 7 1 - p 的存活率为o 8 2 ；2 天后分别为2 0 9 、 2 3 9 和0 2 0 ，且b m b l 7 1 - p 菌体出现自溶现象。以上结果表明，p h a c 基因受阻 断，胞内不积累p i - i b ，菌体极易因缺乏营养致死；增加p h a r b c 基因簇拷贝数，胞 内大量积累p h b ，菌体抗饥饿能力略有提高。 另外，本课题还研究了三种菌在不同p h 值、不同渗透压、不同有机溶剂浓度 培养基中的生长能力的差别，结果发现：在这些逆环境中，每一株的生长能力都会 减弱，但能在生长过程中合成p h b 的b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株生长能力减弱的 程度远远不及不能合成p i - i b 的b m b l 7 1 - p 菌株生长能力被削弱的程度，这说明能合 成p i i b 的菌体的生长能力受外界变化的影响小于不能合成p h b 的菌体，即胞内p i i b 能更好的维持细胞在不同环境中的生长能力，且与胞内p h b 合成能力的大小有一定 关系，但非线性关系。 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 第四章b m b l 7 1 及其咖合成增强和缺失菌株营养细胞的 热灭死动力学分析 4 1 引言 实验证明，微生物营养细胞的均相热灭死动力学符合化学反应的一级反应动力 学( 伦世仪，2 0 0 4 ) 。在食品行业中，衡量某种污染菌的耐热力，是以一定温度下的 d 值来表示，即在恒定的标准温度下，每杀死9 0 的该种微生物所需要的时间。在 同一致死温度下，d 值越大，耐热力越强。如嗜热脂肪芽孢杆菌d 1 2 1 = 4 0 5 0m i n 嗜温梭状芽孢杆菌d 1 0 0 - - - 0 1 0 - 0 5 0 m i n 。所以了解细菌的耐热特性，从而选择正 确的热处理参数，对食品中污染菌的杀灭是很重要的。由于菌体中p h i l 能增强菌体 对不利环境的抗性，而在食品中有许多杂菌甚至是致病菌都能产生p h b ，如恶臭假 单胞菌( p p u t i d a ) 、扭脱原单胞菌( p r o t o m o n a s e c t o r g u e n s ) 等( l e e e t a l ，2 0 0 2 ) ，因 此在灭菌工艺中，需要考察茵体营养细胞的比死亡速率常数k 值和细胞的活化能厶e 值，从而设计合理有效的灭菌模式。 苏云金芽胞杆菌作为应用最广泛的细菌生物农药之一，在田间使用时同样会受 到热的影响，它胞内的p h b 能使营养细胞增强对热的耐受性，所以我们有必要从理 论上量化菌体中p h b 对菌体耐热性的影响并分析其增强菌体耐热性的原因；同时， 苏云金芽胞杆菌是蜡状芽胞群的一员，还包括炭疽芽胞杆菌( b a c i l l u sa n t h r a c i s ) 和 蜡状芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) ，这三种菌种均能产生毒素，其中炭疽芽胞杆菌对人 类的危害最大，由于它们有同源之处，可借由通过分析苏云金芽胞杆菌的耐热参数 比死亡速率常数k 值和细胞的活化能e 值，了解其他两种同源菌的耐热性能，并 分析胞内p i - b 的存在与否会对菌株的耐热参数带来怎样的影响? 本研究首次考察了苏云金芽胞杆菌b m b l 7 1 及其p h b 增强菌株和p h b 缺失菌 株营养细胞的耐热参数：比死亡速率常数k 值和细胞的活化能e 值，分析了胞内 p h b 对耐热参数的影响。 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 4 2 材料和方法 4 2 1 菌种 苏云金芽胞杆菌无质粒突变株b m b l 7 1 ( 且t h u r i n g i e n s i ss u b s p k u r s t a k i b m b l 7 1 ) ；苏云金芽胞杆菌工程菌株b m b l 7 1 + p ，来源于b m b l 7 1 ，通过转入带 有p h b 合成基因簇( p h a r b c ) 的质粒载体p h t 3 0 4 ，构建成p h b 高产突变株；苏 云金芽胞杆菌工程菌株b m b l 7 1 - p ，来源于b m b l 7 1 ，通过与带有p h b 合成基因部 分同源片段的质粒p e g 4 9 1 进行同源重组，阻断p h b 合成酶基因p h a c ，得到p h b 合成缺失突变株。所有菌株均由本实验室构建并保存。 4 2 2 培养基 斜面培养基为l b 固体培养基( g l ) ：蛋白胨1 0 0 ，酵母浸出物5 0 ，n a c i1 0 0 ， 琼脂1 5 0 ，消前p n7 o 7 2 ，1 2 1 ，3 0m i n 灭菌。 种子培养基为l b 液体培养基( g l ) ：蛋白胨1 0 0 ，酵母浸出物5 0 ，n a c l1 0 0 ， 消前p h7 0 7 2 ，1 2 1 ，3 0m i l l 灭菌。 发酵培养基配方( g l ) ：蛋白胨1 0 ，葡萄糖5 ，酵母抽提物2 ，k i t 2 p 0 41 ， m g s 0 4 7 f 1 2 00 3 ，f e s 0 4 7 i - 1 2 00 0 2 ，z n s 0 4 。7 h 2 00 0 2 ，m n s 0 4 i - i 2 00 0 2 ，消前p h 7 2 - 7 5 ，1 1 5 ，2 0 r a i n 灭菌。 4 2 3 方法 4 2 3 1 热灭死动力学分析试验方法 用无菌定量管装入4 5m l 无菌水，每种菌4 管。先将电热恒温水浴锅调整至实 验温度( 分别为4 5 、5 0 、5 5 、6 0 ) ，将装有4 5m l 无菌水的定量管放入水 浴锅中预热，同时准备一只试管将温度计插入试管中测温，待温度稳定后，吸取o 5 m l 对数期末期的菌体发酵液快速打入定量管中并开始分别加热2m l n 、6m i n 、1 0 m i l l 、1 5n f i n ，加热结束后迅速将定量管放入冷水中冷却。 4 2 3 2 热灭死动力学分析计算方法 见1 5 2 和1 5 3 。 4 2 3 3 生物量测定：稀释平板记数法。 华中农业大学2 1 ) 0 7 年硕士生毕业论文 4 3 结果与分析 4 3 1 在不同温度下b m b l 7 1 及其p h b 合成增强和缺失菌株营养细胞的 比热死速率常数露 a b 图4 1 三类菌株营养细胞在不同温度下残菌数和初始菌数比值的对数和t 的关系 f i g u r e4 1 鼬i a 廿蛐s h j p 。fl n 篙wfo f t h et h r e ek i n dv 曙e t a 蜥e 船u n d 盯 d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ( a ) b m b l 7 1 + p ( b ) b m b l 7 1 ( c ) b m b l 7 1 - p o j o d 4 4 4 4 4 m j n b zi o 4 o d 4 4 4 4 4 4 m n n “” 一雹zi o 4 4 邶 啦 刖 舶 船 珊 霉乞z百一 c 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 根据一级反应动力学方程一l n 丝，以l n 粤对f 作图，如图所示。直 n i t 【，- - a 41vo 线的斜率在数值上等于死亡速率常数k ，它的绝对值( 见表4 1 ) 反应了微生物耐热 性的强弱，k 值越小，表明微生物越不容易被热死，反之，越易热死。 根据趋势线的方程可以计算出d g o 值( 在一定温度条件下，杀死9 0 的菌体所 需要的时间) ( 见表4 1 ) 。 表4 1 在不同温度下三类菌株营养细胞的k 值，回归线的方差，和d 值 t a b l e4 1t h er 2v a l u e sa n dc o e f f i c i e n t so fi n a c t i v a t i o n ( k ) o b t a i n e df o r mt h e p l o t so fs u r v i v i n gc e l ln u m b e r ( i nn n o ) v st r e a t m e n tt i m e s ，t h ec o r r e s p o n d i n g d - v a l u e sc a l c u l a t e du s i n gt h ee q u a t i o nd = 2 3 0 3f 1f o rm et h r e eb a c i l l u s t h u r i n g i e n s i ss t r a i n sa t4 5 c 、5 0 、5 5 a n d6 0 由图可知，通过比较同一温度下b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 和b m b l 7 1 - p 菌株的比 热死速率常数k 值可知，拓蛐1 7 1 + p b 1 7 1 0 9 5 说明苏云金芽胞杆菌营养细胞的热灭死动力学确实符 合一级动力学方程。而若微生物受热死亡符合一级动力学方程，则说明细胞在被有 效杀灭前不存在中间状态，加热介质中也不存在任何耐热成分起保护作用( b o l l o ne t a l ，2 0 0 3 ) ，细胞不成团，没有热激蛋白产生( p a g a n e t a l ，1 9 9 7 ；h u t c h i s o n , 2 0 0 5 ) ，也 不存在具有更强耐热性的亚群体( m u r p h y e t a l ，1 9 9 9 ；p e l e g , 1 9 9 8 ) 。 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 4 3 2p h b 对b m b l 7 1 及其p h b 合成增强和缺失菌株营养细胞茵体活化 能厶e 的影响 微生物死亡速率常数七与加热温度t 之间的关系可用阿累尼乌斯( a r r h e n i u s ) 公式表达，按i n k 一1 厂r 作图，从直线的斜率可以求出a e ( 见图4 2 ) 0 5 0 0 o 5 。1 o 耋1 s 2 0 - 2 5 ，- 3 0 00 0 3 0 000 0 3 0 20 0 0 3 0 4 0 0 0 3 0 60 0 0 3 0 80 0 0 3 1 0 0 0 0 3 1 200 0 3 1 40 0 0 3 1 6 i t ( t k ) 图4 2 三类菌株营养细胞的热灭死动力学曲线 f i g u r e4 2k i n e t i c so f t h et h e r m a li n a c t i v a t i o no f t h e t h r e ek i n dv e g e t a t i v ec e l l s 由图可知，b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 和b m b l 7 1 - p 菌株对数生长末期营养细胞的 活化能e 值分别为1 4 0 3 、1 3 1 1 和1 0 8 3k j m o l ，r 2 均大于o 9 1 ，厶e 值的大小表 明微生物死亡速率随温度的变化越敏感，反之不敏感。因此杀死b m b l 7 1 + p 和 b m b l 7 1 菌株营养细胞需要更高的温度或更长的时间，从工程学角度上讲是因为能 产生p h b 的菌株其含有p i - i b 颗粒的菌体本身的活化能也更大厶eb m b l 7 l 。 z 3 e b m b l 7 1 z 3 e b 岫1 7 1 o ，三类菌株营养细胞的活化能差别显著。 华中农业大学2 0 0 7 年硕士生毕业论文 4 4 小结 本研究首次考察了苏云金芽胞杆菌b m b l 7 1 及其p h b 增强菌株和p i - i b 缺失菌 株营养细胞的耐热参数：比死亡速率常数k 值和细胞的活化能e 值，分析了胞内 p i - i b 对耐热参数的影响。 以苏云金芽胞杆菌b m b l 7 1 及其p i - i b 增强菌株b m b l 7 1 + p 和p i - i b 缺失菌株 b m b l 7 1 - p 的对数末期的营养细胞为研究对象，在四种温度( 4 5 、5 0 。c 、5 5 、 6 0 ) 对细胞加热处理四个时间( 2 r a i n 、6 r a i n 、1 0 r a i n 、1 5 r a i n ) ，发现细胞受热死 亡符合一级动力学方程，则利用一级动力学方程和阿累尼乌斯公式计算死亡速率常 数k 和活化能厶e 值，从工程学角度解释p i - i b 对苏云金芽胞杆菌营养细胞耐热性的 影响。结果表明：通过比较同一温度下b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 和b m b l 7 1 - p 菌株的 比热死速率常数k 值可知，拓啪1 7 1 + p k b m b l 7 1 b m b l 7 1 一p 。 处理温度为4 5 c 和5 0 。c 时，b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 菌体的d g o 值( 分别为3 2 5 m i n 、 1 1 5 r a i n 和2 5 m i n 、9 5 r a i n ) 远大于b m b l 7 1 - p 菌体的d g o 值( 1 2 r a i n 、6 m i n ) ，较高 温度( 5 5 、6 0 ) 时，三种菌的d 帅值区别不如较低温度时明显。 4 ) 三种菌的营养细胞在2 0 c 下放置5 天后，b m b l 7 1 + p 菌体存活率为 1 5 9 1 ，b m b l 7 1 菌体存活率为1 4 9 3 ，而b m b l 7 1 - p 菌体存活率仅为o 9 3 。 5 ) 照射4 0 s 时，b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌体存活率分别为8 2 1 8 和7 2 6 7 ， 而b m b l 7 1 - p 菌株菌体存活率只有4 1 2 。此后b m b l 7 1 p 菌株菌体存活率一直低 于b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 茵体存活率。 6 ) 将三种菌对数末期的营养细胞室温放置两天，1 天后b m b l 7 1 的存活率为 2 2 4 ，b m b l 7 1 + p 的存活率为2 5 ，b m b l 7 1 p 的存活率为0 8 2 ；2 天后分别为 2 0 9 、2 3 9 和0 2 0 ，且b m b l 7 1 - p 菌体出现自溶现象。 7 ) 三类菌株在不同n a c l 浓度中的培养基中生长，则对每一种菌株而言，随着 培养基中随着n a c l 浓度的增加b m b l 7 1 + p 、b m b l 7 1 和b m b l 7 1 p 菌株的生长能 力都会减弱，但能在生长过程中合成p h b 的b m b l 7 1 + p 和b m b l 7 1 菌株生长能力 减弱的程度远远不及不能合成p h b 的b m b l 7 1 - p 菌株生长能力被削弱的程度，但当 培养基中n a c i 浓度高出某一特定值后( 7 n a c l ) ，三类菌株都很难在这种环境中生 长生存。 8 ) 三类菌株在不同p h 值培养基中生长过