（环境科学专业论文）污染土壤分子生态学研究.pdf

摘要 2 7 9 ，脲酶活性升高，重金属c d 生物有效量显著降低。 3 石油污染会导致土壤微生物数量、多样性以及脱氢酶活性下降。加入驯 化6 0 d 的麦饭石净化剂( 枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、热带假丝酵母 和白腐真菌等) 培养3 0 d 后，石油烃降解速率和土壤微生物活性提高， 除油率由5 2 5 增至3 8 5 7 ，微生物数量由7 1 2ug d n a g 土增加至 9 2 9l lg d n a r 土，s h a n n o n 指数由2 1 4 升至2 2 1 ，脱氢酶活性也明显 升高。 4 土壤微生物数量和群落结构多样性与土壤肥力及污染状况密切相关。土 壤肥力越稳定，微生物越丰富，多样性越高。土壤污染越严重，微生物 越少，多样性越低。因此，研究土壤微生物群落结构多样性能有效反映 土壤肥力和污染状况，为进一步评价土壤环境质量提供生物学指标。 5 p c r - d g g e 方法能从分子水平快速、灵敏的指示不同土壤的微生物群落 结构的细微差异。p c r d g g e 法只需使用0 2 5 9 土样和1 2 天时间就能 完成对一个土样微生物群落的分子生态分析。研究重金属污染土壤时， 加入复合菌制剂的量仅相差1 m l ，d g g e 谱图也能显示出菌群结构的差 异。 6 运用p c r d g g e 法快速检测土壤污染修复过程中土壤微生物群落变化， 能为及时、准确掌握污染修复效果提供可靠技术支持。同时，如果进一 步对d g g e 条带测序分析，还可以揭示降解污染物的微生物菌属的遗传 密码，鉴别其菌种，探明降解功能基因，这对于彻底解决土壤环境污染 问题意义重大。 关键词：p c r - d g g e 、土壤微生物、肥料、重金属、石油 a b s t r a c t s o i lm i c r o b e sa r et h em a j o rb i o l o g i c a lg r o u pi nt h es o i le c o s y s t e m s t h e yt o o k c h a r g eo fi m p o r t a n tm i s s i o ns u c h a sd e c o m p o s i n ga n i m a la n dp l a n tr e s i d u e s ， m a i n t a i n i n gn u t r i e n t s ，d e c o m p o s i n go r g a n i cm a t t e r , p u r i f y i n gp o l l u t a n t s r e s e a r c h i n g o ns o i lm i c r o b ew el i v e do ni sm e a n i n g f u lf o rm a i n t a i n i n ge c o s y s t e mb a l a n c ea n d p r o t e c t i n gs o i le n v i r o n m e n t a tp r e s e n t ，r e s e a r c h e r su s u a l l yf o c u s e do ns o i lq u a l i t yi n f l u e n to nm i c r o b e h o w e v e r , i ti sr e l a t i v e l yl e s si ns t u d y i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm i c r o e c o l o g i c a l e n v i r o n m e n ta n ds o i le n v i r o n m e n t a lq u a l i t yi n c l u d i n gf e r t i l i t ya n dp o l l u t i o n t h e r e s e a r c hm e t h o d sa r eb a s e do nt r a d i t i o n a lc u l t u r e ，w h i c ho f t e nl e a dt om a s s i v el o s so f m i c r o b e sa n dg r e a t c h a n g e so fc o m m u n i t ys t r u c t u r e t h e yl i m i t t h es t u d yo n m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e m o d e mm o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d sd i r e c t l ya n a l y s i s s o i lm i c r o b i a ld n aw i t h o u tc u l t u r e ，t h a tc o m p e n s a t es h o r t c o m i n g so ft r a d i t i o n a l m e t h o d s d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) h a sb e c o m ea ni m p o r t a n t m o l e c u l a rt e c h n i q u ei ne n v i r o n m e n t a lm i c r o b i a l c o m m u n i t ys t u d y i nt h i sp a p e r , w e a p p l yp c r - d g g et oa n a l y z et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm i c r o b i a la m o u n t , e n z y m e a c t i v i t yd i v e r s i t ya n ds e v e r a lc o n t a m i n a t e ds o i l ( f e r t i l i z e r ，h e a v ym e t a l ，p e t r o l e u m ) ， w h i c hp r o v i d ep o w e r f u lt e c h n i q u er e f e r e n c ef o rm o n i t o r i n ga n dd i a g n o s i n gs o i l e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o ne x a c t l ya n do nt i m e f u r t h e r m o r ew ec a nf u r t h e re v a l u a t e s o i le n v i r o n m e n t a lq u a l i t yb a s e do ns o i le n v i r o n m e n t a lm i c r o b i a l - c o m m u n i t y d i v e r s i t ys t u d y a sp e re x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，i ti ss h o w nt h a t ： 1 a g r i e c o l o g i c a lb a l a n c e w i l lb ed e s t r u c t e du n d e rl o n g - t e r mf e r t i l i z a t i o n a p p l i c a t i o n o fh u m i ca c i dc o m p o u n df e r t i l i z e rh a sl e s se f f e c to ns o i lm i c r o e c o s y s t e mt h a n c h e m i c a lf e r t i l i z a t i o n a f t e ri n c u b a t e d3 0d a y s ，m i c r o b i a la m o u n td e c r e a s ef r o m 3 7 0 i - t g d n a gt o1 8 6 i _ t g d n a ga n ds h a n n o ni n d e xf a l ld o w nt o3 4 7f r o m2 9 2i n c h e m i c a l - f e r t i l i z e ds o i l a p p l i c a t i o no fh u m i ca c i dc o m p o u n df e r t i l i z e r , m i c r o b i a l a m o u n to n l yd e c r e a s et o2 5 4 i t g d n a ga n ds h a n n o ni n d e xf a l ld o w nt o3 11i nt h e h l s o i l h o w e v e r ，b o t hc h e m i c a lf e r t i l i z e ra n dh u m i ca c i dc o m p o u n df e r t i l i z e rc a l l i m p r o v e1 1 r e a s ea c t i v i t ya n di n d i c a t es o i lf e r t i l i t y s o i lf e r t i l i t yi ss t e a d i e ri nt h e a p p l i e dh u m i ca c i df e r t i l i z e rs o i l 2 m i x e dh e a v ym e t a lp o l l u t i o ni n c l u d e 、7 l ，i mc d ，h g , n ii n h i b i tt h ea c t i v i t yo f m i c r o b e ，s u c ha sm i c r o b i a la m o u n t , e n z y m ea n dm i c r o b i a ld i v e r s i t y t h ec o m p o u n d b i o l o g i cb a c t e r i u mp r e p a r a t i o ni n c l u d i n gb a c i l l u ss u b t i l i s ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ， b a c i l l u sm e g a t e r i u m ，p s e l l d o m o n a sf l u o r e s c e n sh a sag o o dr e m e d ye f f e c to nh e a v y m e t a lc o n t a m i n a t e ds o i l a f t e r3 0d a y so fr e m e d i a t i o n ：m i c r o b i a la m o u n ti n c r e a s e f r o m1 7 0 1 t g d n a gt o4 0 5 1 x g d n a g ；s h a n n o ni n d e xi n c r e a s ef r o m1 9 6t o2 7 9 ； u r e a s ea c t i v i t yi m p r o v e ，b u tt h eh e a v ym e t a l ( c a d m i u m ) b i o a v a i l b i l i t yd e c r e a s e d 3 p e t r o l e u mc o n t a m i n a t i o nw i l ll e a dt os o i lm i c r o b ea c t i v i t ya n dm i c r o b i a ld i v e r s i t y d e c l i n e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l ti n d i c a t et h a tt h er e m o v a le f f i c i e n c yo ft p h ( t o t a l p e t r o l e u mh y d r o c a r b o n ) ，d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y a n ds o i lm i c r o b i a ls t r u c t u r a l d i v e r s i t yb e c a m eh i g h e ra f t e r4 0d a y so fr e m e d i a t i o nb ym a i f a n s h is t o n ep r e p a r a t i o n ： r e m o v a le f f i c i e n c yo ft p hd e c r e a s ef r o m5 2 5 t o3 8 5 7 ：m i c r o b i a la m o u n t i n c r e a s ef r o m7 12 p g d n a gt o9 2 9 i - t g d n a g ；s h a n n o ni n d e xi n c r e a s ef r o m2 14t o 2 2 1 4 i ti sd e m o n s t r a t e dt h a ts o i l f e r t i l i t ya n dc o n t a m i n a t i o na r ec l o s e l yr e l a t e dt o m i c r o b i a la m o u n t ，a n dd i v e r s i t y t h ef e r t i l i t yi sm o r es t a b l e ，t h em i c r o b i a ld i v e r s i t yi s r i c h e r a n dt h em u t u a lr e l a t i o n s h i pi st h a tt h em o r es e r i o u ss o i lp o l l u t i o na n dh i g h e r t h ec o n c e n t r a t i o no fp o l l u t a n t si sc o r r e s p o n d i n gt ot h ef e w e rt h em i c r o o r g a n i s ma n d l o w e rt h el e v e lo fm i c r o b i a ld i v e r s i t y t h e r e f o r e ，s t u d yo ns o i lm i c r o b i a lc o m m u n i t y s t r u c t u r ed i v e r s i t yc a ni n d i c a t ef e r t i l i t ya n dc o n t a m i n a t i o ni ns o i le f f e c t i v e l y ，a n d p r o v i d eb i o l o g i c a li n d i c a t o r sf o re v a l u a t i n gs o i le n v i r o n m e n t a lq u a l i t y 5 p c r - d g g ec a nr e f l e c tt h es u b t l ev a r i a t i o no fm i c r o b i a lc o m m u n i t yi ns o i lr a p i d a n ds e n s i t i v eq u i c k l y i to n l yn e e d s0 2 5 9s o i la n d1t 02d a y st of i l i s ho n es a m p l e a n a l y s i s w h e nt h ed i f f e r e n c eo fd o s ei so n l ya b o u tl m l ，d g g ea l s oc a ns h o w d i f f e r e n c e so f m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e 6 t h ee f f e c t so fp o l l u t a n t sr e m e d a t i o nc a nb em o n i t o r e de x a c t l ya n do nt i m eb a s e d o nr a p i dd e t e c ts o i lm i c r o b i a lc o m m u n i t yv a r i a t i o nw i mp c r d g g e a n df u r t h e r a n a l y s i sd g g eb a n d sc a nr e v e a lg e n e t i cc o d e ， i n d e n t i f yg e n u sa n di n d i c a t e i v a b s t r a c t d e g r a d a t i o np r o c e s so fs p e c i e sw h i c hc a nd e g r a d ep o l l u t a n t s i ti sm e a n i n g f u lf o r s o l v i n gs o i lp o l l u t i o n k e y w o r d s ：p c r - d g g e ，s o i lm i c r o b e ，h e a v ym e t a l ，f e r t i l i z e r , p e t r o l e u m v 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学 位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存 论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务； 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在 不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术 活动。 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： - 崎一 m 呵 一 井，廊兰 ：月一 名歹 签 u上 秘年一 作0 d 一 文护 敝竺 位 一 学 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名用涧崎 7 斌3 年月l 日 第一章绪论 第一章绪论 第一节研究土壤微生态环境的目的和意义 1 1 1 土壤环境的重要性及污染现状 土壤是自然环境要素的重要组成之一，它是处在岩石圈最外面的一层疏松 的部分，具有支持植物和微生物生长繁殖的能力，被称为土壤圈。土壤圈处在 大气圈、岩石圈、水圈和生物圈之间的过渡地带，是联系有机界和无机界的中 心环节。它与大气、水体和生物都密不可分；它是地表环境系统中各种自然的、 物理的、化学的以及生物过程、界面反应、物质与能量交换、迁移转化过程最 为复杂、最为频繁的地带，也是环境变化信息较为敏感和丰富的子环境系统。 土壤具有两个重要的功能，一是土壤为农业生产的基础，是人类最基本的生产 资料和劳动对象，也是人类世代相传的生存条件和生产条件，是人类生活的一 项极其宝贵的自然资源。二是土壤具有同化和代谢外界进入土壤的物质的能力。 从环境学角度看，土壤不仅是一种资源，还是人类生存环境的重要组成要素。 由于土壤环境的特殊物质组成、结构、空间位置，除了肥力外，尚具有一些重 要的客观属性一土壤环境的缓冲性、同化和净化性能。正是由于土壤的这些性 能，土壤对于维持人类生存发展以及稳定和保护人类生存环境意义重大。 土壤环境曾被认为具有无限抵抗人类活动干扰的能力。其实，土壤环境也 是很脆弱又容易被人类活动所破坏的生态系统。土壤环境一旦遭受污染便难于 治理其危害是深远的。由于受人为活动与土地利用不当的影响，我国土壤与 环境问题日趋突出，这主要表现在土壤退化与环境污染两方面。据统计，在土 壤退化问题上，全国有1 5 万公顷土地( 占全国的1 3 ) 遭受水蚀，有1 万公顷耕地 遭受盐渍化，风蚀与沙漠化面积达o 3 3 万公顷。耕地养分有不问程度的减退。 在环境污染方面，固体废弃物堆压地达0 0 5 5 万公顷；土壤环境不同程度的受到 了重金属污染、农药有机物污染、化肥污染和放射性元素污染，而且还造成地 下水和地表水污染，直接危及人类的健康【l 】。因此，土壤环境问题( 土壤环境污 染和土壤生态破坏) 已成为突出的全球性环境问题之一。 第一章绪论 1 1 2 土壤微生物在土壤生态系统中的地位与作用 1 1 2 1 土壤微生物在土壤生态系统中的地位 土壤是一个极为复杂的生态系统，是土壤生物与土壤环境相互作用、相互 统一的有机整体。它具有维持土壤养分运转、有机质分解、结构稳定、污染物 的净化，以及维持整个环境生态系统稳定的功能，而这些功能主要通过土壤中 的微生物来实现。土壤微生物是土壤生物中重要的分解代谢类群，包括细菌、 真菌、放线菌和原生动物、病毒和藻类。据估计每克土壤中不同种类的微生物 的数目至少有1 0 0 0 0 种以上，约栖息着1 0 0 亿个微生物【2 】。它们担负着分解动植 物残体的重要使命，推动生态系统的能量流动和物质循环，维持生态系统正常 运转。 1 1 2 2 土壤微生物对土壤生态系统的影响和作用 ( 1 ) 土壤微生物促进土壤有机质分解 土壤微生物能分解土壤中的动植物残体等有机质形成腐殖质化合物，保证 土壤物质循环的正常进行，同时腐殖质化合物中的氮素和碳水化合物部分是微 生物原生质的主要组成部分，它是在微生物死亡之后从细胞中释放出来的。腐 殖酸盐含有大量功能团，既能改善土壤肥力【3 】，又能刺激作物生长。土壤中腐殖 酸的增多直接促进着植物的生长发割引。同时由于土壤微生物的酶活性，也直接 影响着土壤肥力，植物生长发育与土壤改良状况，揭示土壤发育的现状和趋向【5 | 。 ( 2 ) 土壤微生物具有固氮，溶磷，分解钾素的作用 a n d e r s o n 掣6 1 ( 1 9 7 8 年) 曾根据多种土壤的微生物生物量碳、氮值求得土壤微 生物平均c n 值为6 7 ，这明显小于植物中碳氮比，说明土壤微生物在一定程度 上对氮素有储备作用。全世界一年中通过各种途径固定的氮素约2 7 0 3 0 吨，其 中7 0 是生物固氮，而生物固氮主要是利用根瘤菌进行固氮。根据实验室的试 验，自身固氮菌每利用1 9 糖可固定近3 0 m g 的氮素，在土壤中氮素的固定作用 更强烈，估计每公顷土壤每年平均可积聚3 7 - - 5 7 5 k g 左右的氮素。哈迪掣7 认 为，土壤中含有很多钾细菌和磷细菌，能够将土壤矿物无效态的钾和磷释放出 来，供植物生长发育用。钾细菌又叫硅酸盐细菌，硅酸盐细菌能对土壤中云母 长石等含钾的铝硅酸盐及磷灰石进行分解，释放出钾、磷与其他灰分等。有资 料表明，硅酸盐细菌有多方面的作用，它除能把矿物中的钾分解出来，从灰石 2 第一章绪论 中取得磷素营养外，还能从空气中固定氮素，并有增强作物抗病的能力瞵引。 目前报道的解磷细菌主要有芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、假单胞菌属( p s 砌o m o n a s ) 、 埃希氏菌属( e s c h e r i c h i a ) 、欧文氏菌属( e 刑i i l i a ) 及多硫杆菌属( 1 1 1 i o b a c i l l u s ) 等【l 。 其中有些细菌在培养基上的解磷能力很强，高达5 8 9 1 , t g m 1 4 【1 1 1 。而真菌的解磷能 力一般是细菌的1 0 倍【l 2 1 。 ( 3 ) 土壤微生物能降解或转化环境污染物质 土壤微生物能降解无机、有机污染物，减轻污染物对植物的毒害，保持土 壤生态系统的功能。一些微生物可以把非芳环碳上的氯原予以氢原于取代，具 有这种还原脱氯功能的微生物有酵母、普通变形菌、粘质沙雷氏菌( s c r r a t i a m a r c e s c e n s ) 、红平诺卡氏菌( n o e a r d i ae r y t h r o p o l i s l ) 、产气气杆菌 ( i a e r o b a c t t e r a e r o g e n e s ) 和链霉菌等。而降解d d t 的微生物则有1 0 个属中的2 3 个 种的细菌，如假单胞菌属的6 个种，黄单胞菌属的4 个种，欧文氏菌属的4 个 种【1 3 】。对于无机污染物，主要是一些重金属的污染，如汞、铅、铜、锌、铬和 镉的污染。微生物能将重金属进行转化，使重金属从有毒性的形态转化为低毒 性或无毒性的形态。如日本分离到的一种抗汞的假单胞菌【1 3 】p s c u d o m o n a sk 6 2 ， 它能把甲基汞和离子汞还原为元素汞。微生物的这些功能将为植物创造一个良 好的生长发育环境，降低了污染物对植物的影响。 ( 4 ) 土壤微生物能减轻病源菌对植物的危害 根际的土壤微生物在植物的根系周围形成一个物理屏障，在这微生态环境 中保护植物根系，减少了病原菌和虫害的入侵。在这种物理屏障的保护下，植 物的一些病原菌和虫害就很难跨越这道屏障，入侵到植物的根系，植物的根系 可以在一个相对于稳定的微环境中生长。近年来，美国和我国学者的研究结果 都证明，丰富的土壤微生物多样性可以降低土壤中传播植物病害的发生，研究 了解土壤微生物多样性，有利于筛选能适应于土壤生态环境下所需要的生物农 药【1 4 】。 综上所述，由于土壤微生物对于整个土壤生态系统意义重大，因此研究土 壤微生物对于维持土壤生态平衡，获得环境生态效益和经济效益的双赢具有重 要意义。 3 第一章绪论 第二节土壤微生物研究内容及方法进展 1 2 1 微生物数量 1 2 1 1 土壤微生物数量的研究方法 ( 1 ) 显微镜直接计数法n 司 用吸管吸取一定量的土壤稀释液，滴在载玻片上，用酸性染料进行染色， 然后直接用显微镜观察计数。显微镜直接计数法不能区分死细胞和活细胞，一 些放线菌的菌丝体也常被着色，因此该方法测得的微生物数量一般偏高。 ( 2 ) 埋片法 埋片法是将一洁净的载玻片埋入土壤内，不破坏土壤的自然结构，使微生 物黏附于玻片的表面并生长发育。从这样的自然涂片中可以获得较为真实的土 壤微生物的排列和空间分布情况，但不能对菌种进行鉴别，也难以得到准确的 微生物数量。 ( 3 ) 毛细管法 土壤颗粒之间充满着纵横交错的大小孔隙。空气、水分和养分随毛细管不 断流通，构成毛细管系统。土壤微生物要依赖毛细管系统传递的空气、水分和 养分才能生存。毛细管法就是根据此原理设计的，它是用一组特制的毛细管板 灭菌后插入已熔化的琼脂内，琼脂由于虹吸作用而被吸入到管内。然后，将毛 细管板插入所要研究的土壤中。经数日或数月后取出，染色后镜检。该方法耗 时较长，所培养的微生物也难以反映土壤微生物生态分布的实际情况。 ( 4 ) 荧光显微镜观察法 该方法利用荧光染料对菌体进行染色，然后用荧光显微镜观察。由于一般 情况下活菌比死菌吸收染料少，两者产生的荧光颜色不同，故用荧光素染色的 样品可将死活菌体分开。 ( 5 ) 现代分子生物学研究方法 由于通过传统的培养、分离方法鉴定的微生物只占土壤环境微生物总数的 0 1 - - 1 口6 3 “”3 ，这些方法往往会低估土壤微生物的群落结构组成，导致试验结 果与实际土壤微生物数量相距甚远，准确性差。随着微生物研究技术的发展尤 其是分子生物学技术的发展，不经过传统培养，直接提取土壤细菌总d n a 分析 4 第一章绪论 其产率的方法是近几年来逐步发展起来的全新试验手段。通过这种实验技术， 可以有效地避免在传统富集、培养、分离、研究过程种造成的微生物种群构成 发生变化的弊病，能够更直接可靠的反映出土壤微生物的原始组成情况。 1 2 1 2 壤微生物数量与土壤生态系统的关系 ( 1 ) 农田生态条件与微生物数量 在农业生态系统中，土壤微生物中的养分元素一般只占土壤中相应元素含 量的极小部分，但因为土壤的养分储备中绝大部分处于稳定或半稳定状态，活 性和有效性均较低。而微生物中的养分则非常活跃。土壤微生物通过自身的代 谢，即对有机物的降解和对无机养分的同化作用，在土壤物质循环中起着决定 性的作用，不仅其本身所含的氮、磷、硫是植物的有效养料库，而且土壤微生 物对土壤有机质和养分的转化作用是土壤有效氮、磷、硫的重要来源。 土壤含水量对微生物数量的影响最为重要。o 0 1 o 0 5 m pa 接近微生物的最 佳湿度。细菌的耐受土壤含水量低限为o 5 8 m pa ，土壤干湿交替作用能造成 土壤微生物的大批死亡和更新。 当温度过高( 大于3 5 ) 或过低( 小于6 ) 时，微生物量会明显降低。g r i s i 等 1 鄹( 1 9 9 8 ) 比较了巴西热带雨林土壤和英国温带土壤中微生物量对外界温度 的反应特性，结果表明，热带土壤的微生物数量变化程度明显小于温带土壤， 经3 5 培养1 5 0 d 后，巴西土壤的微生物量下降为原来的6 0 ，而英国土壤的微 生物量仅为3 0 。 土壤ph 值能明显影响土壤微生物的数量，强酸性及盐碱土的微生物数量均 较低。对于我国红壤来说，微生物总体数量不高，这跟土壤酸性有关。 土壤有机质含量也是影响微生物数量的关键因子，因为土壤中的微生物大 多数为异养微生物，其维持生命活动需要消耗大量的有机物质以提供能量。有 资料显示，对草地、林地、耕地三种不同的生态系统而言，土壤微生物数量的 变化从大n d , 依次是：草地、林地、耕地。造成这种结果的原因可能是由于耕 地土壤中的植物果实及秸杆被取走，微生物的能源相对缺乏，而草本植物则为 微生物的繁殖提供了大量的凋落物和根系分泌物。同理，通过适用有机肥和秸 秆还田来增加土壤有机质含量，从而增加土壤微生物量提高农作物产量的方法 是极为科学可行的。 由此可见，土壤微生物数量与土壤的含水量、温度、p h 值、有机质含量等 第一章绪论 理化性质密切相关，对土壤健康状况有一定的指示作用。 ( 2 ) 微生物数量与土壤环境污染 重金属污染对土壤微生物的数量及活性有着显著的影响。研究表明，有些 重金属在浓度较低时对微生物生长有一定的刺激作用，但一旦超过一定浓度是 则有明显毒害作用。b i s e s s a r 等【1 9 】( 1 9 8 2 ) 通过研究发现，当遭受7 0 3 9 9 g - 1 p b 、 5 7 鹇g - 1 a s 和7 3 9 9 g - 1 c u 、5 t x g g - 1 c d 复合重金属污染时，土壤中的细菌、真菌、放 线菌的数量显著降低。f r i t z e 等1 2 0 】( 1 9 8 9 ) 在研究c u - n i 矿山土壤中发现，c u - n i 复合污染地区的土壤微生物量较对照区下降了2 0 。可见，土壤微生物数量对 重金属污染反应有一个重要特征，即污染土壤中微生物量与重金属含量存在负 相关关系。 除重金属外，农药杀虫剂、杀菌剂和除草剂等对微生物数量均能产生一定 影响。俞慎等在研究红壤微生物两对多效唑及杀虫剂等有机农药的反应中表明， 多效唑和杀虫脒施入土壤时，会影响土壤微生物的生存与繁殖，导致红壤微生 物量下降。一般来说，农药污染对土壤微生物量的影响不及重金属那么严重， 这可能与农药的降解有关。 1 2 2 土壤微生物酶 1 2 2 1 土壤微生物酶的来源与种类 土壤微生物酶是土壤生态系统的重要动力，是土壤中的微生物产生的能催 化土壤中的特定生物化学过程的特殊蛋白质。土壤中一系列生化反应过程都要 在酶的催化下才能完成。土壤微生物酶活性与土壤质量的许多理化指标相关， 酶的催化作用对土壤元素，包括碳、氮、磷、硫等的循环与迁移有着重要作用。 土壤酶绝大部分来自与微生物，土壤动植物也是来源之一，但贡献十分有限。 目前已知存在的于土壤中的生物酶有5 0 多种，这些土壤酶可分为两类：一 类是与游离的增殖细胞相关的生物酶，主要分布在细胞质中、外周胞质空间和 细胞的外表面；另一类是与活细胞不相关的非生物酶，主要包括在细胞生长和 分裂过程中分泌的酶、细胞碎屑和死细胞中的酶、来自活细胞或细胞溶解进入 土壤溶液的酶，它们能稳定地吸附于土壤黏粒内外表面，或者通过吸附、聚合 存在于土壤腐殖质胶体内。如果按照反应机制来分，则可分为4 类，即氧化还原 酶、转移酶、水解酶及裂解酶。本文的主要研究对象为脲酶和脱氢酶。 6 第一章绪论 ( 1 ) 脲酶 脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解生成氨、二氧化碳和水。土壤 脲酶活性与理化性质关系密切，可灵敏反映土壤肥力水平状况【3 卜3 3 1 。土壤脲酶 在土壤系统氮素循环过程中起着重要作用瞰】，与土壤有机质、全氮及有效氮之 间存在着明显的正相关关系【3 5 1 。实验表明，深耕结合施用有机肥料，可使白浆 土微生物总数和蔗糖酶、脲酶活性成倍增加【l5 1 。在一定的农业环境条件下，重金 属物质会对土壤脲酶活性产生一定的影响和破坏。杨正亮【3 6 】等人通过对c d 、c r 、 p b 3 种重金属元素对土壤脲酶活性的抑制性进行试验，分析不同重金属用量、培 养时间、单因素以及复合因素条件下对脲酶活性的影响。结果表明：3 种重金 属在不同情况下对脲酶活性均有不同程度的抑制作用。 测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为 常用。 ( 2 ) 脱氢酶 脱氢酶是土壤中的主要酶类之一，它能酶促有机物脱氢反应。在土壤中， 糖类和有机酸的脱氢作用比较活跃，它们均可以做为氢的供体。脱氢酶能自基 质中析出氢而进行氧化作用，它只能由活的生物体内产生【3 丌，其活性可以看作 是土壤微生物活性和功能多样性的重要指标 3 引。微生物降解石油烃的过程中， 石油烃通过脱氢酶活化氢原子并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转 化。研究发现，脱氢酶活性与土壤中石油烃衰减量有良好的相关性【2 9 】 【3 0 1 ，并且 可以作为微生物对底物适应性的指标【3 9 】。 目前，测定脱氢酶的方法很多，较为常用的是氯化三苯基四氮唑( 1 v r c ) 法 和氯化碘硝基四氮唑( i n i ) 法。 1 2 2 2 土壤酶与土壤生态系统的关系 ( 1 ) 土壤酶与土壤微生物间的关系 早在2 0 世纪6 0 年代就有人研究酶活与土壤微生物活性之间的相互关系， 已有大量研究证实了土壤微生物呼吸量和总生物量与土壤酶活性显著相关。实 验表明，深耕结合施用有机肥料，可使白浆土微生物总数和蔗糖酶、脲酶活性 成倍增加。在种植羽扇豆、苜蓿、荞麦和玉米的根际土壤中细菌数为每克土壤 ( 4 8 3 5 9 ) x 1 0 6 个，显示出较高的脲酶活性，而种植麦类作物( 小麦、黑麦、 燕麦) 的根际土壤细菌数为每克土壤( 1 9 2 6 4 ) x 1 0 6 个，显示的脲酶活性较 7 第一章绪论 低 1 5 】。汤树德【2 l 】( 1 9 8 4 ) 的研究也表明，土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶与土 壤呼吸强度存在线性关系。自19 6 5 年l c ：1 1 1 1 a r d 【l5 】开始，脱氢酶活性就被用于评 价微生物活性，这种酶是胞外酶，其活性与氧的消耗及细菌群落的活性密切相 关。 ( 2 ) 土壤酶与土壤质量的关系 土壤酶活性可以作为土壤肥力指标。土壤水分、温度、空气对土壤酶活性有 显著影响。一般来说土壤湿度较大，土壤酶活性较高，但土壤过湿，酶活性则 减弱。温度对土壤酶的影响较为复杂，其最终效应常与土壤含水量有关。当土 壤物理状况不良、空气循环受阻时，有机质的积累大于分解，酶活性则难以显 示出来。渍水土壤在土壤物理性状改善之前，酶活性很低，并长期保持不变。 一旦排水后，土壤水分与空气逐渐协调，使得土壤酶活性有不断增高的趋势。 土壤的机械组成及结构状况也能影响土壤酶活性。研究表明，同一土类的粘 质土壤比轻质土壤具有较高的酶活性，这是因为酶主要分布在腐殖质含量较高 和微生物数量较多的细小颗粒中。另外，小颗粒具有较强的稳定酶活性的能力。 因此，往矿质土中加入粘质土，能较大地增强蛋白酶、脲酶和蔗糖酶的活性。 土壤的结构性很大程度上决定了土壤微生物的数量和分布。实验表明，土壤团 聚体稳定性与土壤微生物生物量呈显著正相关。此外，由于土壤微生物分布的 镶嵌性，酶不是呈扩散分布，而是存在于不同土壤团聚体的领域里，这就使得 土壤酶活性与土壤结构密切相关。 土壤化学性质可以从多个方面影响土壤酶活性。首先，在很大程度上能直接 影响酶的主要生产者一微生物、植物的营养状况；其二，土壤中的某些化学物 质可通过激活或抑制作用来调节胞外酶的功能。并且，酶在土壤中的固定情况 在很大程度上取决于土壤的一系列化学性质，如土壤p h 值、交换性阳离子的组 成与比例、盐基饱和度、腐殖质的特性以及有机一矿质复合体的组成。张成娥 等【3 5 】( 1 9 9 8 ) 的试验表明土壤蔗糖酶、脲酶和中性磷酸酶均与土壤有机质、全 氮及有效氮之间存在着明显的正相关关系。土壤酶活性与土壤酸碱度有关。土 壤p h 值能直接影响底物的移动性和溶解性，并与微生物的数量和组成密切相 关。 同样，人类的农业生产话动极大地影响着土壤性质及作物地生物学特性。土 壤一微生物一作物是一个复杂地有机整体，农业活动会引起土壤理化性质的变 化，从而改变原有的平衡，建立起新的动态平衡。合理施肥，特别是施用有机 8 第一章绪论 肥料，不仅能改善土壤理化、生物学特性，而且能明显增强土壤酶活性。耕作 能为各种微生物创造良好的环境条件，推动有机物质在微生物和酶作用下发生 转化。合理轮作能够促进土壤生物化学过程，尽管不同轮作制的周期、年限不 同，轮作区土壤酶活性一般总是明显高于连作区土壤酶活性。 土壤酶活性能指示土壤环境污染状况。土壤酶是存在于土壤中的生物催化剂， 可有效地促进土壤中的有机污染物进行净化【弘2 3 1 。相应的土壤环境污染物的进 入，也会对酶活性会产生一定的影响 2 4 2 5 】。随着冶炼、化工及能源工业的急剧发 展，重金属污染对土壤植物人体系统产生了诸多不利影响。重金属污染对酶活 性有一定的抑制作用体现在重金属含量达到一定水平石则易使酶失活。重金属 抑制土壤酶活性的机制可能是重金属与酶催化活性部位的巯基反应有关。林立 金等 2 6 】通过盆栽试验，研究了锌铬复合污染对水稻不同生育期土壤酶活性的影 响。结果表明，土壤过氧化氢酶活性与土壤中锌、铬浓度均有极显著的线性回 归关系，并呈显著或极显著负相关关系。在农业实践中，农药对土壤酶活性有着 直接或间接影响。其直接影响是抑制酶活或对土壤酶活性激活。间接影响主要 是通过改变土壤生物和植物根系功能以及土壤生物的组成来影响土壤酶的含量 与活性。土壤受到石油的污染后，土壤系统中酶活性会受到一定的影响【2 。7 】【2 8 1 ，有 研究表明，土壤脱氢酶与石油烃衰减量有显著的相关性 2 9 】、【3 0 】。目前对土壤酶与 环境污染治理之间相互关系的研究主要集中在土壤酶对土壤污染物的转化作用 及根据土壤酶活性变化来判断污染物对土壤的毒害两方面，并越来越受到土壤 环境工作者的重视。 大量的研究表明，土壤酶活性与土壤物理特性和水热状况，土壤的化学组成 及外源化学物质( 肥料、污染物) 等有着密切的关系，土壤微生物酶活性对土 壤质量有一定的指示作用。因此土壤微生物酶活性可以作为土壤肥力的评价指 标，或用以治理土壤污染物，以及指示土壤受污染物毒害程度，这些都是人们 一直关注的土壤酶研究课题。 1 2 3 土壤微生物多样性 微生物多样性是指在某一特定地理区域内，生活在同一环境下不同微生物 种群在组成、结构、功能和动态方面表现出的丰富多样的差异。土壤微生物多 样性包括微生物群落功能多样性、菌落结构多样性及遗传多样性，是指示土壤 9 第一章绪论 生态系统稳定性及其功能的重要传感器。通常通过群落中物种的种数和均匀度 相结合的分析方法来评价。由于方法上的限制和微生物自身的变异性，目前还 不可能将土壤中的全部微生物培养出来，而且对于土壤微生物种属的鉴定分类 也是一件不易的工作。因此，在实际研究中，通常是从某一侧面或某一角度来 近似或间接地描述土壤微生物的多样性状况。 1 2 3 1 土壤微生物多样性研究方法 传统的土壤微生物多样性研究方法如分离培养计数法、显微镜法。这些方 法往往会低估土壤微生物的群落结构组成，准确性差。虽然使用电子显微镜或 荧光抗体染色法可以对土壤微生物形态多样性进行观察，但是这两种方法并不 能描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生 理差异。随着微生物研究技术的发展尤其是分子