（环境工程专业论文）漆酶介体系统对含氮杂环化合物的降解研究.pdf

武汉科技大学硕士学位论文第1 页 摘要 氮杂环化合物广泛存在于焦化、医药、印染等工业废水中，其毒性对环境和人体健康 都造成了严重危害，因此对含氮杂环化合物水体的修复研究具有重要意义。漆酶广泛存在 于真菌中，具有底物多样性的特点，相比之下，纯漆酶制剂具有高效性、专一性等特点。 采用漆酶制剂与小分子介体结合成为漆酶介体系统，该系统在制浆造纸，印染脱色，废水 除毒，土壤修复等方面都有显著作用。其研究结果如下： 采用响应面优化法对以甘蔗渣为主成分的产酶培养基进行优化，从而获得高活性的漆 酶。优化结果得出，培养基中的麸皮、棉粕、甘蔗渣、吐温8 0 、k h 2 p 0 4 、m g s 0 4 、c u s 0 4 、 z n s 0 4 、酵母膏的添加量分别为8 1 4 9 l 、0 6 9 l 、5 0 9 l 、0 4 2 m l l 、l g l 、1 5 0 9 l 、0 0 4 9 l 、 0 2 9 l 、2 8 3 9 l 时，漆酶酶活可达9 6 4 8 0 u l 。 研究了纯漆酶制剂p l e u r o t u so s t r e a t u s 的酶学性质，得出漆酶在温度和p h 值分别为 5 0 0 c 和4 0 时活性最大，且该酶制剂催化反应符合m i c h a e l i s m e n t e n 动力学规律。 漆酶a b t s 介体系统可有效降解低浓度的吲哚、吡啶，但对喹啉无效。漆酶a b t s 介 体系统对单基质吲哚的最佳降解条件是：p h 为3 0 、a b t s 溶液浓度为o 5 m m o l l ，漆酶 加入量为1 u m l 。吲哚在降解过程中可能产生的中间产物为氧化吲哚和靛红。吲哚与吡啶 共存，表现为拮抗作用；吲哚与喹啉共存，表现为协同作用；吡啶、喹啉、吲哚三者共存， 一定程度上促进了吲哚的降解。 关键词：漆酶活性；漆酶介体系统；吲哚；吡啶；喹啉 a b s t r a c t n i t r o g e n o u sh e t e r o c y c l i cc o m p o u n d sa r eq u i t et o x i ct ot h ee n v i r o n m e n ta i l dh u m a i lh e a l t h w h i c ha r ew i d e l ye x i s t i n gi nc o k i n gp l a n t s ，m e d i c a lw a s t e w a t e r , p r i n t i n ga n dd y e i i 培p l a n t sa n d s oo n t h e r e f o r e , i ti sv e r yi m p o r t a n tt or e s e a r c ho nt h ew a t e rr e s t o r a t i o no f r t i t r o g e nh e t e r o c y c l i c c o m p o u n d s l a c c a s ee x i s t sw i d e l yi nf u n g i ，w h i c hi sc h a r a c t e r i z e db yt h es u b s t r a t ed i v e r s i t y b v c o n t r a s t ，p u r el a c c a s ee n z y m ep r e p a r a t i o ni sc h a r a c t e r i z e db ye f f e c t i v e n e s sa n ds p e c i f i c i t y p u r e l a c c a s ee n z y m ep r e p a r a t i o na n ds m a l lm o l e c u l a rm e d i a t o rc o m b i n et of 1 0 册1 a c c a s em e d i a t o r s y s t e m ，w h i c hh a ss i g i l i f i c a n te f f e c to np n l p i n ga n dp a p e r m a k i n g ，d y e i n ga n dd c c o l o u r i z a t i o n d e t o x i f i c a t i o no fw a s t e w a t e r , s o i lr e m e d i a t i o na n ds oo n t h em a i nr e s e a r c hr e s u l t so f t h i sp a p e r i n c l u d e ： t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mw h i c hm a i n l yc o n t a i n sb a g a s s ew a s o p t i m i z e db yu s i l l gr e s p o n s e s 耐a c em e t h o d o l o g yt og e tm a x i m u ml a c c a s ea c t i v i t y a c c o r d i n gt ot h er e s u l t ，l a c c a s e a c t i v i t y m a x i m u mw a s9 6 4 8 0 u l ，w h e nt h eb e s ta d d i t i o nw a sb r a n8 14 9 l ，c o t t o n s e e dm e a l 0 6 9 l b a g a s s e5 0 9 l ，t w e e n - 8 0 0 4 2 m l l ，k h 2 p 0 4lg l ，m g s 0 41 5 9 l ，c u s 0 4 0 0 4 9 l z n s 0 4 7 1 - 2 00 2 9 l ，y e a s te x t r a c t2 8 3 9 l ，r e s p e c t i v e l v 1 h ea r t i c l er e s e a r c h e do ne n z y m a t i cp r o p e r t i e so fl a c c a s ee n z y m ep r e p a r a t i o np e 堋r d f “s d s i r e 口t u s i h eb e s tt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u ew e r e5 0 0 ca n d 4 0 c a t a l y t i cr e a c t i o no ft h e l a c c a s ee n z y m ep r e p a r a t i o nw a s c o m p l i e dw i t hm i c h a e l i s m e n t e nk i n e t i cr u l e s l a c c a s e a b t sm e d i a t o rs y s t e mc o u l dd e g r a d el o wc o n c e n t r a t i o ni n d 0 1 e a n dp y r i d i n e e f f i c i e n t l y , b u tq u i n o l i n ec o u l dn o t t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e df o ri n d o i e2 l sf o l l o w s ： p hv a l u e3 0 ，a b t sc o n c e n t r a t i o n0 5 m m o l l ，l a c c a s ea d d i t i o n1 u m l ，a n d 也en e w s u b s t a i l c e s m a y b eo x i n d o l ea n di s a t i n t h ec o 。e f f e c to fi n d o l em i x e dw i t h p y r i d i n es h o w e dac o n t r a d i c t o 巧e f 梵c t ，w h 订et i l e c o 。e f f e c to fi n d o l em i x e dw i t hq u i n o l i n es h o w e dac o o p e r a t i v ee f f e c t ，a n di n d 0 1 e d e 鲫撕o n w a se n h a n c e dw h e nt h ec o 。e f f e c to f p y r i d i n ea n dq u i n o l i n e m i x e dw i t l li 1 1 d 0 1 e k e yw o r d s ：l a c c a s ea c t i v i t y ；l a c c a s em e d i a t o r s y s t e m ；i n d o l e ；p y r i d i n e ；q u i n o l i n e 武汉科技大学硕士学位论文第1 页 第一章序言 1 1 氮杂环化合物概述 随着近几十年工业的飞速发展，大量工业废水如焦化废水、农药废水、染料废水等的 排放，造成了水环境的严重恶化。其中，主要的难降解物质就是氮杂环化合物，吲哚、吡 啶、喹啉等都是典型代表物质，它们的共同特性表现在长期残留性、生物蓄积性、半挥发 性和高毒性四个方面，它们的危害性已经直接或间接地影响到水体、环境和人类健康【l 2 】。 与此同时，含氮杂环化合物也是目前农药、香料、染料等工业中的主导原材料，由于这类 物质容易在环境中积累，对动物和人体具有毒性、致突变性和致癌性，因此寻求对这一类 难降解化合物的经济而高效的处理技术显得非常重要【3 】。 1 1 1 氮杂环化合物的性质 吲哚，又称2 ，3 苯丙吡咯，分子量为1 1 7 1 4 ，其分子式为c 8 h 7 n ，结构式如图1 1 所 示。吲哚是单环五元杂环吡咯与苯环稠合后形成的，呈无色叶状晶体，遇日光久会变黄红 色，易溶于乙醇、乙醚、热水等，化学性质和吡咯相接近，几乎无碱性 4 】。吲哚具有两种 并合方式，分别称为吲哚和异吲哚。吲哚属于中等程度挥发的有机物，有令人不悦的类似 于排泄物的气味。吲哚及其同系物和衍生物广泛存在于自然界，主要用作香料、染料、氨 基酸、农药的原料【5 1 。吲哚环上的电荷密度降低、空间体积位阻效应增大和疏水性增强的 原因，使得吲哚难于好氧生物降解，且生物降解速率常数约是吡咯的一半【4 】。 h 图1 1 吲哚的分子结构式 f i g 1 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r a lo fi n d o l e 吡啶是六元杂环化合物，是最简单的含氮杂环，即苯环中的一个c h 被替换成n 原子， 它的分子量为7 9 1 0 ，分子式为c 5 h 5 n ，结构式如图1 2 所示。吡啶是有特异气味的无色液 体，能随水蒸发挥发，溶于水、乙醇、乙醚等多种有机液体。由于吡啶呈弱碱性，可与强 酸成盐，在工业上可用作变性剂、助染剂、以及合成药品、消毒剂、染料等的原料【6 】。吡 啶的合成可以通过环缩合反应、环加成反应或由其他杂环化合物发生环转化反应来实现【5 】。 吡啶挥发性较强，且难于好氧生物降解。 吡啶分子中，氮原子上的未共用电子对未参与环上兀电子共轭体系的形成，由于氮原 子电负性极强，且吸引环上电子，从而使得环上电子云密度急剧下降，妨碍了氧从分子中 获得电子，导致其生物降解性能大大降低【7 1 。吡啶对人的危害性主要表现在对眼及上呼吸 道有刺激作用，长期吸入会出现头晕、头痛、失眠等症状，还可引起皮炎等。 第2 页 武汉科技大学硕士学位论文 图1 2 吡啶的分子结构式 f i g 1 2t h em o l e c u l a rs t r u c t u r a lo fp y r i d i n e 喹啉是由萘中的一个0 【c h 基团被氮取代衍生而来，又称苯并 b 】吡啶，分子量1 2 9 1 5 ， 分子式为c 9 h 7 n ，结构式如图1 3 所示。喹啉是吡啶与苯的稠合体，最早是由生物碱金鸡 宁碱性降解得到的，呈无色油状液体，是制药和染料的重要原料 卯。喹啉具有两种并合方 式，分别称为喹啉和异喹啉，存在于煤焦油和骨焦油内。喹啉呈弱碱性，难溶于冷水，易 溶于热水、乙醇、乙醚、氯仿等，可随水蒸气挥发，与强酸结合可形成水溶性的盐。 环境中的喹啉主要来源于焦化废水和制药废水中，对人类、水生生物及其植物有很大 危害。喹啉属于中等程度挥发有机物，与萘和吡啶在分子结构、键参数、光谱及能量数据 上有许多相似之处，并且喹啉分子的生物降解性能介于萘与吡啶之间【4 】。喹啉对人的危害 主要表现在吸入后会引起头痛、头晕、恶心等症状，并对眼睛、喉咙、皮肤有刺激性。 图1 3 喹啉的分子结构式 f i g 1 3t h em o l e c u l a rs t r u c t u r a lo fq u i n l i n e 1 1 2 含氮杂环化合物废水的处理方法 近年来对含氮杂环化合物废水的处理方法主要有物化处理、化学处理和生物处理。物 化处理方法主要有吸附法、过滤法、混凝沉淀法、离子交换法等，但这仅是预处理，还需 要进一步地处理，并且物化法还存在易产生二次污染的问题。化学处理法主要包括催化湿 式氧化法、电化学氧化、光氧化法以及新型的高级氧化技术等，但是成本较高、操作复杂 使得难以推广应用【3 】3 。 相比之下，生物处理不仅具有投资少、成本低、易管理等优点，还能将难降解物质分 解并最终去除，因此也成为了最受研究者亲睐的处理技术。生物处理主要以投加优势菌种 来达到降解含氮杂环化合物废水的目的。主要的途径有好氧降解、厌氧降解和缺氧降解三 种【8 1 。 ( 1 ) 好氧降解途径 含氮杂环化合物的降解一般起始于邻近氮原子的羟基化过程，其结合的氧来源于水， 许多含钼的酶是羟基化反应的催化酶【9 】。大多数情况下，好氧降解包括几个羟基化步骤， 然后是杂环或是芳香环的双氧裂解，但是有的降解途径中在环裂解前也包括还原反应。降 解吲哚过程中，环的断裂在2 和3 位之间发生，中间产物为氧化吲哚和靛红，依次为吲哚 的2 和3 位上的氧化的产物【1 0 1 。吡啶的好氧降解一般由诱导酶决定，降解途径为：不发生 武汉科技大学硕士学位论文第3 页 中间产物为2 羟基喹啉， 羟基化反应直接被还原【1 1 】。喹啉在好氧条件下的可被生物降解， 该产物最终也被分解矿化【1 2 , z 3 。 ( 2 ) 厌氧生物降解途径 有研究表明，经过厌氧处理可以改变难降解有机物的化学结构和生物降解性能，使其 可生化性提高。开环裂解是氮杂环化合物生化反应的关键步骤，而厌氧微生物具有易于诱 导和较为多样化的健全的开环酶体系，从而顺利将其降解【1 4 】。d y r e b o r g 等在研究了8 种杂 环化合物在不同氧化还原条件下的降解后，得出杂环化合物的厌氧降解速率明显低于好氧 降解速率，且只有喹啉和吲哚可以在厌氧条件下降解 1 5 】。李咏梅等研究了几种氮杂环化合 物在厌氧条件下的降解难易程度，得出这几种物质由易到难的降解顺序为吲哚 异喹啉 喹啉 d e 啶 2 甲基喹啉【1 6 j 。 ( 3 ) 缺氧生物降解途径 氮杂环化合物在缺氧的条件下比在厌氧的条件下更易降解，例如吡啶这种典型的氮杂 环化合物，其降解速率在缺氧条件下比在厌氧条件下明显提高。程静等研究得出以喹啉为 唯一氮源，n a n 0 3 为氮源进行的缺氧反硝化去除喹啉的反应过程中，喹啉的去除经过吸附 解吸降解三个过程。降解机理为喹啉首先羟基化，转化为2 羟基喹啉，然后在羟基化为 2 ，8 二羟基喹啉，之后氧化为8 羟基香豆素，之后断环转化为脂肪类化合物【1 7 】。李咏梅等 研究表明在缺氧条件下的几种氮杂环化合物从快到慢的顺序为吡啶 吲哚 喹啉 2 一甲基 喹啉 异喹啉【l 引。c n 对缺氧反硝化处理含氮杂环化合物有很重要的意义。共基质条件下， 吡啶对吲哚的缺氧降解有促进作用，在最佳c n 条件下，吲哚的缺氧降解符合零级反应动 力学规律【l 功。 1 1 3 含氮杂环化合物废水处理方法存在的问题 目前，较多研究主要集中在投加优势菌种降解含氮杂环化合物的废水，优势菌种包括 真菌和细菌。相比于废水生物处理过程中产生的优势菌种繁殖速度较慢，菌种的反应效率 较低、消耗能源较多、培养基消耗较大，从而导致处理成本仍然较高，以及处理水的回用 等问题，漆酶介体系统则表现出快速高效的特点，因此漆酶介体系统越来越受到国内外科 研工作者的关注，并从其作用机理、介体类型、技术应用等方面进行了广泛研究。 1 2 漆酶介体体系的研究进展 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶( p d i p h e n o lo x i d a s ee c 1 1 0 3 2 ) ，广泛存在于自然界 中，主要来源是真菌、植物和细菌中，担子菌纲的白腐菌是漆酶的主要产生者【2 0 】。漆酶以 其特殊的氧化还原性和底物作用广泛性，已经在染料脱色、造纸制浆、食品工业、环境保 护等方面表现出了极高的应用价值。 研究表明，一些小分子介体的加入，可介导漆酶与底物之间的氧化作用，进一步扩大 漆酶的作用范围，因此漆酶与小分子介体的结合被称为漆酶介体系统( 1 a c c a s em e d i a t o r s y s t e m ，简称l m s ) 2 h 。 第4 页武汉科技大学硕士学位论文 二) ( 二化态) ( m 删e d i a 栅t o r 氧憾) ( 二憾 武汉科技大学硕士学位论文 第5 页 续过氧化氢的漂白效果【2 引。v 甜1 sc 等分别使用n h a 漆酶介体系统和h b t 漆酶介体系统 对桉树纸浆进行漂白，研究发现介体n h a 比h b t 在降低桉树纸浆的卡帕值方面表现出了 更高的效率【2 9 】。 ( b ) 漆酶介体系统脱色机制 介体被漆酶氧化形成介体氧化态，在自由基的介导作用下，染料被聚合成沉淀物，最 后使染料溶液变成无色。介体的加入将染料体系的脱色过程复杂化，较于漆酶本身，介体 则成为脱色体系内提高染料脱色率的决定性因素【3 0 】。k h l i f ir 等研究指出单独使用漆酶不 能使废水脱色，而漆酶介体系统却有很好的效果，并且发现使用的几种介体中h b t 的脱 色效果最佳【3 l 】。染料和介体具有相互选择性，因此选择合适的介体是提高漆酶广度和强度 的关键【3 2 】g o m a ao m 研究指出使用漆酶介体系统对酚红染料脱色率比单独使用漆酶对其 脱色增加了2 3 倍 3 3 】。 ( 2 ) 介体研究进展 漆酶介体系统在染料脱色、废纸脱墨、纸浆漂白以及环境保护等方面已经显现出来非 常显著的处理效果。目前，研究者常用的介体是人工合成介体，如2 ，2 连氮双( 3 乙基苯 并噻吡咯啉6 磺酸) ( a b t s ) 、1 羟基苯并三唑( h b t ) 、紫尿酸( v i o ) 、n 羟基- n 乙酰 基苯胺( n h a ) 等，这些介体的共同点都是带有n o h 或n = o 基团的n 杂环物【3 4 1 。然而 人工合成介体存在成本高、稳定性较差等缺点，近年来一些学者对新型介体进行了研制和 开发，主要包括：多金属氧酸盐、哌啶类氮氧自由基、芳基取代的n 羟基酞酰亚胺以及一 些天然介体。这些新型介体的研究不仅提升了酶的作用力，而且使漆酶介体系统在工业上 的应用尽早得以实现【3 5 j 。 1 2 3 对含氮杂环化合物污染水体的漆酶介体系统修复优势 ( 1 ) 漆酶介体系统技术特点 对漆酶底物和非酶底物降解具有广谱性；是通过羟自由基单电子氧化过程实现污染物 的化学转化；对有毒污染物和p h 波动的耐受力强；可适用于固、液两种体系【3 6 1 。 ( 2 ) 实际废水中有机污染物的难降解性和多样性 高效专一菌种只可对一类污染物有较好的处理效果，但多类杂环化合物的共存会对细 菌产生抑制作用【3 7 1 。难降解有机物的降解需要好氧菌和厌氧菌等的协同作用，是一个极其 复杂的过程。但是漆酶介体系统降解具有非专一性，可实现对底物无特异性的氧化降解 3 8 , 3 9 o ( 3 ) 实际废水和环境条件的复杂性 由于实际废水中的难降解有机物和有毒有害的无机物较多，细菌难于在这种环境下进 行生长代谢，需要将进水稀释，减少有机负荷，延长细菌的驯化时间，使其适应每一种污 染物。同时p h 值和温度波动较大，在这种高负荷状态下，细菌很难生存，因此传统的生 化法面临的困难很大。而漆酶介体系统技术不需经过特定污染物的预条件化，漆酶启动较 为迅速，同时这些恶劣的条件甚至可以促进漆酶的启动和活性的提高【4 0 】。 第6 页武汉科技大学硕士学位论文 1 3 本文的立题依据与主要内容 1 3 1 立题依据 由于漆酶的应用之广泛，使其具有广阔的潜在应用市场，而提高漆酶的高效性是工业 上推广应用的关键，所以提高漆酶活性是本课题的研究目的之一。此外，漆酶介体系统技 术的研究与含氮杂环化合物污染水体的修复分别是水处理领域的新技术和热点研究问题， 因此，本课题的另一研究目的是利用纯漆酶制剂与介体a b t s 组成的漆酶介体系统处理典 型氮杂环化合物：喹啉、吲哚、吡啶，探索漆酶介体系统对吲哚、喹啉、吡啶的降解机理 以及共基质下吲哚、喹啉、吡啶间的相互作用机制，从而为含氮杂环化合物的污染水体的 修复提供一种思路。 1 3 2 研究内容 ( 1 ) 培养基的优化 利用响应面优化法设计出一种以甘蔗秸秆为主料的培养基的配比，从而提高白腐真菌 p l e u r o t u so s t r e a t u sp 4 0 的漆酶产量； ( 2 ) 漆酶介体系统对单基质氮杂环化合物的降解研究 利用漆酶儿蛆t s 介体系统降解吲哚模拟废水，考察影响降解率的因素并阐释吲哚可能 的降解机理； ( 3 ) 漆酶介体系统对共基质氮杂环化合物的降解研究 利用漆酶a b t s 介体系统降解吲哚、吡啶、喹啉相互共基质的模拟废水，考察降解过 程中物质间的相互作用以及其可能的降解机理。 1 3 3 课题来源 本研究课题来源于： ( 1 ) 十二五国家科技支撑计划，课题名称为钢铁联合企业焦化废水处置分质回用技 术及应用，项目编号为2 0 1 2 b a c 0 2 8 0 4 ； ( 2 ) 湖北省科技计划自然科学基金，项目名称为漆酶介体系统在复杂体系下对含氮 杂环化合物修复研究，项目编号为2 0 1 0 c d b 0 3 5 0 2 。 武汉科技大学硕士学位论文第7 页 第二章响应面法优化漆酶液体发酵 响应面优化分析法( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ，r s m ) 是一种寻找多因素系统中 最佳条件的数学统计方法，在生物技术的众多领域运用广泛。响应面优化分析法将数学方 法与统计方法相结合，通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制，从而快速有效 地预测响应最优值以及最适宜的实验条件 4 1 1 。在发酵培养基的优化中常用的响应面设计有 b o x - b e h n k e n ( b o x - b e h n k e n d e s i g n ，b b d ) 和中心组合设计( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ，c c d ) 。 p l a c k e t t b u r m a n 法是一种两水平的实验设计方法，适用于从众多因素中快速有效地筛选出 最重要的影响因素，一般作为培养基优化的最初实验设计【4 2 1 。 尤其近几年，国内外许多学者都采用响应面优化分析法来达到提高酶产量或酶活性的 目，并且效果显著。李亚钱等对p s e u d o m o n a ss p m 1 8 菌种产生的p c a 酶产量进行优化， 优化后的酶产量比基础培养基酶产量高出三倍之多【4 3 】。s u d h i rk 对以花生壳为培养基生长 的菌种w i 江1 所产的漆酶产量进行优化，得出了生长所需的最适温度、p h 、水分含量、 花生壳量以及菌种量 4 4 l 。w a n g jk 等对纳豆激酶的酶活性进行优化提高，选出了培养基中 所需的最佳氮源、碳源、无机盐并得出其最佳投加量【4 5 】。 为达到保护环境，实现资源科学与合理再利用的目的，本实验选取的培养基主成分为 甘蔗渣，采用响应面优化分析法对产酶培养基组分进行优化，以期提高漆酶酶活，从而为 漆酶的生产实践提供理论依据。 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种及材料 菌种：糙皮侧耳p l e u r o t u so s t r e a t u sp 4 0 ，购买于广东省微生物菌种保藏中心( g 蹦c c ) ， 保存在p d a 斜面培养加上。 材料：麸皮、棉粕由武汉万年青饲料有限公司提供：将甘蔗去皮脱水后粉碎烘干得到 甘蔗渣。 2 1 2 实验试剂 a b t s ( s i g m a 公司) ，酵母膏( 北京双旋微生物培养基制品厂) ，吐温8 0 ( 北京鼎国 昌盛生物技术有限责任公司，g e n v i e w 分装) ，其余试剂均为分析纯级试剂。 2 1 3 实验仪器与设备 电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；1 0 1 型电热鼓风干燥箱，北京市永光明 医疗仪器厂；s w - c j 1 g 型单人净化操作台，苏州净化设备有限公司；p b 1 0 型p h 计，赛 多利斯科学仪器有限公司；y x 4 0 0 b 型不锈钢双层立式蒸汽压力消毒器，上海三申医疗器 械有限公司；l r h 2 5 0 f 型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；h y - 6 型双层恒温调速多 用振荡器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；8 0 2 型低速离心机，江苏金坛新一佳仪 第8 页武汉科技大学硕士学位论文 器：u v - 2 5 5 0 型紫外可见分光光度计，日本岛津。 2 1 4 培养基与培养条件 ( 1 ) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基：水1 0 0 0 m l ，土豆2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，k h 2 p 0 4 3 9 ， m g s 0 4 1 5 9 ，v b i8 m g ，琼脂2 0 9 ，p h 调至6 。 ( 2 ) 种子培养基：将马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的琼脂去掉。 ( 3 ) 产酶培养基；麸皮、棉粕、甘蔗渣、吐温8 0 、k - h 2 p 0 4 、m g s 0 4 、c u s 0 4 、z n s 0 4 、 酵母膏，p h 调至6 。 2 1 5 培养方法 ( 1 ) 菌种活化：将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，2 8 。c 恒温培养6 - 7 天， 置于4 0 c 冰箱中保存备用。 ( 2 ) 液体种子培养：将菌种由马铃薯葡萄糖琼脂培养基接种至装有l o o m l 种子培养 基的2 5 0 m l 三角瓶中，1 3 0 r m i n ，2 8 0 c 振荡培养5 天。 ( 3 ) 漆酶发酵培养：将培养好的液体种子接至装有1 0 0 m l 产酶培养基的2 5 0 m l 三角 锥瓶中，每瓶接入1 0 m l ，1 3 0 r m i n ，2 8 0 c 振荡培养1 2 天。 2 1 6 漆酶活性测定 采用a b t s 法，常温下，分别取0 5 m m o l l 的a b t s0 5 m l ，o 1 m o f l 的醋酸醋酸钠 缓冲液( p h 4 5 ) l m l ，再添加l m l 酶液启动反应。在4 2 0 n m 下测定吸光值变化。定义每 分钟o d 值改变0 0 0 1 为一个酶活单位，记为u 湖。 2 2 响应面优化设计 2 2 1p l a c k e t t - b u r m a n 法筛选影响酶活的主要因素 该产酶培养基共有九种组分，分别是：麸皮、棉粕、甘蔗渣、吐温8 0 、k h 2 p 0 4 、m g s 0 4 、 c u s 0 4 、z n s 0 4 、酵母膏。为对这9 个因素进行全面考察，选用n = 1 4 的p l a c k e t t b u r m a n 设计，并余留4 个空项作误差分析，每个因素取2 个水平，用“+ 、“ 分别代表高水平 和低水平【4 7 1 。低水平为初始产酶培养基，高水平取低水平的2 倍。采用m a t l a b 软件对1 4 组实验的数据进行计算，从而筛选出影响酶活的主要因素。 2 2 2 中心组和实验 为提高漆酶酶活，采用c c d 响应面优化法优化p l a c k e t t b u r m a n 实验筛选出的重要因 素 4 引。c c d 实验设计中每个因素取5 个水平，以( 0 ，士l ，士2 ) 编码。根据实验设计进行 相应试验后，对实验数据进行二次回归拟合，得到含有交互项和平方项的二次拟合方程， 分析各因素的主导效应和交互效应，而后在一定的水平范围内求出最佳值【4 9 】。下式即为预 测最佳值的模拟方程式： 武汉科技大学硕士学位论文第9 页 】，= 成+ 屈五+ 岛五_ + 层；# ( 2 1 ) 公式( 2 1 ) 中：】，为预测响应值，即酶活值，励为偏移项偏移系数，局为线性偏移偏 移系数，届，为二阶偏移系数，励为交互效应系数，勋为自变量的编码水平 5 0 1 。 2 2 3 软件分析及实验验证 优化实验数据均采用m a t l a b 软件进行分析。为检验优化模型的预测值与实际实验结果 的相符性，对培养基组分进行验证实验。比较预测值与理论预测值的差异情况，从而判断 该模型是否可以较好预测实际发酵情况。 2 3 结果与分析 2 3 1 影响漆酶酶活的重要因素 按照p l a c k e a b u r m a n 设计进行实验，每2 4 小时取样测定漆酶酶活，并取两次测量值 的平均值为准。实验因素及水平见表2 1 ，实验设计及结果见表2 2 ，主要效应及重要性评 价见表2 3 。 表2 1p l a c k e t t b u r m a n 实验因素及水平 t a b l e2 1v a r i a b l e ss h o w i n gm e d i u mc o m p o n e n t su s e di np l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n 表2 3 中的p 值代表了各因素的影响大小，当p 如0 5 时说明该因素为相对重要的因 素，当尸珈0 5 时说明该因素对酶活的影响不显著。因此，p l a c k e t t b u r m a n 实验结果所得 到的变量x l ，x 2 ，x 3 ，x 4 的p 值分别为0 0 1 1 9 3 、0 0 0 9 4 5 8 、0 0 1 8 1 1 、0 0 0 4 2 2 9 ，均在0 0 5 以下，其余变量都大于o 0 5 ，因此筛选得到了影响酶活的四个重要因素：麸皮、甘蔗渣、 吐温8 0 、酵母膏。 此外，表2 3 中的影响权重一列可以看出变量x l 、x 2 、x 3 、) ( 4 的影响值分别为1 4 9 7 0 、 1 5 3 2 0 、1 4 2 8 0 和1 6 4 2 0 ，数值前的正负号代表了投加量增加或减少的趋势，结果表明在接 下来的c c d 响应面优化设计中应当适当增加麸皮和甘蔗渣的加入量，适当减少吐温8 0 和 酵母膏的加入量j 。 表2 2p l a c k e t t - b u r m a n 实验表 t a b l e2 2p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g nm a t r i xo f f o u r t e e nv a r i a b l e s ( x l x 1 4 ) a n dn v ed u m m y v a r i a b l e s ( d 1 一d 5 ) a l o n gw i t ho b s e r v e dr e s p o n s e ( 1 a c c a s ea c t i v i t y ) 因素水平 漆酶酶活 编号i 1 ：- f i 气i 瓦而气i ( u l )x lx 2d lx 3 x 4d 2x 5x 6d 3x 7 x 8d 4x 9 1 111111 111- 1- 11- 15 7 3 1 5 2111 1111111- 1 - 1- 11 2 8 1 0 3111 111111 11- 1- 11 5 1 5 4 ii11ii 111iiii 1 0 4 0 3 511111 111111 114 9 5 3 0 6111111 11- l- 111 16 2 7 2 3 7 11111 11l1- 1- 11 16 3 6 7 5 811111 111111- 115 8 3 2 8 911111 111111- 1 - 15 4 5 2 5 1 01111 1111- 111 1- 12 0 4 0 0 1 1 11111111- 1 11115 9 9 1 0 1 2 11111111- 1 - 1- 1116 2 4 1 5 1 31 1- 11111 1- 1- 1- 1- 116 0 3 5 3 1 411 1111111- 1- 1 116 2 6 7 8 表2 3p l a e k e t t b u r m a n 实验结果的各因素效应评价 t a b l e2 3s t a t i s t i c a la n a i y s i so fm e d i u me o m p o n e n t si nr e l a t i o nt ol a e e a s ea c t i v i t ya sp e r p l a e k e t t - b u r m a nd e s i g n 2 3 2 响应面优化培养基组分 在产酶培养基中棉粕、k h 2 p 0 4 、m g s 0 4 、c u s 0 4 、z n s 0 4 的加入量分别为0 6 9 l 、l g l 、 武汉科技大学硕士学位论文 第1 1 页 1 5 0 9 l 、o 0 4 9 l 、0 2 9 l 的条件下，利用c c d 响应面法进行四因素( 麸皮，甘蔗渣、吐 温8 0 、酵母膏) 五水平( 2 ，1 ，0 ，1 ，2 ) 的响应面分析实验。因素水平见表2 4 ，实验 设计及结果见表2 5 ，响应面二次模型的相关回归系数分析见表2 6 。 表2 4 中心组合实验中变量及其水平 t a b l e2 4l e v e l so ff a c t o r sc h o s e nf o rt h ee x p e r i m e n t a ld e s i g n 水平 因子编号 210l 2 麸皮( g l ) x 1 246 81 0 甘蔗渣( g l ) x 2 1 0 吐温8 0 ( m l l ) x 3 o 2 5 2 0 3 0 0 50 7 5 4 05 0 l 1 2 5 酵母膏( g l ) x 4 1 2 5 2 53 7 556 2 5 表2 5 中心组合实验及其结果 t a b l e2 5c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nf o rt h ee x p e r i m e n t a ld e s i g na n dp r e d i c t e dr e s u l t s 序号x lx 2x 3 x 4漆酶酶活( u l ) 111 一l- 16 2 5 0 0 5 9 9 2 5 7 1 3 5 0 9 3 5 0 0 2 7 2 2 5 2 7 9 0 0 3 7 3 7 5 4 0 3 7 5 9 9 7 5 9 8 2 5 3 5 5 7 5 5 3 4 7 5 8 2 5 0 3 2 2 5 3 0 5 2 5 5 1 8 2 5 3 6 2 7 5 4 8 0 7 5 3 6 9 7 5 9 1 7 0 0 5 9 8 2 5 0 0 0 0 0 0 o ， l 1 0 0 0 0 o 0 0 0 0 o d 0 0 0 o 0 乞 0 0 0 1 l 0 0 0 0 0 0 之 2 o 0 0 0 0 0 0 o 五 2 o o 0 2 3 4 5 6 7 8 9 m n 坦 b 悸 坫 他 侈 加 俎 第1 2 页 壅圣壁垫垄兰堡主堂垡笙茎 续表 序号 x l x 2x 3 ) ( 4 漆酶酶活( u l ) 2 2 002 09 0 2 5 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 o 0 2 2 o 0 o o 0 5 0 5 2 5 3 5 0 0 6 2 4 0 0 6 5 4 0 0 6 1 3 0 0 6 1 7 0 0 6 4 3 5 0 3 0 000 06 7 8 0 0 表2 6 相关回归系数 t a b l e2 6t e s to fs i g n i f i c a n c ef o rr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t s 来源回归系数 自由度f 值尸值 模型 1 4 4 7 61 40 9 8 4 6 8 7 0 9 9 1 0 ” x 1 x 2 x 3 x 4 x l x 2 x z x 3 x 1 ) ( 4 x 2 x 3 x 2 x 4 x 3 x 4 x 1 2 x 2 2 x 3 2 x , 2 1 4 1 0 2 7 2 0 7 4 7 1 4 1 2 1 5 6 4 1 2 2 3 2 2 1 7 1 9 2 6 9 3 7 4 5 4 3 7 3 7 5 3 7 2 7 8 7 5 1 5 4 1 2 6 2 4 0 3 1 2 9 6 3 0 6 0 6 3 4 0 4 4 1 2 8 5 0 7 5 8 6 8 7 7 7 9 6 9 9 1 2 8 4 1 6 2 8 0 0 4 5 2 2 0 0 4 1 1 7 1 2 9 3 0 2 2 1 4 8 6 3 4 7 4 5 3 1 0 3 o 5 1 1 8 0 0 0 6 7 6 3 0 0 2 1 8 9 0 0 0 9 2 4 0 0 1 3 0 8 0 2 6 6 4 0 2 1 2 1 0 8 3 3 1 0 8 4 0 6 0 0 0 1 1 8 2 0 6 4 1 5 0 0 0 6 4 0 9 0 0 1 0 6 6 0 0 0 3 2 4 5 ( 1 ) 优化结果分析 y = 1 4 4 7 6 + 1 4 1 0 2 x 1 7 2 0 7 4 五+ 7 1 4 1 2 x 3 + 1 5 6 4 1 五+ 2 2 3 2 x , 五 - 2 1 7 1 9 x i x 3 + 2 6 9 3 7 五五一4 5 4 3 7 五墨+ 3 7 5 3 7 x 2 五+ 2 7 8 7 5 x 3 x 4 ( 2 2 ) 一1 5 4 1 2 x ；一6 2 4 0 3 x 2 1 2 9 6 3 0 x ；- 6 0 6 3 4 x j 通过m a t l a b 软件对表2 5 中实验数据进行回归分析，建立以漆酶酶活为响应值的四元 二次回归方程( 2 2 ) ，其中】，为漆酶酶活预测值，x l 、x 2 、x 3 、) ( 4 分别表示麸皮、甘蔗渣、 吐温- 8 0 、酵母膏。解方程得x l = 8 1 4 ，x 2 = 5 0 ，x 3 = o 4 2 ，x 4 - 2 8 3 ，表明麸皮、甘蔗渣、吐 温- 8 0 、酵母膏的最佳投加量分别为8 1 4 9 l 、5 0 9 l 、0 4 2 m l l 和2 8 3 9 l ，此时响应值】， 0 0 0 0 0 0 0 o o 0 o 0 0 0 武汉科技大学硕士学位论文第1 3 页 达到最大为1 0 4 8 3 0 ，即酶活值最大为1 0 4 8 3 0 u l 。该模型及其各参数的分析结果见表2 6 。 该模型的尸值为8 7 0 9 9 x1 0 。1 2 0 0 5 ，两组间差异无统计 学意义。利用s p s s l 3 0 考察i 与i + b 体系的丁检验结果，输出结果如表5 2 所示。 表5 1 吡啶和喹啉对吲哚的降解影响 t a b l e5 1e f f e c t so fp y r i d i n ea n dq u i n o l i n eo nt h ed e g r a d a t i o no fi n d o l e 表5 1 所示输出结果包含等方差检验、等方差时的丁检验结果和异方差时的r 检验结 果。s p s s 使用的是l e v e n e 检验，这种检验不需要正态性的假设条件，比f 检验更稳健。 第2 8 页武汉科技大学硕士学位论文 如果p 小于显著性水平，则认为总体是异方差的，应使用方差不等时的检验结果；如果方 差检验中认为两个总体是等方差的，则应使用方差相等时的检验结果。 图5 1 中等方差检验的f 值为0 9 3 8 ，p 值等于0 3 5 6 0 0 5 ，因此认为降解率的方差是 相等的。接下来的丁检验使