（特种经济动物饲养专业论文）降解丝素蛋白微生物的分离筛选及分类鉴定.pdf

摘要 随着蚕丝综合利用的进展，丝蛋白降解产物的用途日益广泛。目前 降解丝素生产丝肽主要采用盐解法、酸解法、碱解法等化学方法，但盐解 法只能得到大分子的再生丝素粉，酸解法和碱解法则不可避免地会造成氨 基酸的破坏，并且这些方法都需要脱盐、脱酸等复杂的后处理。因此，采 用酶解法生产丝肽是一种比较理想的方法，但丝素蛋白是一种典型的b 一 角蛋白，很难被普通的蛋白酶降解。虽然目前已从蚕蛾及微生物中分离到 可以降解丝索的蛋白酶，但由于来源有限或稳定性差等原因，无法在实践 中应用。有鉴于此，本文首次从土壤中分离到7 株能以茧丝作为唯一碳源 和氮源的微生物，探讨了这些微生物对丝素、羽毛等角蛋白的分解能力， 并对其中一株降解能力最强的微生物的生物学特性和分类学地位进行了 研究，从而为进步深入研究微生物源丝蛋白酶奠定了基础。主要取得如 下结果： 1 以泰山柞树林和山东农业大学草坪的表层土为材料，通过建立适 合目的微生物生长的条件，进行富集增菌；采用涂布与划线相结合的方法 分离纯化培养物。最终得到7 株可以利用丝素蛋白作为唯碳源和氮源进 行生长的培养物。 2 对分离得到的7 株可以降解丝素蛋自的微生物，根据其在不同温 度、营养条件下对丝绸条的降解效果，以及对未经高温蒸煮的丝绸条的降 解情况，进行了进一步的筛选。发现在这7 株微生物中，编号为c 3 的放 线菌降解丝素蛋自的活性最高。在缺乏碳源的情况下，可以在1 4 d 之内使 丝绸条完全降解断裂，这与意大利学者分离得到的微生物相比，有更高的 活性；c l 、c 2 、c 3 等3 个菌株对未经高温蒸煮的丝绸条也有较强的降解 能力。 3 ，各菌株对其他角蛋白的降解试验表明，对羽毛角蛋自无论是否经 过高温蒸煮，这7 株微生物都有良好的降解效果，只是未经高温蒸煮的羽 毛，降解速度有所降低。各菌株对以羊毛为代表的a 一角蛋白也有一定的 降解能力，但活性较低，但羊毛经过高温蒸煮之后，更易于被降解。 4 测定了c 3 菌株对丝素蛋白的降解活性以及温度和营养条件对其降 v l 解活性的影响。在2 8 3 7 。c 之间c 3 菌株对丝绸条均保持较高的降解活性； 在营养条件中，大量碳源的存在会明显降低其活性，但少量碳源的影响不 明显；氮源对其影响不大；在缺乏碳源的高氏一号合成培养基中，对丝素 蛋白的降解效果最好。在1 丝素蛋白作为唯一碳源和氮源的色氨酸培养 基中，2 8 c2 0 0 r p m 恒温培养条件下，在接种后第6 天至第1 2 天，培养 液中游离氨基酸和多肽的浓度增幅最大，即在此阶段对丝素蛋白的降解活 性最高。与已报道的v a r i o v o r a xp a r a d o x u s 相比，达到峰值的时间明显缩 短。电镜观察表明，接种c 3 菌株第1 4 d 的丝绸条在一些部位出现明显的 降解凹陷；接种2 1 d 时，丝纤维已不成形，表面覆盖大量的粘液状降解物。 5 对分离到的7 株微生物的类型进行了鉴定，通过孟加拉红、链霉 素以及重铬酸钾的敏感性试验证明，这7 株菌均属于放线菌。重点探讨了 降解丝素能力最强的c 3 菌株的生物学特点和分类地位，1 6 sr d n a 的序列 同源性比较表明，c 3 菌株与一株拟无枝酸菌a m y c o l a t o p s i s f a s t i d i o s a 的同 源性最高，在菌丝、孢子丝、孢子形态、生理生化特征、细胞化学特征等 方面，c 3 菌株与放线菌的分类与鉴定中关于拟无枝酸菌属的描述基 本相同，故初步将c 3 归属于拟无枝酸菌属。但c 3 菌株在培养形态特征和 生理生化特征方面，与拟无枝酸菌属的其他种均存在一定的差异，特别是 对淀粉的水解方面完全不同。因此，c 3 菌株可能是拟无枝酸菌属的一个 新种。 关键词：丝蛋白；放线菌；生物降解；拟无枝酸菌；丝蛋白酶 v h a b s t r a c t w i t h 也ed e v e l o p e m e n to ft h em u l t i u t i l i z a t i o no fs i l k t h eu s eo f 也e d e g r a d a t i o np r o d u c t so f f i b r o i nb e c o m em o r ea n dm o r e a tp r e s e n t ，i no r d e rt o p r o d u c et h ep e p f i d eo fs i l k ，t h es a l t , a c i do ra l k a l ia r eu s e dt od e g r a d a t et h es i l k b u tp e p t i d ec h a i np r o d u c e db ys a l td e g r a d a t i o ni st o ol o n gt ou s e ，w h i l eu s i n g a c i d eo ra l k a l it od e g r a d a t et h es i l k t h ea m i n oa c i dw i l lb ed e s 订o y e d w h a t s m o r e ，t h es u b s e q u e n tp r o c e s s e so ft h e s em e t h o d ss u c ha sd o f f i n gs a l to ra e i d e a r ev e r yc o m p l e x s ot h eb e s tm e t h o do fp r o d u c i n gs i l kp o l y p e p t i d ei st o d e g r a d a t es i l kb ye n z y m e h o w e v e r , a sat y p i c a l1 3 - k e r a t i n , t h ef i b r o i ni sh a r d t ob ed e g r a d a t e db yo r d i n a r yp r o t e i n a s e a tp r e s e n t , t h ep r o t e i n a s e sw h i c hc a l l d e g r a d a t e t h es i l kh a v e b e e n s e p a r a t e d f r o ms i l k w o r mm o t ha n d m i c r o o r g a n i s m b u tt h eo r i g i na n ds t a b i l i t yl i m i tt h e i ru s e h e n c e ，w ei s o l a t e d 7s t r a i n sm a tc a nu t i l i z et h ef i b r o i na st h eo n l yc a r b o na n dn i t r o g e nr e s o u r c e s t h e i rc a p a b i l i t yo fd e g r a d a t i n gf i b r o i n w o o da n df e a t h e ri ss t u d i e d a n do n e s t r a i nt h a ti st h em o s te f f i c i e n tt od e g r a d a t ef i b r o i nw a sc l a s s i f i e d n eb a s ef o r f u r t h e rs t u d yo fm i c r o b i a ls i l kp r o t e i n a s ew a se s t a b l i s h e d n l em o s t l yr e s u l t s a r ea sf o l l o w s ： 1 t h es o i li st h et o p s o i lo f o a kh u r s ti nt h em o u n tt a la n dt h el a w ni n s h a n d o n ga g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y b e f o r ei s o l a t i n g ，t h ec o n d i t i o nt h a ts u i t a b l e t ot h em i c r o b i a lg r o w t hw a sc r e a t e di no r d e rt oi n c r e a s et h ea m o u n to fi n t e n t m i c r o o r g a n i s m n em i c r o o r g a n i s mw a ss e p a r a t e db ys p r e a dp l a t em e t h o d a n ds t r e a kp l a t em e t h o d a tl a s t ，s e v e ns t r a i n s ，w h i c hc a l lu t i l i z ef i b r o i na st h e o n l yc a r b o na n dn l t r o g r e nr e s o u r c e s ，a r eo b t a i n e d 2 t h es e v e ns t r a i n sw e r ef i l t r a t e da c c o r d i n gt ot h ec a p a b i l i t yo f d e g r a d a t i n gs i l kp i e c e si nd i f f e r e n ts u b s t r a t e ，t e m p e r a t u r ea n dt h es i l kp i e c e s w h i c hi si nn a t u r a lc o n d i t i o n s n l cs t r a i n sn u m b e r e dc 1 c 2a n dc 3a r ea l l a b l et od e g r a d a t et h en a t u r es i l k , b u tt h ec 3h a st h eb i g g e s tc a p a b i l 时o f d e g r a d a t i n gf i b r o i n i tc a l lr u p t u r et h es i l kp i e c ew i t h i n1 4d a y s ，a n di ti sm o r e e 伍c i e n tt h a nt h em i c r o o g a n l s mi s o l a t e db ya l li t a l i a ns c h o l a r 3 t h er e s u l t so fe x a m i n a t i o no fd e g r a d a t i n go t h e rk e r a t i ni n d i c a t e dt h a t t h e s es t r a i n sc o u l dd e g r a d a t e 也ef e a t h e r , w h e t h e ri tw a sb r a i s e di n1 2 1 o r n o t b u tt h ef e a t h e rw i 也o u tb r a i s i n gw a sd e g r a d a t e dal i t t l es l o w e r t h e s e v l i i s t r a i n sc a na l s od e g r a d a t et h ea k e r a t i ni nw 0 0 1 b u tt h ea c t i v e n e s si sl o w e r b u t w h i l e 也ew o o li sb r a i s e da t1 2 1 。i tw i l lb ee a s i e rt ob ed e g r a d a t e d 4 1 1 1 ec a p a b i l i t yo fs t r a i nc 3i nd e g r a d a t i n gf i b r o i nw a sm e n s u r a t e di n d i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dm e d i u m n l ed e g r a d a t i n gc a p a b i l i t yk e e p sa tah i g h l e v e lb e t w e e n2 8 a n d3 7 u n d e rt h en u t r i t i o n a lc o n d i t i o n s i tw i i id e s c e n d w h e na b u n d a n t c a r b o ni sa d d e dt ot h em e d i u m b u tt h e r ei sn od e f t n i t ec h a n g e i nt h el o wc o n c e n t r a t i o n a n dt h en i t r o g e nh a sl i t t l ee f f e c to ni t 珏ec a p a b i l i t y r e a c h e st h eh i 吐e s t 】e v e li n 廿1 eg a u s e ss y m t h e t i cm e d i u mw h i c hh a sn oo t h e r c a r b o nr e s o a r c e i n c u b a t e di nt h et r y p t o p h a rm e d i u mw i 出lp e r c e n tf i b r o i na s t h eo n l yc a r b o no n2 8 a n d2 0 0r p m t h ea m p l i t u d eo fc o n c e n t r a t i o no f a m i n oa c i da n dp e p t i d ei st h em o s tf r o mt h e6 t hd a yt ot h e1 2 t hd a y i no t h e r w o r d s ，t h ec a p a b i l i t yo fd e g r a d a t i n gf i b r o i ni st h em o s te f f i c i e n tt h e s ed a y s t h et i m eu s e dt or e a c ht h eh i g h e s ta c t i v i t yi sm u c hs h o r t e rt h a nt h ef a r i o v o r a x p a r a d o x u s o b s e r v e du n d e rt h es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y , t h e r ea p p e a r e d o b v i o u sh o l l o w so nt h es i ( 矗b r e sa f t e ri n o c u l a t e db ys t r a i nc 3f o r1 4d a y s 2 1 d a y s1 n e gt h es i l kf i b e r sl o s tt h e i rs h a p ea n dw a sa l m o s tc o m p l e t e l yc o v e r e d b yt h eg r u m eo f t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t i o n 5 t h e7s t r a i n sh a v eb e e ni d e n t i f i e d t h es u s c e p t i v i t yt ot h er o s eb e n 9 0 1 s t r e p t o m y c i no rp o t a s s i u md i c h r o m a t ei n d i c a t e dt h a ta l lt h e7 s t r a i n sr e m a i n w i t ht h ea c t i n o m y c e t e n l es t r a i nc 3 w h i c hh a st h eb i g g e s tc a p a b i l i t yo f d e g r a d a t i n gf i b r o i n ，w a sc l a s s i f i e d t h es e q u e n c eo f16 sr d n a i st h em o s t h o m o l o g o u sw i t ha m y c o l a t o p s i sf a s t i d i o s a i ti sa b o u tt h e s a t n et ot h e d e s c r i p t i o no fa m y c o l a t o p s i sh ac l a s sa n di d e n t i f yo f a c t i n o m y c e t e so ns h a p e o fh y p h a s p o r e ，c h a r a c t e r i s t i c s o fp h y s i o l o g ya n d b i o c h e m i s t r y , a n d c o m p o n e n to fc e l l u l a rw a l i _ b u tt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sh a v es o m e d i f f e r e n c e sa m o n ge v e r yo t h e rs p e c i e so f a m y c o l a t o p s i s ，e s p e c i a l l yi na m y l u m h y d r o l y z a t i o n s ot h es t r a i nc 3m a y b ean e w a m y c o l a t o p s i ss p e c i e s k e yw o r d s ：s i l k ；a c t i n o m y c e t e ；b i o d e g r a d a t i o n ；a m y c o l a t o p s i s ；f i b r o i n a s e 缩写 c a m p c k c p c s d d a p d d h 2 0 d m a h i s p k d a m l n n c b i 英文缩略语 英文 c y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e c o n t r o l p r e c i p i t a t i o np a r t w a t e r - s o l u b i l n yp a r t d a y d i a m i n o p i m e l i ca c i d d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r n ，n d i m e t h y l f o r m a m i d e h o u r i n t e r n a t i o n a ls t r e p t o m y c e sp r o j e c t k i l od a l t o n m i n u t e n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n n m m o n - m e t h y lm o r p h o l i n en - o x i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r i m e ro f f a v o r h y d r o g e np o w d e r p r i m e ro f r e v e r s e r e v o l u t i o np e rm i n u t e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y v i t a m i nc x 中文说明 环腺苷磷酸 对照 沉淀部分 水溶性部分 天 二氨基庚二酸 双蒸水 n ，n 一二甲基乙酰胺 小时 国际链霉菌计划 千道尔顿 分钟 美国国家生物技术信 息中心 n 甲基吗啉- n 氧化 物 聚合酶链反应 正向引物 酸碱度 反向引物 转每分钟 扫描电子显微镜 维生素c r 1 王 嗽阡出n 唧眦 关于学位论文原创性和使用授权的声萌 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做 重要贡献的个人和集体，均在文中明确说明。本声明的法律 任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文 质本和宅子版，允许论文被查阅和借阕。本人授权山东农业 学可以将本学位的全部和部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印、缩印或其他的复制手段保存论文和汇编本学 论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名 导师签名 日 期：卵7 f 山东农业大学硕士学位论文 第一章引言 1 本研究的目的和意义 蚕丝是人类最早利用的天然蛋白质纤维之一，以蚕丝为原料制作的丝 绸服装穿着舒适、优美、典雅，对皮肤有良好的保健功能，深受古今中外 人们的喜爱。近年来，随着蚕丝科技的迅速发展及其与生物医学技术和其 它高新技术的交叉渗透，国内外对蚕丝蛋白特别是丝素的新功能研究日趋 活跃。2 0 世纪8 0 年代中期，日本研究人员首先研制成功水溶性丝素蛋白粉， 而后国内亦相继研制成功，并将其添加在化妆品中制成丝肽化妆品，受到 人们的青睐，此类产品至今畅销不衰。目前，蚕丝蛋白已在食品( 游斌， 2 0 0 2 ) 、日用化工( 陈芳艳等，2 0 0 2 ) 、医药卫生( 李明忠等，2 0 0 0 ) 、发酵 工业( 张雨青，1 9 9 9 ) 、生物材料( 闵思佳等，1 9 9 9 ；宋兆萍等，2 0 0 0 ) 等 诸多领域进行了开发利用，成为蚕业科学研究的热点领域之一。 由于蚕丝降解产物特别是丝肽的用途日益扩大，因此国内外对丝肽的 生产技术进行了广泛的研究，目前主要有中性盐解法、有机溶剂法、酸解 法、碱解法以及酶解法等。利用盐和有机溶剂对丝素蛋白进行降解，主要 是破坏丝素蛋白的高级结构，降解产物主要是分子量在1 6 万之间的大分 子肽，产品为再生丝素。利用中性盐降解丝素蛋白，其主要技术瓶颈是脱 盐工序复杂繁琐，而有机溶剂对丝素蛋白的溶解性很低，尚未有实用的报 道。利用酸、碱溶液降解丝素蛋白，其产物是一些小分子量的多肽和部分 游离氨基酸。其中酸法水解丝素蛋白，缺点是色氨酸被完全破坏，丝氨酸、 苏氨酸和酪氨酸也遭到部分破坏，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水 解下来，生成相应的游离氨基酸和铵离子。碱法水解丝素蛋白虽然能很好 的回收色氨酸，但精氨酸脱氨生成鸟氨酸和尿素，其他氨基酸也有一定程 度的破坏，而且发生消旋作用( 沈同等，1 9 9 0 ) 。酶法水解制备丝素肽则没 有酸、减法的缺点，也是现阶段研究的热点。但丝素蛋白是一种典型的b 一角蛋白，很难被普通的蛋白酶降解。虽然目前已从蚕蛾及微生物中分离 徐升胜：降解丝素蛋白微生物的分离筛选及分类鉴定 到可以降解丝素的蛋白酶，但由于来源有限或稳定性差等原因，无法在实 践中应用。目前用来水解丝素的蛋白酶大多只能水解可溶性的再生丝素， 而制备可溶于水的再生丝素粉是一个极繁琐的过程。 土壤中存在着丰富的微生物资源，目前认为环境中至少9 0 以上的微生 物还没有进行分离培养( 刘志恒等，2 0 0 4 ) 。我们注意到，蚕茧、丝绸在土 壤中很快会腐烂、降解，这说明其中存在着可以降解、利用丝素蛋白的微 生物。为解决用酶法生产丝肽粉存在的问题，本研究拟从土壤中分离筛选 可以利用丝素蛋白作为唯一的碳源和氮源即可以降解丝素蛋白的微生物， 以便进一步从这种微生物中分离丝素蛋白酶，为利用酶法生产丝肽产品探 寻一条新的途径。 另外，分离降解丝素蛋白的微生物，迸一步研究其产生的可以降解丝素 蛋白这一以1 3 一折叠为主要二级结构的蛋白酶，在酶学研究和医学上也有 较大的理论意义。目前认为，能引起人和动物疾病的原病毒，就是因为正 常p r p 蛋白的b 一折叠结构增多，造成可溶性与对蛋白酶k 的敏感性下降 引起的( 谢天恩等，2 0 0 2 ；p r u s i n e r s be ta l ，1 9 8 0 ) 。两条凝血途径的最终结 果，都是使得可溶性的纤维蛋白原降解成为纤维蛋白并聚合成不溶于水的 网状结构( 周爱儒等，2 0 0 1 ) 。所以，深入研究丝索蛋白及丝素蛋白酶，对 医学的相关研究将具有借鉴意义。 2 蚕丝及其他角蛋白的降解研究进展 角蛋白( k e r a t i n ) 是一种纤维状蛋白质，它来源于外胚层细胞，包括皮 肤及其衍生物和分泌蛋白，是外胚层细胞的结构蛋白。在按分子结构的分 类中，角蛋白属于单纯蛋白中的硬蛋白。在按生物学功能的分类中，角蛋 白属于结构蛋白。角蛋白可以分为旺一角蛋白和b 一角蛋白( 王镜岩等， 2 0 0 2 ) 。 a 一角蛋白是毛发中的主要蛋白质，其亚基的氨基酸序列是由富含一 螺旋的中央棒状区和两侧的非螺旋区构成。a 一螺旋轴向大体上与角蛋白的 长向平行。在毛发d 一角蛋白中，三股右手一螺旋向左缠绕拧成一根称为 山东农业大学硕士学位论文 原纤维的超螺旋结构，原纤维再排成“9 + 2 ”的电缆式结构，称为微纤维。 成百根微纤维再结合成一不规则的纤维束，称为大原纤维，它是毛发的结 构单元。 丝素蛋白( f i b r o i n ) 是b 一角蛋白的代表，它是构成蚕丝和蜘蛛丝的一 种蛋白质。丝心蛋白是典型的反平行6 一折叠片结构，多肽链取锯齿状折叠 结构，在这种构象中，侧链交替的分布在折叠片的两侧。链间主要以氢键 连接，层间主要依靠范德华力维持。天然的b 一角蛋白除丝素蛋白以外，还 广泛存在于大多数的鸟类和爬行类动物的羽毛、皮肤、爪、啄和鳞片中。 另外，a 一角蛋白充分伸展后，可以可逆地转化为b 一角蛋白。 2 1 丝素蛋白的降解 2 1 1 丝素蛋白的盐解 钙离子等中性金属离子能配位在丝索分子链上丝氨酸、酪氨酸侧链的 羟基处形成螯合物，配位过程中破坏了多肽链之间的部分氢键和范德华力， 从而使纤维溶胀、分子结构松弛。因作为丝素非结晶区中的氨基酸组成含 有较多的极性氨基酸，分子结构呈松弛状态( 傅师申等，1 9 9 9 ) 。所以，钙 盐作用下的溶胀效应在结构松驰的非结晶区更明显，从结构上判断其大分 子的b 一折叠结构逐渐向无规则卷曲结构转移，而从外观上看，这种溶胀作 用是纤维取向性下降和溶解性上升的一个重要因素。 2 1 1 1 中性盐一水二元溶液对丝素蛋白的降解 中性盐法溶解丝素蛋白，常用c a c l 2 一h 2 0 二元溶解体系。根据傅师中 等( 1 9 9 9 ) 研究，该溶解体系中氯化钙的最佳质量分数为4 2 ，先将溶液 预热到5 0 ，按1 9 丝素蛋白l o m l 溶剂的比例加样，丝素蛋白预浸后静止 溶胀一段时间后加热并搅拌，液温加至1 0 4 1 1 0 ，溶解时间约为6 0 8 0 m i n ，然后迅速降温。其他多种中性盐类也可以溶解丝素，如锶、钡、镁、 锌、锂的卤素盐和硝酸盐以及钾、钠、铵、锌的硫氰酸盐等。 徐升胜：降解丝素蛋白微生物的分离筛选及分类鉴定 2 1 1 2 中性盐一有机溶剂一水三元溶剂对丝素蛋白的降解 味泽昭义报道( 味浞昭羲，1 9 6 9 ) ，脱胶丝素在预热7 0 。c 的c a c l 2 ： c h 3 c i - 1 2 0 h ：i - 1 2 0 = 1 ：2 ：8 ( 质量比) 的溶液中也可以被溶解，按1 9 脱胶 丝素加入1 0 m l 溶解液溶解1 h 即可。其他用来溶解丝素蛋白的三元溶液还 有c a ( n 0 3 ) 2 一c h 3 0 h h 2 0 、l i b r - c h 3 c h 2 0 h - h 2 0 ，且c a ( n 0 3 ) 2 一c h 3 0 h - h z o 三元溶液对丝素蛋白的溶解效率最高( x i nc e ta l ，2 0 0 1 ) 。 2 1 1 3 中性盐一有机溶剂二元溶剂对丝素蛋白的降解 k e n - - i c h if u r u h a t a 等( 1 9 9 4 ) 研究了卤化锂的n ，n 一二甲基乙酰胺 ( n ，n d i m e t h y l f o r m a m i d e ，d m a ) 溶液对丝素蛋白的溶解效果，发现氯 化锂的d m a 溶液对丝素蛋白的溶解效果最佳，在5 0 。c 条件下，1 0 0 m 2 m o l l 的d m a 溶液可以溶解1 4 0 9 的丝素蛋白。另外，中性盐一有机溶剂 溶解体系还有l i b e t o h 等( x i nc ，e ta 1 2 0 0 1 ) 。 2 1 2 有机溶剂对丝素蛋白的降解 n 一甲基吗啉- n 一氧化物一水合物( n m m o h 2 0 ) 作为溶解纤维素的一种 新溶剂，由于它无毒且易于回收，同样引起了丝素研究者的关注。1 9 9 9 年 f r e d d i 等首次以n m m o h 2 0 为溶剂，并利用配有热台的偏光显微镜研究 了丝素蛋白在n m m o h 2 0 中的溶胀和溶解行为，发现在一定的温度下丝 纤维可以溶解在n m m o i - 2 0 溶液中，而且这一溶解过程是热力学自发反 应。但国内有报道认为，n m m o h 2 0 对丝素蛋白的溶解作用很弱，所得 的丝素溶液不足于用来制备再生丝素纤微( 许莹等，2 0 0 4 ) 。但是否可以用来 制备再生丝素粉，则未见相关报导。 2 1 3 碱溶液对丝素蛋白的降解 据陈芳艳等( 2 0 0 2 ) 报道，碱法水解丝素，以n a o h 终浓度为o 1 0 m o l l ， 水解温度为7 0 c ，水解程度最强。处理6h 后用稀酸调节p h 值至中性， 山束农业大学硕士学位论文 丝素肽的氨基氮含量最大达0 6 9 6 8 9 l 。 减法水解丝素，多种氨基酸都会受到不同程度的破坏，且发生消旋现 象。优点是色氨酸能很好地回收。 2 1 4 酸溶液对丝素蛋白的降解 高红旗等( 1 9 9 5 ) 研究了利用硫酸水解丝素蛋白生产丝素肽的生产工 艺，然后用n a o h 中和硫酸，产品质量符合q 3 2 0 1 n y s 0 0 1 9 2 ( 丝肽) 企业 标准要求，外观为淡黄透明液体，无异味，p h 值4 5 6 5 ，总固含量 ( w w ) 3 o 7 ，氮含量( w w ) 0 3 - 0 7 ，所得丝素肽6 0 8 0 的分子量 在5 ，0 0 0 以下。冀瑞琴等( 2 0 0 2 ) 报道了利用磷酸水解柞蚕丝素蛋白制各 柞蚕丝素肽的生产工艺。 2 1 5 蛋白酶对丝素蛋白的水解 在自然界中，存在着各种各样的可以水解蛋白质的蛋白酶。但丝素蛋 白由于其特殊的结构特点，一般蛋白酶难以将其降解。2 0 0 1 年，捷克学者 x a v i e r n i r m a l a 曾提出蚕丝由丝胶、丝素及少量特殊肽构成。该肽类物质实 为一类生物降解抑制剂( 属丝氨酸蛋白水解抑制剂) 。利用酶来水解丝素蛋 白，国内外研究最多的是胰蛋白酶( t r y p s i n ) 和a 胰凝乳蛋白酶 ( c h y m o t r y p s i n ) ，这两种酶可以降解再生丝素，形成的产物包括两部分，酶 解产物的沉淀部分( c p ) 来自丝素的结晶区，而水溶性部分( c s ) 来自相应的无 定形区，两者的重量比约为c p ：c s = 6 0 ：4 0 ，c p 部分含有较多的带简单侧链 的氨基酸( g l y ，a l a ，s e r ) ，而较大侧链的氨基酸( t y r ，p h e ) 含量较少： 在c s 部分中，简单侧链氨基酸含量较低，而含有较多的带较大侧链的氨基 酸( 倪莉等2 0 0 0 ) 。 2 1 5 1 弹性蛋白酶对丝素蛋白的水解 弹性蛋白酶( e l a s t a s e ) 是一种能分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋 白水解酶，存在于动物脏器和多种微生物中，目前主要从猪胰脏中提取( 关 徐升胜：降解丝素蛋白微生物的分离筛选及分类鉴定 国雄等，1 9 9 4 ) 。它是裂解位点较多的水解蛋白酶之一，对丝素有较强的催 化水解能力( 程万里等，2 0 0 3 ) 。丝素经其催化水解后产生两部分产物：水 溶部分( c s ) 及沉淀部分( c p ) ，两部分的组成及分子结构是不一样的，沉 淀部分主要由一些简单氨基酸组成，含量达9 0 以上，带有较大侧基的氨 基酸含量只有5 左右，因而这部分分子能够更为紧密、整齐地排列，结晶 度高，构象主要为b 折叠；水溶部分与再生丝素相比，简单氨基酸含量略 有降低，而亲水性氨基酸和带有较大侧基氨基酸的含量增加，因此水溶性 较高，并具有无规卷曲结构，分子间排列比较疏松( 吴徵宇等，1 9 9 3 ) 。在 丝素浓度1 0 m g m l 、p h 7 5 、温度3 7 、酶丝素0 1 条件下水解2 4 h ，水 溶性蛋白即小分子多肽的含量能达到9 0 左右。 2 1 5 2 碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 对丝素蛋白的水解 上世纪9 0 年代初，冯清平等及洪扬等( 1 9 9 4 ) 分别分离到可以分泌碱 性蛋白酶( a l c a l a s e ) 的地衣芽孢杆菌，主要有效成分枯草杆菌蛋白酶a 是 一种肽链内切酶，它具有高度的操作安全性，符合f a o 、w h o 、j e c f a 、 f c c 推荐的食品级酶制剂标准( 汪建斌等，2 0 0 1 ) 。碱性蛋白酶( m c a l a s e ) 水解丝素蛋白的最适p h 值为9 ，最适催化温度为6 0 c 。a l c a l a s e 的水解效 率在最适p h 值和最适温度条件下，催化反应l o o m i n 可产生9 0 的产物( 倪 莉等，2 0 0 0 ) 。 2 1 5 3 肌动蛋白酶( a c t i n a s e ) 对丝素蛋白的水解 陈开利等研究了肌动蛋白酶对丝素蛋白的水解作用，该酶是由用于制 酱的灰色链霉菌( s w e p 衄m y c e sg r 船u s ) 产生的一种蛋白酶。对水解丝素的 反应条件、水解产物的分离和产物组成进行了研究，在此基础上分析了肌 动蛋白酶的水解性质( k a i l ic e ta l ，1 9 9 5 ) 。 2 a 5 4 双酶联用水解丝素蛋白 不同的蛋白酶有不同的水解位点，为得到较小分子量的丝肽，可以用 6 山东农业大学硕士学位论文 不同的蛋白酶对丝素蛋白进行水解。刘冬等( 2 0 0 2 ) 报道，先后利用碱性 蛋白酶a l c a l a s e 和f l a v o u r z y m e r5 0 0 m g 对丝素进行水解，可得到较好的效 果。将再生丝素粉首先在p h 7 5 ，温度5 5 。c 的条件下，用a l c a l a s e 酶解1 2 0 m i n 叻酶量0 3 5 9 l ) ，然后在p h 6 5 ，温度5 0 。c 的条件下，再用f l a v o m z y m e 5 0 0 m g 酶解2 4 0 m i n ( 加酶量0 2 0 9 l ) ，最后8 5 。c 水浴1 5 m i n 进行灭酶，即 可得到丝肽溶液，水解效果良好。 2 1 6 微生物对丝素蛋白的降解 对于丝素蛋白的生物降解，相对来说比较困难。通常所说的溶茧酶 ( c o c o o n a s e ) ，一种是发现于家蚕成虫的消化系统，可以水解丝素和丝胶 ( f o i l sc k a f a t o se t a l ，1 9 6 4 ；1 9 6 7 a ；1 9 6 7 b ：王厚伟，2 0 0 5 ) 。另一种是 从预蛹将要解体的丝腺中提取的酶，其对丝素有降解活性( s u m i d am e ta l 。 1 9 9 3 a ，1 9 9 3 b ) 。但它的水解底物必须是水溶的丝素，应用时往往先要将 丝素蛋白溶于锂盐，然后透析，最后溶解在5 m 的尿素溶液中才能进行酶解 反应。因此，如果能从微生物中分离提纯一种快速有效降解不溶性丝素的 生物酶，将从根本上改进制各丝肽的传统工艺，为丝蛋白在生产生活中的 进一步应用铺平道路。1 9 9 5 年，p r a s a d ，m m 等对降解蚕茧的四种真菌进 行了研究，认为其中镰刀菌属的一种真菌f u s a r i u m m o n i l i f o r m e 具有较强的 丝素降解能力。 1 9 9 8 年，意大利学者a n n a m a r i as 等在研究丝绸霉变时，分离到一种 可以以丝素蛋白为唯一碳源和氮源的微生物v a r i o v o r a x p a r a d o x u s 。2 0 0 0 年， 同一实验室的g i u s e p p ef 等进一步从该微生物的培养液中获到一种蛋白 酶，这是一种分子量约在2 1 k d a 的单体酶。该酶在初提物中活性极不稳定， 4 c 条件下过夜即完全失活，由此推断该酶可能是一种自身降解活性比较高 的蛋白酶。该酶可以水解多种蛋白质，当以丝素为底物时，其最适p h = 5 7 5 。 c a 2 + 、m n 2 + 、m 9 2 + 对它有激活作用，酶活性为1 0 u n a g 。 1 9 9 9 2 0 0 4 年期间，印尼人h a r d a n i n gp r a n a m u d a l 与日本学者y u t a k a t o k i w a 一道，系统研究了2 5 种属于p s e u d o n o c a r d i a c e a ef a m i l y 的 徐升胜：降解丝素蛋白微生物的分离筛选及分类鉴定 a m y c o l a l o p s i s ，l e n t z e a ，s t r e p t o a l l o t e i c h u s ，k i b d e l o s p o r a n g i u m a n d s a c c h a r o t h r i x 属的放线菌，对聚丙酯塑料p l l a ( p o l y ( l l a c t i d e ) ) f f q 生物降 解。试验中放线菌所产生的降解p l l a 的胞外酶的活性随菌株和诱导物的不 同而不同。其中丝素蛋白是放线菌三w a y w a y a n d e n s i s 的最佳诱导物。丝素作 为p l l a 的类似物，能有效诱导p u a 降解酶的产生，同时丝素一定程度上 也被该放线菌生物降解( h a r d a n i n gp r a n a m u d a le ta l ，1 9 9 9 ，2 0 0 1 ：a m n a t j a r e r a te ta l ，2 0 0 3 ，2 0 0 4 ：y u t a k ay o k i w ae ta l ，2 0 0 4 ) 。 2 2 羽毛角蛋白的微生物降解 自1 8 9 9 年w a r d 报道了真菌马爪甲团囊菌( o n y g e n a e q u l n a ) 骺。分解角蛋 白以来，已先后发现3 0 余种微生物具有降解角蛋白的能力。1 9 5 9 年，羊毛 角蛋白被生物降解，据说这是第一次未灭菌过的天然羊毛被降解。1 9 6 3 年 n i c k e r s o n 等将具有分解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶( k e r a t i n a s e ) 。 2 2 1 降解羽毛角蛋白的放线菌 1 9 9 3 年，丁正民等从鸡毛堆肥中分离纯化到一可利用羽毛角蛋白作为 唯一碳源的放线菌菌株s s 1 ，该菌株可能属于马杜拉放线菌，利用它发酵 5 d 就不见成形鸡毛。涂国全等( 1 9 9 4 ) 报道，他们分离得到一株可以利用 羽毛角蛋白为唯一碳源的弗氏链霉菌s s - - 2 2 1 ( s t r e p t o m y c e sf r a d i a ev a r , s s - - 2 2 1t u1 9 9 3 ) ，该菌株对羽毛角蛋白有较高的分解能力。随后，涂国全 等( 1 9 9 8 a ，1 9 9 8 b ) 对链霉菌分解角蛋白的生化机制进行了研究，探讨了 角蛋白分解过程中含硫化合物的变化规律，认为二硫键还原酶是降解角蛋 白的关键酶。另外，s t r e p t o m y c e sp a c t u m 和s t r e p t o m y c e st h e r m o v i o 1 a c e u s s d 8 ，也可以用来降解羽毛角蛋白。 2 , 2 2 降解羽毛角蛋白的细菌 1 9 9 0 年