（药理学专业论文）利巴韦林在仔猪体内的药物代谢动力学与毒理学研究.pdf

j i i i i iirli iii i i i i i iiii i i i i i i i i j y 18 0 617 0 参考文献3 9 综i 丕4 5 致谢5 8 攻读学位期间发表的学术论文5 9 原创性声明6 0 利巴韦林在仔猪体内的药物代谢动力学与毒理学研究 研究生：刘雪梅 专业：药理学 导师：高允生教授 中文摘要 目的 了解利巴韦林在仔猪体内的药物代谢过程，观察口服利巴韦林对猪体内 外的毒性反应，探讨猪对利巴韦林易发中毒的原因，为进一步研究猪利巴韦 林中毒机制提供理论依据，对人类利巴韦林的安全用药提供参考。 方法 1 确定高效液相色谱( 即h p l c ) 法测定利巴韦林在猪血浆中的方法，探讨 利巴韦林以9 0 m g k g 体重单次1 ：3 服、多次口服后在仔猪( n = 3 ) 体内的药物动力 学规律。 2 研究探讨口服不同剂量的利巴韦林对仔猪的毒性作用。选用1 2 头二元 杂交仔猪，体重在1 5 2 k g 士1 5k g 。随机分为四组，分别为空白对照组和口服 利巴韦林1 0m g k g 、3 0m g k g 、6 0m g k g 试验组。连续给药1o 天，详细观 察各组的临床表现，动态检测血细胞、血清、骨髓造血功能及肝功各项理化 指标的变化，最后放血致死，剖检，进行病理组织学检查。 3 检测不同剂量利巴韦林对猪源传代细胞( p k 细胞) 的细胞毒性，采用 w s t - l 细胞毒性试剂盒检测，镜检细胞病变。 结果 1 单次给予9 0 m g k g 体重的药物剂量后，药物动力学模型符合二室房室 模型i 主要药动学参数分别为消除半衰期( t i j 2 p ) ( 2 3 5 0 4 - 3 9 5 ) h ，整体清除率 ( c l ( s ) ) 为( 1 。9 7 + 0 5 5 ) l k g 1 h ，表观分布容积( v f ) 为( 3 3 0 9 士6 7 7 ) l k g - i 多次给药后药物动力学模型符合单室模型，主要动力学参数分别为消除半衰 期( tu 2 k 。) 为( 2 1 7 4 士2 5 4 1 ) h ，整体清除率( c l ( s ) ) 为( o 7 a + 0 7 4 ) l k g i h ，表观 分布容积( v f ) 为( 9 1 1 土3 2 4 ) l k g 。 2 仔猪按1 0 m g k g 体重1 ：3 服利巴韦林虽然有一定的临床表现，但无明显 的中毒病变：1 ：3 服中、高剂量( 3 0 、6 0 m g k g 体重) 的利巴韦林对猪的毒副 作用明显，甚至导致急性死亡。利巴韦林对各组织器官表现泛嗜毒性，骨髓、 血液、心、肝、肾、脑、消化道、胰腺均表现明显的组织学病变。 3 。利巴韦林在高浓度时对猪肾传代细胞有一定的毒性作用，利巴韦林对 猪肾传代细胞的半数毒性浓度为1 8 9 m g m l ，细胞表现变性坏死。 结论 l 、本试验通过高效液相色谱( h p l c ) 法动态检测利巴韦林在猪体内的药 物代谢动力学变化，证明受试猪单次或多次口服给药后利巴韦林在猪血浆中 的代谢规律，利巴韦林较易在体内产生药物蓄积，在仔猪体内分布范围广泛。 2 、通过口服不同剂量利巴韦林建立仔猪中毒模型，系统观察了其临床 表现、病理生理学及病理形态学变化，初步揭示了利巴韦林对仔猪毒副作用 的发生机制及中毒仔猪的病变特征。 3 、应用w s t 1 细胞毒性检测试剂盒及细胞形态学观察检测了利巴韦林 对猪源传代肾细胞的毒性作用，初步认识过半数毒性浓度引起细胞的病理变 化。 4 、试验证实利巴韦林对猪各组织器官表现泛嗜毒性，以红细胞、骨髓 造血细胞、消化道上皮细胞及胰腺上皮细胞最为敏感，引起仔猪中毒剂量和 临床报道病例的中毒剂量有较大差异，推测临床用药猪群发生中毒的原因除 与用药剂量有关外，可能还与猪只本身的健康状况，日龄及生理状态，代谢 器官的病理变化，饲料及其它药物等因素影响有关。 关键词利巴韦林；仔猪：毒性反应；细胞毒性 r i b a v i r i ni np i g l e t si nv i v op h a r m a c o k i n e t i c s a n dt o x i c o l o g y p o s t g r a d u a t e ：x u e m e il i u s p e c i a l t y ：p h a r m a c o l o g y t u t o r ：p r o f e s s o ry u n s h e n gg a o a b s t r a c t o b j e c t i v e t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st ol e a r nr i b a v i r i ni nv i v od r u gm e t a b o l i s mo f p i g l e t s i tw a so b s e r v e dw i t h o r a lr i b a v i r i n a g a i n s ts w i n ev i v ot o x i c i t yo f r i b a v i r i n p r o n ep i gp o i s o n i n go nt h er e a s o n sf o rt h ef u r t h e rs t u d yo fm e c h a n i s m s o fp o r c i n er i b a v i r i n p o i s o n i n gt h e o r yb a s i s f o rt h e s a f e t yo fh u m a nd r u g r i b a v i r i nf o rr e f e r e n c e m e t h o d s 1 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o r g r a p h i cm e t h o d ( h p l c ) t o d e t e c t r i b a v i r i ni np i g sp l a s m aw e r ed e v e l o p e d p h a r m a c o k i n e t i c so fr i b a v i r i nw e r e i n v e s t i g a t e d f o l l o w i n g o r a la d m i n i s t r a t i o na t s i n g l e o r r e p e a t e d d o s eo f 9 0 m g k gb o d yw e i g h ti nh e a l t h yp i g s ( n 2 3 ) 2 w ei n v e s t i g a t e dt h et o x i ce f f e c ti np i g sw i t hd i f f e r e n td o s e so fr i b a v i r i n 1 2p i g l e t s w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o4g r o u p si n c l u d i n gac o n t r o lg r o u pa n dt h r e e e x p e r i m e n t a lg r o u p s i no r d e rt o i n v e s t i g a t e t h et o x i ce f f e c ti n p i g l e t s w i t h d i f f e r e n td o s e so fr i b a v i r i n r i b a v i r i nw a sa d m i n i s t e r e do n c ed a i l yf o r10 c o n s e c u t i v ed a y sa tad o s eo fe i t h e rl0 ，3 0 ，o r6 0m g k g t h et o x i ce f f e c t sw e r e o b s e r v e db ye t h o l o g y ，b l o o d ，s e r u m ，u r i n e ，b o n em a r r o wa n dp a t h o l o g i cc h a n g e s b e f o r ea n da f t e ra d m i n i s t a t i o n 3 t e s t i n gd i f f e r e n td o s e so fr i b a v i r i no np a s s a g ec e l l sd e r i v e df r o mp i g s ( p kc e l l s ) c y t o f o x i c i t y ，c y t o t o x i c i t yb yw s t - 1k i t ，m i c r o s c o p ec e l ld i s e a s e r e s u i t 1 ：i ns i n g l ed o s es t u d y ，t h ep h a r m a c o k i n e t i cr e s u l tr e v e a l e di tad o u b l e d e p a r t m e n t m o d e la n dt h ek i n e t i cp a r a m e t e r sw e r et l ，：p w a s ( 2 3 5 0 + 3 9 5 ) h ，c l ( s ) w a s ( 1 9 7 + 0 5 5 ) l k g 1 h a n dv fi c ) w a s ( 3 3 0 9 4 - 6 7 7 ) l k g i nr e p e a t e d d o s es t u d y ，t l 2 k ew a s ( 21 7 4 4 - 2 5 4 1 ) h ，c l ( s ) w a s ( 0 7 3 + 0 7 4 ) l k g 一1 h - 1a n d v f w a s ( 9 11 士3 2 4 ) l k g - 1 2 t h er e s u l t so ft h i ss t u d yi np i g l e t si n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sn oi n t o x i c a t e d s i g n i f i c a n tc h a n g eb e t w e e ne x p e r i m e n t a lg r o u p st h a td a i l y a d m i n i s t r a t i o no f r i b a v i r i na tad o s er a n g eo f10 m g k ga n dc o n t r o lg r o u p ，b u td a i l ya d m i n i s t r a t i o n o fr i b a v i r i na tad o s er a n g eo f 3 0t o6 0 m g k gi n d u c e dad o s e r e l a t e dt o x i ce f f e c t t o x i ce f f e c ts h o wt h a tp a n t r o p i ct o x i c i t ya n dp a t h o l o g i c a lc h a n g e so nb l o o d ， b o n em a r r o w ，g a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t ，p a n c r e a s ，h e a r t ，l i v e r ，k i d n e y a n db r a i n 3 t h es t u d yp r o v e dt h a tr i b a v i r i nh a st o x i ca c t i o nt op kc e l l t c 5 0w a s 1 8 9 m g m l c e l l ss h o w e dd e g e n e r a t i o na n dn e c r o s i s c o n c l u s i o n 1 i nt h i se x p e r i m e n t ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o do fd y n a m i cd e t e c t i o nr i b a v i r i ni np i g l e t s i nv i v o p h a r m a c o k i n e t i c c h a n g e st h a tp i gs i n g l eo rm u l t i p l es u b j e c t sa f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o no fr i b a v i r i n m e t a b o l i t e si np i gp l a s m al a w 2 e s t a b l i s h e db yo r a la d m i n i s t r a t i o no fd i f f e r e n td o s e so fr i b a v i r i np i g l e t s p o i s o n i n gm o d e l ，s y s t e m a t i c o b s e r v a t i o no ft h ec l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s ， p a t h o p h y s i o l o g ya n dm o r p h o l o g i c a lc h a n g e si nt h ei n i t i a lr i b a v i r i nr e v e a l e dt h e o c c u r r e n c eo fs i d ee f f e c t so nt h ep i g l e t sa n dp o i s o n i n gm e c h a n i s mo ft h e p a t h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fp i g l e t s 3 a p p l i c a t i o no fw s t - ic y t o t o x i c i t ya s s a yk i ta n dc e l lm o r p h o l o g yt o d e t e c tp a s s a g eo fr i b a v i r i no nt h es w i n ek i d n e yc e l lt o x i c i t yc a u s e db yt o x i c c o n c e n t r a t i o n s ，m o r et h a nh a l fo ft h ei n i t i a lu n d e r s t a n d i n go ft h ep a t h o l o g i c a l c h a n g e so fc e l l s 4 t e s tc o n f i r m e dt h a tr i b a v i r i no nt h ee x p r e s s i o ni np o r c i n et i s s u e s p a n a d d i c t e d t o x i ct or e db l o o dc e l l s ，b o n em a r r o wc e l l s ， g a s t r o i n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l sa n de p i t h e l i a lc e l l so ft h ep a n c r e a si sm o s ts e n s i t i v et ot o x i c d o s e sc a u s ep i g l e t sa n dc l i n i c a lc a s e so fp o i s o n i n gr e p o r t e dag r e a t e rd i f f e r e n c e i nd o s e ，s p e c u l a t e dt h a t c l i n i c a ld r u gp o i s o n i n gd u et o ，a m o n gp i g sa n dt h e o c c u r r e n c eo f d o s er e l a t e d ，t h i sm a ya l s op i g so w nh e a l t hs t a t u s ，。a g ea n d p h y s i o l o g i c a ls t a t eo ft h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so fm e t a b o l i s m ，d i e ta n do t h e r f a c t o r sr e l a t e dd r u g s k e yw o r d sp i gr i b a v i r i n ；p h a r m a c o k i n e t i c s ；t o x i c o l o g i ce f f e c t ；c y t o t o x i c i t y 4 英文缩写英文全称 a a 2 符号说明 中文全称 t h ez e r ot i m ed r u gc o n c e n t r a t i o ni n t e r c e p t s 零时截距 t h ez e r 。i m ed r u gc 。n c e n r a i 。ni n e r c e p s 分布相的零时截距 o ft h eb i p h a s i cc u r v ed i s p o s i t i o n t h ez e r 。1 i m ed r u gc 。n c e n r a t i 。ni n e r c e p t s 消除相的零时截距 o ft h ee l i m i n a t i o nc u f v e a u c a r e au n d e rt h et i m e c o n c e n t r a t i o nc u r v e药时曲线下面积 a u c ( 0 一0 0 、o - t ) t 1 2 t h ea r e au n d e r h e c 。n c e n t r a t i 。n - n n l e 药时曲线下总面积 c u r v ef r o mz e r ot oi n f i n i t y ； h a l fl i f et i m e t l 20【the d i s t r i b u t i o nh a l f - l i f e t l 2 p t h ee l i m i n a t i o nh a l f - l i f e k e k 10 k 12 k 2l 半衰期 吸收半衰期 消除半衰期 t h eh y b r i dr a t ec o n s t a n t sf o r d i s t r i b u t i o n 分布速率常数 p h a s e s t h eh y b r i dr a ec o n s a n sf o re l i m i n a i o n 消除速率常数 p h a s e s t h en r s 。r d e rr a t ec 。n s a n f o r d r u g 药物从中心室向体外消 d i s a p p e a r a n c e f r 。m h ec e n r a l c 。m p a r 除的一级速率常数 t m e n t 0p e r i p h e r a lc o m p a r t m e n t t h ：n r s 。：l e r r a e c 。n s a n sf o r d r u g 由中央室到周边室的_ d i s t r i b u t i o nb e t w e e nt h ec e n t r a la n d p e r i p h e r a lc o m p a r t m e n t 级转运速率常数 t h en r s 。r d e r r a ec 。n s a n sf o r d r u g 由周边室到中央室的一 d i s t r i b u t i o nb e t w e e np e r i p h e r a l c o m p a r t m e n ta n dt h ec e n t r a l ； 级转运速率常数 c l ( s ) t h et o t a l b o d yc l e a r a n c e v c h p l c 整体清除率 t h e a p p a r e n v 。l u m e 。f h e c e n r a l 中心室表观分布容积 c o m p a r t m e n t t h eh y b r i dr a ec 。n s a n sf o r d i s r i b u i 。n 分布速率常数 p h a s e s t h eh y b r i dr a t ec o n s t a n t sf o re l i m i n a t i o n p h a s e s 消除速率常数 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 f b i o a v a i l a b i l i t y s e b s t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i nb r d r p r n a d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e i c 5 0 生物利用度 葡萄球菌肠毒素 r n a 依赖的r n a 多聚酶 t h eh a lfm a x i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n半数抑制浓度 t c 5 0 t h eh a l fm a x i m a li n t o x i c a t i o nc o n c e n t r a t i o n 半数中毒浓度 g o t g l u t a m i co x a l o a c e t i ct r a n s a m i n a s e g p t g l u t a m a t e p y r u v a t et r a n s a m i n a s e t b i lt o t a lb i l i r u b i n t h e l p e rc e l l s c t l c y t o t o x i ct c e ll r d r p r n a d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e 6 谷氨酸草酰乙酸转氨酶 谷( 氨酸) 丙( 酮酸) 转氨酶 总胆红素 辅助性t 细胞 胞毒性t 细胞 r n a 依赖性r n a 聚合酶 ：- 一 日l j吾 利巴韦林( r i b a v i r i n ) ，别名病毒唑、三氮哗核昔、新博林颗粒、r t c 、 v i r a z o l e 、r b v ，是乌苷、次黄嘌吟核苷类似物，化学名称为1 b d 呋哺核 糖基1 一h 1 ，2 ，4 三氮唑3 羧酰胺，利巴韦林的分子式为c s h i2 n 4 0 5 ，相对分 子量为2 4 4 2 l ，熔点为17 4 一l7 6 ，为白色结晶性粉术，无臭、无味，易溶 于水( 大于l 0 9 10 0 m l ，19 ) ，微溶于乙醇，不溶于乙醚或氯仿。 利巴韦林于l9 7 2 年由美国i c n 公司研究开发。i ，19 8 0 年我国正式批准 投产。经过近三十年的研究发展，临床使用的利巴韦林剂型已从初期的滴眼 剂、滴鼻剂、含化片、口服液、片剂和水针剂，一直到19 9 5 年利巴韦林泡 腾颗粒的出现，大大拓展了本品的给药途径和给药方法。在各种制剂中以水 针剂用量最大，己列入我国常用的5 0 种主要制剂之列。 利巴韦林在人体内单剂量口服后吸收迅速，进入宿主细胞后首先被腺苷 激酶磷酸化为r m p ，随之在单磷酸、双磷酸腺苷激酶的作用下转化为r d p 、 r t p l 2 3 1 ，并在小肠被胃肠n a + 依赖性的核苷转运载体转运“1 ，。在哺乳动 物细胞内r t p 是主要的胞内代谢产物，这意味着腺苷激酶是合成反应的限速 酶。利巴韦林单剂量口服后在6 0 9 0 分钟内血药浓度可达到峰值5 7 j ，药时 曲线下总面积为( a u c ) 在一定剂量范围( 2 0 0 12 0 0m g ) 内随着给药剂量的增 加而增加8 1 。利巴韦林单磷酸消除半衰期( t l ，2 ) 约为2 4 小时。利巴韦林能 滞留于红细胞内。主要由肾脏排泄，仅有少量随粪便排出。 利巴韦林为广谱抗病毒药，利巴韦林对多种r n a 病毒和d n a 病毒有抑 制作用9 1 l j ，特别是一些传染性疾病的治疗取得了较好的疗效，对恶性肿 瘤也有一定作用。尽管利巴韦林在临床被广泛应用于抗病毒，但其主要的抗 病毒作用机制还不明确1 2 一i 钊，根据目前研究成果普遍认为主要有4 种作用 机制1 5 1 ：包括间接作用和直接作用两大类。由于利巴韦林相对来说毒性小， 口服、注射、气雾吸入等多种给药途径均有效，因此在临床上应用十分广泛。 利巴韦林对上呼吸道病毒性感染有效率可达9 3 3 3 1 6 】，对手足口病辅 以常规治疗有效率达l0 0 1 5 儿1 7 l 秋季腹泻利巴韦林也取得显著疗效1 8 】， 角膜炎总有效率可达9 7 。1 9 对水痘、扁平疣等皮肤病可使皮疹消退时间 和结痂时间缩短。2 0 1 ，有效率达8 5 n ，利巴韦林对乙肝病毒( h b v ) 和丙 肝病毒( h c v ) 均有效2 2 - 2 33 ，临床一般采用和干扰素联合用药的方式进行 治疗，比单用干扰素取得显著疗效。 利巴韦林在发挥广泛治疗作用的同时，其毒副作用也日益受到关注。世界 卫生组织( w h o ) 药品不良反应数据库中，有关利巴韦林的不良反应达2 6 0 0 0 余例次。利巴韦林对静止期细胞毒性低，1 0 0 - 2 0 0 1 - t g 。m l _ 无毒，但l g g m l 。1 对繁殖细胞就有毒性。利巴韦林的毒副作用主要包括局部刺激毒性2 43 、骨 髓及血液系统毒性、遗传毒性、生殖毒性【2 5 l 、致癌性等。 利巴韦林2 0 0 5 年前还广泛用于动物病毒性传染病，如：鸡痘、鸡传染 性喉气管炎、猪流行性感冒、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻等。2 0 0 5 年底 国家出于保护人用抗病毒药物功效的原因，禁止利巴韦林用于兽医临床。然 而近年来，伴随着规模化、集约化畜牧业的发展，畜禽及其产品的广泛流通， 动物发病种类、病死率有逐年增高的趋势。面对目前抗病毒药物种类偏少、 新型开发抗病毒药物不良反应较多的情况，利巴韦林非法应用的现象仍想当 普遍。特别是近年来，利巴韦林被大量用于防治猪“高热病”、猪瘟、猪流行 性性腹泻等病毒性传染病，即使参照人类推荐应用剂量( 1 0 m g k g 体重) 的 情况下，口服引起猪中毒的报道时有发生。提示猪对利巴韦林敏感。 猪的解剖生理和人类比较相似，猪对利巴韦林又极为敏感。利用猪做为 人类利巴韦林中毒模型具有独特优势，研究成果必将对进一步认识或解释利 巴韦林对人类的毒副作用，以及对该药安全性的重新评估提供重要的文献资 料，进而对人类合理使用利巴韦林进行疾病的临床治疗也具有重要的指导意 义。 实验材料 l 动物与细胞 大约克莱芜黑二元杂交猪，雄性，体重l5 3 士1 4 k g ，购于泰安市养猪厂。 猪源肾细胞( p k 细胞) ，购于上海沪峰生物科技有限公司，型号c y 2 0 l5 3 。 2 药品与试剂 利巴韦林原料，广东肇庆星湖生物科技股份有限公司星湖生化制药厂生 产，批号：l 0 9 0 4 2 0 。 d m e m 培养基，美国g i b c o 公司生产。 胰蛋白酶和h e p e s ，美国h y c l o n e 公司生产。 胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司生产。 磷酸、高氯酸等为市售分析纯。 3 主要仪器 w a t e r s 5l0 高效液相色谱仪，w a t e r s 2 4 8 7 双波长检测器，美国w a t e r s 公司。 超纯水机，德国s g 公司。 a l l e g r a t m 6 4 r 高速冷冻离心机，美国b e c k m a n 公司。 p e 6 8 0 0 v e t 全自动动物血细胞分析仪，上海富众生物科学有限公司。 日立7 6 0 0 全自动生化分析仪，日本日立公司。 z 3 2 3 k 台式冷冻离心机，德国h e r m le ( 哈默) 公司。 a l l e g r a t m 6 4 r 高速冷冻离心机，美国b e c k m a n 公司。 o l y m p u s 双目显微镜，日本o l y m p u s 公司。 t p 3l0 2 电子天平，上海方瑞仪器有限公司。 肝素钠处理的采血管，浙食药监械( 准) 字，批号0 9 0 4 4 2 。 促凝剂处理的采血管，浙江拱东医用塑料厂，批号0 9 0 5 1 0 2 。 4 试剂配制 。 新生犊牛血清：5 6 灭活3 0 m i n ，2 0 保存备用。 2 1 0 4u m l 青霉素、链霉素液( x 2 抗) ：青霉素和链霉素各2 1 0 6 u ，溶于 10 0 m l 灭菌双蒸水中，过滤除菌，分装，2 0 保存备用。 1 0 x n a , _ e d t a 一胰酶溶液( 2 5 ) ：n a 2 e d t a0 2 9 ，n a c l8 0 9 ，k c l 0 2 9 ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 8 9 9 ，k h 2 p 0 4o 2 9 ，l 酚红溶液i 5 m l ，胰酶水中，n a o h 调节p h 至7 2 7 5 ，过滤除菌，分装，2 0 保存备用，使用时1 ：l0 倍稀释。 q 7 5 n a h c 0 3 ：7 5 9n a h c 0 3 溶于10 0 m l 双蒸水中，1 15 高压灭菌l5 m i n ， 置于4 冰箱冷藏备用。 l0 d m e m 营养液( 高糖型，含4 5 0 0 m g ld 一葡萄糖、l 谷氨酰胺，和 l10 m g l 丙酮酸钠，不含碳酸氢钠) ：于l d m e m 溶液中加入lo 犊牛血清， 按照1 比例加入2 1 0 4 u m l 双抗，用7 5 n a h c 0 3 或l0 h c l 溶液调节p h 值至7 2 7 4 。 2 d m e m 维持液：于l d m e m 溶液中加入2 犊牛血清，按照l 比例 加入2 10 4 u m l l 双抗，用7 5 n a h c 0 3 或l0 h cl 溶液调节p h 值至7 2 7 4 。 l o 第一部分利巴韦林在仔猪体内的药物代谢动力学研究 中文摘要 目的 了解利巴韦林在仔猪体内的药物代谢过程，探讨猪对利巴韦林易发中毒的原因， 为进一步研究猪利巴韦林中毒机制提供理论依据。 方法 采用高效液相色谱法( h p l c ) ，测定猪i z l 服单剂景利巴韦林9 0 m g k g 及多次口服 利巴韦林9 0 m g k g 后不同时问点的血药浓度，研究药物的代谢动力学，了解药物在仔 猪体内分布、消除规律。 结果 受试猪单剂景给药后，药时曲线符合一级吸收二室房室模型，主要药动学参数为： t l n l b = 2 3 5 0 + 3 9 5 ) h ，整体清除率( c l ( s ) ) 为( 1 9 7 + 0 5 5 ) l - k g - 1 h 一，表观分布容积( v f ) 为( 3 3 0 9 + 6 7 7 ) u k g 一，多次给药后主要动力学参数分别为消除半衰期( t l 2 k 。) 为 ( 21 7 4 + 2 5 4 1 ) h ，整体清除率( c l ( s ) ) 为( 0 7 3 + 0 7 4 ) l k g h ，表观分布容积( v f ) 为 ( 9 1i4 - 3 2 4 ) l k g 一。 结论 利巴韦林较易在体内产生药物蓄积，在仔猪体内分布范围广泛。 关键词利巴韦林：药物代谢动力学；猪 药物代谢动力学( p h a r m a c o k i n e t i c s ) 是应用动力学原理研究药物在体内吸 收、分布、生物转化和排泄等过程的速度规律的科学。自8 0 年代以来，国 内医药界药物代谓 动力学研究己取得了大量的成果，研究的深度和方法均己 达到国际先进水平。药物代谢动力学研究有利于制定科学合理的用药方案， 为新药设计和临床用药提供客观的评价标准。 利巴韦林作为广谱抗病毒药，对多种r n a 和d n a 病毒有明显的抑制作 用。通常认为利巴韦林是一种疗效确切、毒性较低、副作用较小、比较安全 的抗病毒药物：兽医界曾广泛用于治疗鸡痘、鸡传染性喉气管炎、猪流行性 感冒、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻等病毒性传染病1 2 6 1 。2 0 0 5 年后国家 禁止利巴韦林用于兽医，但该药仍被非法广泛用于动物疾病防治，猪发生利 巴韦林中毒的报道屡见不鲜【1 7 2 8 l ，给广大养殖户造成了很大的经济损失，并 严重影响人类用药安全。 为了解利巴韦林在仔猪体内的药物代谢过程，探讨猪对利巴韦林易发中 毒的原因，本文采用h p l c 法测定仔猪服用利巴韦林后不同时f f i j 点的血药浓 i l 度，研究药物的代谢动力学，了解药物在仔猪体内分布、消除规律，为进一 步研究猪利巴韦林中毒机制提供理论依据。 l 方法 1 1 利巴韦林血药浓度测定方法的建立与考察 1 1 1色谱条件 色谱柱为t h e r m oh y p e r s i lg o l da qc 18 柱( 2 5 0 x 4 6m m ) ；流动相为甲醇 0 1 磷酸水溶液( 2 ：9 8 ) ，流速0 8m l m i n ：柱温2 5 ；检测波长2 0 7n m ； 进样量2 0 1 a l 。 1 1 2 对照品溶液的配制 精密称取利巴韦林标准品2 5m g ，置于5 0m l 容量瓶中，用双蒸水溶解 并稀释定容，得0 5m g m l 利巴韦林储备液，置4 c 冰箱中备用。用前用双 蒸水稀释成系列标准液。 1 1 3血浆样品的预处理 取待测血浆0 5 m l ，加o 5 m o l l 高氯酸o 5 m l ，振荡3 m i n ，l3 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 。取上清液o 5 m l ，加正庚烷o 5 m l ，振荡3 m i n ，1 0 0 0 0 r m i n 离 心1 5 m i n ，取水相1 0 i t l 进样。用外标法定量。 1 1 4 标准曲线制各 取空白血浆1 0m l ，加入适量利巴韦林标准溶液，得浓度分别为l4 0 、 7 0 、3 5 、1 7 5 、0 8 7 5 、0 4 3 8 p g m l 含药血清，按“血浆样品的预处理”项操 作，以样品峰面积( y ) 与样品浓度( x ) 作线性回归。 1 1 5回收率与精密度试验 按“标准曲线制备”方法，分别配制低( 0 8 7 5 t g m l ) 、中( 3 5 t g m l ) 、高 浓度( 1 4 01 a g m l ) 含利巴韦林血浆各6 份，依“血浆样品的预处理”项方法处 理，取2 0 9 l 进样，以标准曲线计算利巴韦林浓度，计算各浓度的回收率和日 内精密度。上述血样同法连续测定5d ，计算日问精密度。 1 2 利巴韦林在仔猪体内的药动学研究 1 2 1 利巴韦林单剂量口服给药的药动学实验 大约克莱芜黑二元杂交仔猪3 头，将利巴韦林与饲料混合后单剂量口 服给药，给药剂量为9 0 m g k g 体重。分别于给药前和给药后0 5 、l 、2 、3 、 4 、5 、6 、8 、2 4 、3 2h 静脉取血2m l ，置肝素化试管中，混匀。在4 c 、3 5 0 0 r m i n 离心5m i n ，取血浆，2 0 。c 保存待测。 1 2 2 利巴韦林多剂量口服给药的药动学实验 大约克莱芜黑二元杂交仔猪3 头，将利巴韦林与饲料混合后口服给药， 每次给药剂量为9 0 m g k g 体重，每日给药1 次，连续给药l0 日。分别于首 次给药前和末次给药后o 5 、l 、2 、3 、4 、5 、6 、8h 静脉取血2m l ，置肝 素化试管中，混匀。在4 。c 、3 5 0 0r m i n 离心5m i n ，取血浆，2 0 。c 保存待测。 1 2 3 利巴韦林的血药浓度测定 取单剂量或多剂量口服利巴韦林的仔猪待测血浆，按照“血浆样品的预 处理”方法处理样品。取2 0 t t l 进样，以标准曲线计算利巴韦林的血药浓度。 1 2 4 药动学模型拟合和参数计算 根据测得的血药浓度时间数据，采用3 p 9 7 药动学程序拟合药动学模型， 求算药代动力学参数。 1 2 5 利巴韦林一般毒性观察 利巴韦林单剂量和多剂量口服给药后，观察仔猪的饮食和一般健康状 况。实验结束时剖检，观察主要脏器的外观变化。 2结 果 2 1 血药浓度测定方法的评价 2 1 1 色谱行为 利巴韦林色谱峰保留时间为6 5m i n ，血浆内源性物质与利巴韦林内源 性物质分离完全，表明血样中成分对利巴韦林测定无干扰。结果见图1 、图2 、 图3 。 e 三蛋酉豳越e 兰蛋田珏甚e j 哑圃 ii “j l j l 一 图1 空白血 图2 利巴韦林标准品 图3 药后血清样品 2 1 2 标准曲线与最低检测浓度 利巴韦林血药浓度在0 4 3 8 1 4 t t g m l 范围呈线性关系( r = o 9 9 5 ) ，回归方 程y = 7 0 2 2 3 2 9 x + 3 2 2 9 0 1 7 ，最低检测浓度0 4 3 8 t t g m l 。 2 1 3 回收率与精密度 三种不同血药浓度的利巴韦林回收率均在9 0 以上。同内和品间精密度 ( r s d ) 分别低于2 8 7 和3 4 4 。结果见表l 。 表1 利巴韦林的回收率与精密度( x s ，n = 6 ) 2 2 药动学研究结果 2 2 1 利巴韦林单剂量和多剂量口服给药的血药浓度与药时曲线 利巴韦林多剂量口服给药的血药浓度明显高于单剂量给药，结果见表2 、 图4 、图5 。 表2 仔猪单剂量和多剂量口服利巴韦林的血药浓度( x s ，n = 3 ) 1 2 2 士o 3 3 2 2 4 + 0 3 2 1 5 1 4 - 0 3 5 1 3 6 士0 2 1 1 2 6 + 0 2 3 1 2 5 + 0 1 9 1 2 2 + 0 2 5 1 1 4 + 0 1 2 0 6 5 + 0 1l 0 4 8 + 0 1 7 4 8 9 + 0 4 3 4 7 8 士o 3 5 8 1 7 士0 3 1 1 1 5 3 + 0 4 2 9 0 2 士o 2 7 8 3 6 + 0 3 2 7 9 2 士o 3 0 7 2 1 士0 2 l 1 4 吣 。 2 3 4 5 6 8 群 弛 2 5 2 o 摹- 5 一 墓l _ o 静 o 5 8l e2 4 2 t嚏i 图4 仔猪单剂量口服利巴韦林的血药浓度时间曲线 。 蓍。 萋 詈。 ) 0 240 名t 宅tl 图5 仔猪多剂量口服利巴韦林的血药浓度时间曲线 2 2 2 利巴韦林单剂量和多剂量口服给药的药动学参数 采用3 p 9 7 药动学程序拟合血药浓度时间数据，结果仔猪单剂量口服利 巴韦林9 0 m g k g ，药动学特征符合二室房室开放模型；多剂量连续口服给药 l o d 的药动学特征符合一室房室开放模型。药动学参数见表3 、表4 。 表3 仔猪单剂量口服利巴韦林的药代动力学参数( x s ，n = 3 ) 表4 仔猪多剂量连续口服利巴韦林l o 天的药代动力学参数( x s ，n =