（作物遗传育种专业论文）小麦膨胀素基因的分离、克隆与功能鉴定.pdf

摘要 细胞的伸长是植物组织生长的重要原因之一 而植物细胞的伸长受制于细胞壁 它在一定程 度上会限制植物细胞原生质量的迅速增加 因此调节细胞壁的伸展性 重排细胞壁的动态结构 是调节组织生长的重要机制 研究表明 膨胀素基因是一种诱导细胞壁在酸性环境条件下发生松 弛和不可逆伸展的细胞壁蛋白 在细胞壁的膨胀过程中起重要作用 而且广泛参与植物生长发育 各个过程 目前小麦中针对膨胀素基因的研究还没有报道 本文采用简并性引物扩增及电子克隆 方法 获得了3 个膨胀素基因片段和1 8 个具有0 r f 结构的膨胀素基因序列 在此基础上获得了1 7 个膨胀素基因的基因组序列并对其内含子插入模式进行了分析 同时利用r t p c r 和电子表达方 法对1 8 个膨胀素基因的表达模式进行了分析 为了深入了解膨胀素基因的生物学功能 完成了小 麦膨胀素基因t a e x p a l 和t a e x p b 2 转化拟南芥的研究 以期深入了解膨胀素基因在小麦生长发育 过程中的作用 利用反向p c r 方法获得了基因t a e x p a l 5 上游未知序列 并利用软件对其进行 分析 以期能深入了解膨胀素基因表达调控的机制 所得结果如下 1 利用简并性引物扩增和电子克隆的方法 从小麦中获得了3 个膨胀素基因片段和1 8 个具有 o r f 结构的膨胀素基因 t a e x p a l t a e x p a 9 t a e x p b i t a e x p b 5 和而 吁旧7 如劂 d 其 中9 个属于a 一亚族 9 个属于f 3 一亚族 对这些基因的氨基酸序列进行分析 发现它们都具有 典型膨胀素基因的富含半胱氨酸和色氨酸的保守区域 2 利用特异性引物扩增获得了1 7 个膨胀素基因的基因组序列 并通过与拟南芥和水稻相比较 对膨胀素基因的内含子插入模式进行了分析 对水稻和拟南芥的膨胀素基因研究发现具有6 个 内含子插入位点 a f 本研究发现小麦膨胀素基因中存在已发现的4 个位点 a c d 和e 其中不同物种各膨胀素亚族中均存在位点c 和e 插入位点 而插入位点d 和f 则只在1 3 亚族中 出现 这说明膨胀素基因可能具有一个共同的祖先 该基因具有插入位点c 和e 而d 和f 是 在p 亚族分化后产生的 这可以作为鉴定1 3 亚族基因的重要依据之一 分析还发现 插入位点 a 和b 只出现在水稻和小麦中 为单子叶植物所特有的 很可能是单 双子叶植物分化后产生 的 3 通过电子定位和比较基因组学的方法 将5 个小麦膨胀素基因 t a e x p a 5 t a e x p a 7 t a e x p a 9 t a e x p b 2 和t a e x p b 9 分别初步定位在染色体2 l 5 l 1 l 和6 l 上 4 利用半定量r t p c r 和电子表达方法对小麦1 8 个膨胀素基因在不同组织中的表达情况进行 了分析 结果发现所有小麦膨胀素基因在根中均有表达 而且有7 个基因在根中强烈表达 推 测小麦膨胀索基因在根系建成和根的伸长过程中发挥重要作用 以与株高形成有关的第一节间 分生组织为材料 对膨胀素基因在杂交组合中的表达模式进行研究 发现有4 个基因在杂种中 的表达量高于亲本 我们推测这种差异表达可能与小麦株高的杂种优势有关 我们还对小麦膨 胀素基因对赤霉素的响应进行了研究 发现大部分基因的表达受到赤霉素的诱导后发生了改变 5 将t a e x p a l 超量表达转化拟南芥 对转基因株系进行表型鉴定 发现与野生型和空载体对 照相比 t 代植株在苗期生长加快 开花期提前 株高增加 而且这些变化在t 3 代植株上仍然 存在 6 将t a e x p b 2 超量表达转化拟南芥 对转基因株系进行表型鉴定 发现t 2 代在茁期和开花期 的生长发育以及株高都没有表现出明显变化 7 对t a e x p a l 的5 上游序列进行分析 发现在此区域内可能具有多个与激素诱导 环境胁 迫和发育进程调控有关的响应元件 以及两个转录因子可能的结合位点 推测该基因的表达可 能与这些因素的调控有关 关键词 小麦 膨胀素基因 基因克隆 基因表达 杂种优势 i i a b s t r a c t t h ee l o n g a t i o no fc e l lw a se s s e n t i a la n di m p o r t a n tt op l a n tg r o w t h a n di tw a se n s l a v e dt ot h e e x t e n s i o no fc e l lw a l l t oc o n t r o lt h ee x t e n s i o na n dt or e a f r a n g et h ed y n a m i cs t r u c t u r eo fc e l lw a l l c o u l dr e g u a l t et h ep l a n tg r o w t h e x p a n s i nw a si d e n t i f i e da sp r o t e i n st h a ti n d u c ec e l lw a l le x t e n s i o na n d s t r e s sr e l a x a t i o na ta c i d i cp hc o n d i t i o n a n dp a r t i c i p a t e di nd i v e r s ep l a n td e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e s u p t on o w n os y s t e m a t i ci d e n t i f i c a t i o n so fg e n e se n c o d i n ge x p a n s i n sw e r er e p o r t e di nw h e a t w ei s o l a t e d 3e x p a n s i ng e n ef r a g m e n t sa n d1 8e x p a n s i ng e n e s w h i c hc o n t a i n e dc o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m eb y u s b a gd e g e n e r a t ep r i m e r sp c ra n di ns f l i c oc l o n i n g b a s e do ut h e s er e s u l t s t h e i re x p r e s s i o np r o f i l e s a n dp u m t i v ef u n c t i o n sw e r ea n a l y z e di nt h i sa r t i c l e t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 t h r e ee x p a n s i ng e n ef r a g m e n t sa n d1 8e x p a n s i ng e n e sw h i c hc o n t a i n e dc o m p l e t eo p e nr e a d i n g f r a m e w e r eo b t a i n e db yu s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r sp c ra n di ns i l i e oc l o n i n g b a s e do nt h ep h y l o g e n e t i c a n a l y s i s t a e x p a l 一t a e x p a 9 g e n b a n ka c c e s s i o n sa y 4 8 5 1 2 1a n da y 5 4 3 5 2 8 a y 5 4 3 5 3 5 r e p r e s e n t n i n ea e x p a n s i ng e n e s w h i l et a e x p b l 一t a e x p b 5 a c c e s s i o n sa y 5 4 3 5 3 6 一a y 5 4 3 5 4 0 a n d t a e x p b 7 t a e x p b i o a c c e s s i o n sa y 5 4 3 5 4 1 一a y 5 4 3 5 4 4 b e l o n gt ob e x p a n s i n t h ed e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c e so ft h e1 8e x p a n s i ng e n e sw e r eh i g h l yc o n s e r v e da tt h ec y s t e i n e s r i c hr e g i o na n d t r y p t o p h a n r i c hr e g i o n 2 g e n o m i cs e q u e n c e so f1 7e x p a n s i ng e n e sw e r eo b t a i n e db yu s i n gg e n es p e c i f i cp r i m e r s p r e v i o u s s t u d i e ss u g g e s t e dt h a tt h e r ew e r es i xi n t r o np o s i t i o n si ne x p a n s i ng e n e si n a r a b i d o p s i sa n dr i c e n a m e l y a b c d ea n dei nt h i ss t u d y f o u ri n t r o n s a c da n de c o u l db co b s e r v e di nw h e a te x p a n s i n g e n e s i tw a ss h o w nt h a tp o s i t i o nca n dea r ep r e s e n ti nb o t haa n db e x p a n s i ng e n e si na r a b i d o p s i s r i c ea n dw h e a t i ti sp r e s u m e dt h a tt h e r ew a sac o n l l t l o na n c e s t o ro f e x p a n s i n s i n c ei n t r o np o s i t i o n sc a n dea r ep r e s e n ti na l le x p a n s i ng e n e s t h e s et w oi n t r o n ss h o u l db ep r e s e n ti nt h ea n c e s t o r i n t r o n p o s i t i o n sda n dfw e r ea b s e n ti na e x p a n s i n s u g g e s t i n gt h a tt h e ym i g h to c c u ri nb e x p a n s i ns h o r t l y a f t e ra b s u b g r o u ps p l i t p o s i t i o naa n dbw e r eo n l yp r e s e n ti nr i c ea n dw h e a t a n dw e r ep r e d i c t e dt o e m e r g ea f t e rm o n o c o t d i c o ts p l i t 3 f i v ew h e a le x p a n s i ng e n e s t a e x p a 5 t a e x p a 7 t a e x p a 9 t a e x p b 2 和t a e x p b 9 w e r em a p p e d i nc h r o m o s o m e2 l 5 l 1 la n d6 lr e s p e c t i v e l y b y i ns i l i c oa n dc o m p a r a t i v e m a p p i n g 4 t h e1 8w h e a te x p a n s i ng e n e sw e r ee x p r e s s e di nl e a f r o o ta n dd e v e l o p i n gs e e d m o r e o v e r i tw a s d e m o n s t r a t e dt h a ti nt h ei n t e m o d et i s s u ef o u re x p a n s i ng e n e sw e r eu p r e g u l a t e di nh y b r i df 1 s u g g e s t i n gt h a to v e r e x p r e s s i o no fe x p a n s i ng e n e si nh y b d dm i g h tc o n t r i b u t et ot h eh e t e r o s i so b s e r v e d i ni n t e r o o d el e n g t ha n dp l a n th e i g h t e x p r e s s i o no fw h e a te x p a n s i ng e n e sw a sc h a n g e di nt h es e e d l i n g b yt r e a t m e n tw i t hg a 3 5 t r a n s g e n e t i ca n a l y s i sw a sc a r r i e dt os t u d y t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so fw h e a te x p a n s i ng e n e s o b t a i n e di nt h i sr e s e a r c h o v e r e x p r e s s i o no ft a e x p a li na r a b i d o p s i st h a l i a n ac o u l de n l a r g et h es i z eo f r o s e t t e a d v a n c et h eb l o s s o mt i m ea n di n c r e a s et h ep l a n th e i g h t 6 t a e x p b 2w a sa l s oo v e r e x p r e s s e di na r a b i d o p s i st h a l i a n a a sc o m p a r e dt o t h ew i d e t y p ea n d p o s i t i v ec o n t r o l t h ep h e n o t y p eo ft r a n s g e n i cp l a n t ss h o w sn oo b v i o u sc h a n g e s e x p r e s s i o no fw h e a t i l i e x p a n s i ng e n e sw a sc h a n g e di nt h ey o u n gs e e d l i n gb yt r e a t m e n tw i t hg a 3 7 i n v e r s ep c rw e r ed o n ei no r d e rt oo b t a i nt h e5 u t ru n k n o w ns e q u e n c eo ft a e x p a l t h e ma r e s e v e r a lc a n d i d a t em o t i f si nt h e5 u t rs e q u e n c eo ft a e x p a i i n c l u d i n gr e s p o n s et os t r e s sa n ds e v e r a l h o r m o n e s b a s e do f ft h er e s u l t i ti sp r e s u m e dt h a tt h ee x p r e s s i o no ft a e x p a lm i g h tb er e g u i a t e db y t h e s ee m m e n t s k e yw o r d s w h e a t e x p a n s i ng e n e s g e n ee x p r e s s i o n g e n ec l o n i n g h e m r o s i s i v 本研究是孙其信教授主持的国家菱点基础研究发展规划项 目 9 7 3 项目 农作物杂种优势及其利用的分子生物学基础 2 0 0 1 c b l 0 8 8 国家杰出青年科学基金 3 9 9 2 5 0 2 6 国家自 然科学基金 3 0 2 7 0 8 2 4 3 0 4 7 1 0 7 8 的部分研究内容 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名 哼 阻 时间 如v j 年6 月 珀 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 导师签名 时间 厂年 月 g 日 时间 对年占月嘭r 脓以旷 事乡杆衫 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 1 1 植物细胞壁研究进展 第一章文献综述 细胞壁是植物细胞区别于动物细胞的重要特征之一 长期以来 人们认为细胞壁具有机械支 持 物质运输 防御反应等功能 近年来 随着分子生物学的进展 人们逐步认识到细胞壁除具 有上述传统功能外t 还与细胞的发育密切相关 它能参与对植物细胞生长的调控 参与细胞之间 的识别 甚至能决定细胞分化的命运 植物细胞壁中和动物细胞的细胞外基质一样 不仅存在着 多肤第一信使 而且这些多腋第一信使还参与植物分化发育 自交不亲和反应及对病虫害反应等 许多重要的过程 郝建华 2 0 0 4 目前 对细胞壁的研究已成为植物细胞生物学研究热点之一 1 1 1 植物细胞壁的成分与结构 1 1 1 1 植物细胞壁的化学组分 早在2 0 世纪之前人们就已经发现并研究了纤维素 半纤维素和术质素等细胞壁中的化学组 分 李雄彪等 1 9 9 3 近期研究还发现细胞壁内还存在大量的蛋白质 l a m p o r td t a 等 1 9 6 5 1 9 8 1 对上述细胞壁组分的研究重点在化学组分的分子结构和生物合成等方面 这些研究不仅 能更深入地了解细胞壁本身 而且能更深刻地理解它们对植物细胞壁乃至植物整体的生命活动所 具有的重要意义 尹增芳等 1 9 9 9 纤维素 纤维素是植物细胞壁的主要成分 不同植物的相同部位 或同一植物的不同组织或器官的细 胞壁中 纤维素的含量存在差异 它是由1 0 0 0 1 0 0 0 0 个b d 葡萄糖残基以b l4 一糖苷键相 连的无分支的长链 分子量在5 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 之间 纤维素内葡萄糖残基间形成大量氢键 而 相邻分子问氢键使带状分子彼此平行地连在 起 这些纤维素分子链都具有相同的极性 排列成 立体晶格状 可称为分子团 又叫微团 微团组合成微纤丝 微纤丝又组成大纤丝 因而纤维素 的这种结构非常牢固 使细胞壁具有高强度和抗化学降解的能力 半纤维素 学纤维素往往是指除纤维素和果胶物质以外的 溶于碱的细胞壁多糖类的总称 半纤维素的 结构比较复杂 它在化学结构上与纤维素没有关系 不同来源的半纤维素 它们的成分也各不相 同 有的由一种单糖缩合而成 如聚甘露糖和聚半乳糖 有的由几种单糖缩合而成 如木聚糖 阿拉伯糖 半乳聚糖等 半纤维素在纤维素微纤丝的表面 它们之间虽彼此紧密连接 但并非以共价键的形式连接在 一起 因此 它们覆盖在微纤丝之外并通过氢键将微纤丝交联成复杂的网格 形成细胞壁内商层 次上的结构 果胶类 果胶物质 p e c t i cs u b s t a n c e s 也是细胞壁的组成成分 胞间层基本上是由果胶物质组成的 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 果胶使相邻的细胞粘合在一起 果胶物质是由半乳糖醛酸组成的多聚体 根据其结合情况及理化性质 可分为三类 即果胶 酸 果胶雨i 原果胶 果胶酸 果胶酸 p e c t i ca c i d 是由约1 0 0 个半乳糖醛酸通过 一1 4 键连接而成的直链 果胶 酸是水溶性的 很容易与钙起作用生成果胶酸钙的凝胶 它主要存在于中层中 果胶 果胶 p e c t i n 是半乳糖醛酸酯及少量半乳糖醛酸通过a 一1 4 糖苷键连接而成的长链高分 子化合物 分子量在2 5 0 0 0 5 0 0 0 0 之间 每条链含2 0 0 个以上的半乳糖醛酸残基 果胶能溶 于水 存在于中层和初生壁中 甚至存在于细胞质或液泡中 原果胶 原果胶 p r o t o p e c t i n 的分子量比果胶酸和果胶高 甲酯化程度介于二者之间 主要存 在于初生壁中 不溶于水 在稀酸和原果胶酶的作用下转变为可溶性的果胶 果胶物质分子间由 丁 形成钙桥而交联成网状结构 它们作为细胞间的中层起粘合作用 可允许水分子自由通过 果 胶物质所形成的凝胶具有粘性和弹性 钙桥增加 细胞壁衬质的流动性就降低 酯化程度增加 相应形成钙桥的机会就减少 细胞壁的弹性就增加 术质素 木质素 1 i g n i n 是由苯基丙烷衍生物的单体所构成的聚合物 在木本植物成熟的木质部中 其含量达1 8 3 8 主要分布于纤维 导管和管胞中 木质素可以增加细胞壁的抗压强度 止起 细胞壁木质化的导管和管胞构成了木本植物坚硬的茎干 并作为水和无机盐运输的输导组织 细胞壁蛋白质 早在1 9 2 4 年关于细胞壁蛋白的研究工作就已经展开了 经过研究者多年的努力 在此领域 已取得大量研究成果 根据其生理功能 细胞壁中的蛋白质大致可以分为3 类 其一是结构蛋白 为细胞壁蛋白的主要部分 其二是酶蛋白 包括数十种具有各种酶活性的蛋白质 其三是功能尚 未完全确定的蛋白质 李雄彪等 1 9 9 3 l a m p o r td t a 等 1 9 8 1 细胞壁中最重要的结构蛋白是伸展蛋白 e x t e n s i n 它是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白 h y d r o x y p r o l i n er i c hg l y c o p r o t e i n h r g p 大约由3 0 0 个氨基酸残基组成 这类蛋白质中羟 脯氨酸 h y p 含量特别高 一般为蛋白质的3 0 4 0 其它含量较高的氨基酸是丝氨酸 缬氨酸 苏氨酸 组氨酸和酪氮酸等 伸展蛋白中的氨基酸顺序有特征性的结构单位为 s e t h y p h y p 一 x 一h y p h 其中x 为0 或数个其他氨基酸 有关伸展蛋白功能的研究也较为活跃 大量的比较系统的研究表明 伸展蛋白主要是作为细 胞壁的结构成分和在细胞的防御及抗瘸抗逆性中起作用 李雄彪等 1 9 9 0 s h o w a l t e r 等 1 9 9 1 l a m p o r t 等 1 9 8 3 提出了经纬模型能较好的解释伸展蛋白的作用 这一模型的要点是 1 可 溶性的伸展蛋白前体从垂直于细胞壁平面的方向 纬向 由细胞质分泌到细胞壁中 2 在平行 于细胞壁的方向 经向 纤维素一层一层地附着到细胞壁上并形成独立的微纤丝网 3 横向 进入即内填入细胞壁的伸展蛋白前体之间以异二酪氨酸为联键形成伸展蛋白网 4 经向的纤维 素网和纬向的伸展蛋白网相互交织 5 结合在纤维素上的木葡聚糖和以离子键结合在伸展蛋白 上的果胶象闩塞一样可以可逆地松弛或固定两网的联结 伸展蛋白的防御和抗病抗逆功能主要表 现在机械损伤 真菌感染 植物抗毒素诱导处理 甚至热处理都能引起细胞壁中的伸展蛋白反应 李雄彪等 1 9 9 3 在玉米等禾本科植物的细胞壁中 还发现富含苏氨酸和羟脯氨酸的糖蛋白 t h r e o n i n ea n d 2 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 h y d r o x y p r o l i n er i c hg l y e o p r o t e i n t h r g p 和富含组氨酸和羟脯氨酸的糖蛋白 h i s t i d i n ea n d h y d r o x y p r o l i n er i c hg l y c o p r o t e i n h h r g p 这两种糖蛋白除分别含苏氨酸和组氨酸外 其余 的氨基酸和糖的组成及含量都与伸展蛋白类似 细胞壁的蛋白质还有其它种类 如富含甘氨酸的蛋白质 g l y c i n er i c hp r o t e i n g r p 这类 细胞壁蛋白质的特点是甘氨酸含量丰富 如大豆种皮 燕麦胚芽鞘 莱因衣藻等细胞壁中均含有 较多甘氨酸 g r p 的结构特征与动物的结构蛋向 胶原以及家蚕的茧丝蛋白类似 植物细胞壁中还发现存在f 吁拉伯半乳聚糖蛋白 a r a b i n o g a l a c t a np r o t e i n a g p a 6 p 中的糖 类主要是阿拉伯糖和半乳糖 此外 细胞壁中还发现有不到5 0 个氨基酸残基的低分子量的富硫 蛋白 t h i o n i n 以及凝集素 1 e c t i n 的存在 迄今为止研究者已在细胞壁中发现数十种酶 除苹果酸脱氢酶 磷酸酶 多种糖苷水解酶 纤维素酶在细胞壁上起作用外 还有过氧化物酶 木葡聚糖内转葡萄糖基酶 以不同方式增加细 胞壁的交联 矿质 细胞壁的矿质元素中最重要的是钙 据研究 细胞壁中c a 2 浓度远远大于胞内 估计为1 0 4 1 0 1 m o l l l 所以细胞壁为植物细胞最大的钙库 钙调素 c a l m o d u l i n c a m 在细胞壁中也被发现 如在小麦细胞壁中已检测出水溶性及盐溶性两种钙调素 1 1 12 植物细胞壁的结构 根据细胞壁形成的先后 化学成分和结构方面的不同 细胞壁可分为三层 脆间层 又称中胶层 位于两个相邻细胞之间 为两相邻细胞所共有的一层膜 主要成分为果胶质 该层有助于将相邻细胞粘连在一起 并可缓冲细胞间的挤压 初生壁 位于胞问层内侧 是细胞分裂后 最初由原生质体分泌形成的细胞壁 存在于所有活的植物 细胞 通常较薄 约l 3 微米厚 具有较大的可塑性 既可使细胞保持一定形状 又能随细胞 生长而延展 主要成分为纤维素 半纤维素 并有结构蛋白存在 细胞在形成初生壁后 如果不 再有新的壁层积累 初生壁便是他们的永久的细胞壁 如薄壁组织细胞 次生壁 位于质膜和初生壁之间 是部分植物细胞在停止生长后 其初生壁内侧继续积累的细胞壁层 主要成分为纤维素 并常有木质存在 通常较厚 约5 1 0 微米 而且坚硬 使细胞壁具有很大 的机械强度 i i 2 植物细胞壁的发生和发育 植物细胞壁是细胞有丝分裂的产物 它的形成 必须有细胞核的存在 细胞分裂末期 在赤 道面上 分裂的母细胞先形成成膜体 在染色体分向两极时 高尔基器分离出的小泡与微管集合 在赤道面上成为细胞扳 新的多糖物质沉积在细胞板上逐渐形成了两个细胞间最初的壁层胞间 3 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 层 其后细胞内合成的纤维素 半纤维素沉积在胞阃层的两侧 构建成初生壁 在初生壁的形成 过程中 即有穿通两相邻细胞壁的细胞质联络胞间连丝形成 胞问连丝的存在 使细胞间保持了 生理上的联系 有助于植物细胞间物质的运输和信息的传递 在有次生加厚的细胞 次生壁上某 些特定的区域形成纹孔 纹孔处不发生次生加厚 仅有扔生壁和胞间层存在 胞间连丝在这里穿 过 1 1 3 植物细胞壁的功能 对于细胞壁的功能 目前较肯定的有以下几个方面 维持细胞形状 控制细胞生长 细胞壁增加了细胞的机械强度 并承受着内部原生质体由于液泡吸水而产生的膨压 从而使 细胞具有一定的形状 这不仅有保护原生质体的作用 而且维持了器官与植株的固有形态 另外 细胞壁控制着细胞的生长 因为细胞要扩大和伸长的前提是要使细胞壁松驰和不可逆伸展 物质运输与信息传递 细胞壁允许离子 多糖等小分子和低分子量的蛋白质通过 而将大分子或微生物等阻于其外 因此 细胞壁参与了物质运输 降低蒸腾作用 防止水分损失 次生壁 表面的蜡质等 植物水 势调节等一系列生理活动 细胞壁上纹孔或胞间连丝的大小受细胞生理年龄和代谢活动强弱的影 响 故细胞壁对细胞问物质的运输具有调节作用 另外 细胞壁也是化学信号 激素 生长调节 剂等 物理信号 电波 压力等 传递的介质与通路 防御与抗性 植物的防御体系有被动和主动之分 这两种体系均与细胞壁密切相关 完整的细胞壁对于微 生物的侵染是植物及其有效的物理屏障 另一方面 被侵染的细胞壁迅速进行木质化形成死细胞 层 不仅有效地将被侵染细胞与健康细胞隔离开来 而且将侵染的病菌局限于尽可能小的范围内 而不至于加剧侵染 此外 细胞壁中一些募糖片段能诱导植保素 p h y t o a l e x i n 的形成 它们 还对其它生理过程有调节作用 这种具有调节活性的寡糖片断称为寡糖素 o li g o s a c c h a r i n 例如将一种庚葡萄糖苷寡糖素施加于大豆细胞时 会使负责合成抑制霉菌生长的抗菌素的基 因活化而产生抗菌素 多种寡糖素的功能复杂多样 如有的作为蛋白酶抑制剂诱导因子 在植物 抵抗病虫害中起作用 有的寡糖素可使植物产生过敏性死亡 使得病原物不能进一步扩散 还有 的寡糖素参与调控植物的形态建成 细胞壁中的伸展蛋白除了作为结构成分外 还有防病抗逆的功能 如黄瓜抗性品种感染一种 霉菌后 其细胞壁中羟脯氨酸的含量比敏感品种增加得快 参与细胞间的信息传播 大量的研究发现细胞壁参与了细胞间的识别反应 如豆科植物与根瘤菌共生固氮的相互识别 作用 此外 细胞壁中的多聚半乳糖醛酸酶和凝集索还可能参与了砧木和接穗嫁接过程中的识别 反应 李雄彪等 1 9 9 3 李正理等 1 9 8 4 董龙英等 1 9 9 2 i 樊汝汶等 1 9 9 5 应当指出的是 并非所有细胞的细胞壁都具有上述功能 每一类细胞的细胞壁功能都是由其 特定的组成和结构决定的 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 1 2 膨胀素研究进展 植物的生长是植物生理学中一个最基本且重要的问题 多细胞生物的生长 不仅是由于细胞 数量的增加 而且也与细胞的生长有密切的关系 细胞生长就是指细胞体积的增长 包括细胞纵 向的延长和横向的扩展 由于细胞的这种生长 就使植物体表现出明显的伸长或扩大 所以细胞 的生长是植物组织生长的重要原因之一 而植物细胞的伸长受制于细胞壁 它在一定程度上会限 制植物细胞原生质量的迅速增加 因此细胞壁的膨胀是植物细胞生长的前提 而研究发现细胞壁 衬质是调控植物细胞壁生长的最重要的因素 c o s g r o v e 1 9 9 3 因为细胞壁衬质中含有各种酶 如蔗 糖酶 a t p a s e 酸性磷酸酯酶 半乳糖苷酶 1 a a 氧化酶 果胶甲脂酶等 因此过去一直认为 植物细胞壁松驰的机理是衬质多糖被酶水解所致 所以对一些水解酶类重点研究 如木葡聚糖糖 基内切转移酶 x e t f r y 等 1 9 9 2 m c q u e e n m a s o n 1 9 9 3 混合键b 一葡聚糖酶等 但是这些酶 类的作用不能完全解释细胞的 酸生长 学说 研究发现 生长的细胞壁具有可在酸性条件下延展的能力 这种在酸性条件下生长的现象不仅 仅是一个简单的物理化学过程 因为该反应可在短短数秒内被诱导或被抑制 细胞壁的结构也不会 发生大的变化 而且对细胞壁给予蛋白酶或蛋白抑制剂的处理 都会终止生长 所以 推测很有可 能存在一个非水解酶类的细胞壁蛋白在酸性生长中起到了催化的作用 m c o u e e n m a s o n 在1 9 9 2 年的实验中发现了膨胀素 e x p a n s i n 在以后的研究中膨胀素被发现 是一种诱导细胞壁在酸性环境条件下发生松弛和不可逆伸展的细胞壁蛋白 在细胞壁的膨胀过程中 超重要作用 其推测的作用机理是 在细胞壁中膨胀素以一种可逆的 非水解 的方式与和纤维素微 纤丝表面紧密结合的衬质聚合体发生作用 使多聚物网络的非共价键断裂来促进多聚物滑动 从而 引起细胞壁伸展 它不改变细胞壁的共价结构 但具有打断氢键的能力 并且膨胀素只在细胞壁处 于绷紧状态时才发挥作用 见h t t p a v w w b i o p s u e d u e x p a n s i n s 由于膨胀素在细胞壁膨胀过程中起重要作用 自1 9 9 2 年被发现以来 一直是分子生物学的 研究热点 在对膨胀素近十年的研究发现 它参与了许多植物生长发育过程的调控 比如细胞生 长 叶原基的产生 花粉管渗入 果实成熟 细胞壁降解 种子的生长和萌发等 而且它还对淹 水 光处理 水胁迫等处理产生反应 c o s g r o v e 等 2 0 0 2 因此 研究植物膨胀素蛋白基因及其 编码产物的功能具有相当重要的生物学意义 目前 裸子植物 蕨类植物 苔藓植物 种子植物中都有膨胀素被分离和克隆 序列分析发 现 编码膨胀素的基因是一个多基因的家族 依据结构分为a 1 3 y 和6 等4 个亚族 其中 每个亚族中都具有多个基因 u 等 2 0 0 3 目前 对膨胀素的研究主要集中在拟南芥等双子叶植 物和玉米 水稻等禾本科植物上 1 2 1 膨胀素的发现 1 2 1 1a 一膨胀素的发现 1 9 9 2 年 m c q u e e n m a s o n 等人从黄瓜下胚轴细胞壁中提取出一些蛋白质 为了检测这些蛋白 质的功能 他们首先将黄瓜下胚轴伸长区段在沸水中热失活 浸在酸性缓冲液中 这样细胞壁就 5 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 丧失了自身的伸展活性 然后将提纯的蛋白加入到缓冲液中 用细胞壁扩展测定仪检测细胞壁的 扩展情况 结果发现 在上述蛋白质的诱导下 细胞壁发生了显著的扩展 科学家们通过对这些 活动细胞壁组份的进一步纯化 从中又获得了两种分子量分别为2 9 k d 和3 0 k d 的蛋白 如果把这 两种扩展素分别施于热失活的细胞 均可恢复其细胞壁的扩展活性 这种蛋白随之被命名为 e x p a n s i n 在国内有多种译法 如扩张蛋白 扩展素 但是大多译成膨胀素 1 2 12b 一膨胀素的发现 c o s g r o v e 在黄瓜下胚轴中鉴定山膨胀素后 人们又发现了g r o u p i 过敏原基因 这种基因 在禾本科植物花粉中大量存在 研究表明 来自玉米花粉的g r o u p l 过敏原基因在酸性条件下 具有诱导细胞壁伸展的活性 具有典型的n 膨胀素的活性特点 c o s g r o v e 1 9 9 7 尽管它与此 前发现的膨胀素基因只有约2 5 的氨基酸同源序列 但它们的蛋白链具有同源性 并且对细胞壁 流变学具有类似的影响 s h c h e r b a n 等 1 9 9 5 因此 植物组织中的g r o u p i 花粉过敏原基因 及其相关的膨胀素基因被归类为b 膨胀素基因家族 而以前发现的其它的膨胀素基因就是a 膨 胀素基因家族 自从膨胀素被首次发现以后 逐渐成为生物学的研究热点 到目前为止 已在拟南芥中发现 了3 8 个膨胀素基因 而对测序后的水稻序列进行扫描 发现水稻中至少古有8 0 个膨胀素或膨胀 素类似基因 l i 等 2 0 0 3 1 2 2 膨胀素的物化特性 m c q u e e n m a s o n 等 1 9 9 3 1 9 9 5 膨胀素不是结构蛋白 而是一种酶蛋白 但用凝胶透析法 碘染色法及粘滞性分析等方法发现 膨胀素既无外切葡聚糖苷酶和木葡聚糖内转葡萄糖基酶活性 也没有内切水解酶活性 细胞壁中的膨胀紊的含量很低 大约占细胞干重的1 5 0 0 0 黄瓜膨胀素促进细胞壁伸展的活性 可维持数小时 致使伸展达4 0 以上 0 舡g 外源膨胀素就能使热失活的细胞壁完全恢复伸展活 性 膨胀素对p h 变化敏感 燕麦e x p 2 9 的最适活性在p i l 4 5 黄瓜e x p 3 0 和e x p 2 9 的活性范围 则较广 最适p h 在3 5 4 5 膨胀素对热不稳定 二硫苏糖醇 d t t 可稳定其活性 膨胀素的活性具有高度专一性 具体表现在 a 结构专一性 细胞壁部分有活性 其中细胞质可溶部分不具备活性 b 组织专一性 其活性仅限于迅速生长的细胞 如下胚轴 胚芽鞘中 c 种属专一性 各种来源的膨胀素对其它植物细胞壁的作用效果有差异 如燕麦胚芽鞘细胞壁 对黄瓜膨胀素的敏感性不如黄瓜下胚轴细胞壁 这很可能与细胞壁组成成分有一定关系 禾本科 植物细胞壁的大量衬质成分是 1 3 1 4 b d 葡聚糖和阿拉伯糖 而双子n t 植物细胞壁主 要含木葡聚糖和果胶 双子叶植物细胞壁中h r g p s 含量较高 而禾本科植物细胞壤中h r g p s 含 量很低 6 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 2 3 膨胀素的分类 根据序列的同源性以及内含子的差异 膨胀素被分为四个亚族 分别为c 1 1 3 y 6 一 膨胀素 其中b 膨胀素基因家族义分为3 类 1 3 1 b3 其中b2 和1 33 分别代表膨胀素类似基 因和膨胀素相关基因 l i 等 2 0 0 2 序列比较发现 q 一和1 3 一两类亚族序列同源性比较低 平均大约只有2 0 2 5 的氨基酸同源性 而且这些保守的氨基酸遍布在整个蛋白骨架上 y 族 是拟南芥中最小的膨胀素基因亚族 只有两个成员 因为缺少了成熟蛋白的大部分c 一端序列 所以它的氨基酸序列明显短于a 和b 膨胀素 d 亚族基因则是最新在水稻中发现的膨胀素基 因 这类基因与y 亚族的基因正好相反 它所编码的蛋白缺少了成熟蛋白的大部分n 一端序列 l i 等 2 0 0 3 不过到目前为止 这两类基因的功能还不清楚 1 2 32q 一与b 一膨胀素作用底物的差异 禾本科植物中的b 膨胀素与典型的a 膨胀素不同 表现在以下儿方面 它们在花粉中大量存 在 与细胞壁联结不够紧密 尽管它们对禾本科植物的细胞壁有作用 但对来自双子叶植物的细 胞壁没有作用或作用微乎其微 相反 n 膨胀素在花粉中含量低 与细胞壁结合得紧 对禾本科 植物细胞壁的作用效果不如双子叶植物好 c o s g r o v e 等 1 9 9 7 这种选择性区别可能意味着禾 本科植物细胞中有某种特别的结构或多聚物存在 禾本科植物如玉米 水稻中都含有b 膨胀紊基 因 在双子叶植物如拟南芥 西红柿中也有 与拟南芥中的1 3 膨胀素基因相比 玉米中的1 3 膨 胀素基因更多 表达量比n 膨胀素还高 这些结果说明b 一膨胀素基因在禾本科植物的进化过程 中变得多级化和复杂化 并形成特殊的功能 w u 等 2 0 0 1 1 2 33a 一与b 一膨胀素的序列差异 总的来说 n 与1 3 膨胀素在序列上差异较人 只有2 0 2 5 的序列同源性 在n 一与1 3 一膨胀 素的序列里分别存在一个 f l 一插入 和一个 b 一插入 它们分别为a 一和1 3 亚族成员所特有的 序列 其中 a 一插入是指仅在n 一亚族中具有丽b 一亚族中缺失的序列 一般大约包含1 4 个氨基 酸残基 其中有两个保守的半胱氨酸 拼 且在该序列的3 端具有保守的四个残基 w c n p b 一 插入是指仅在1 3 一亚族中具有而a 一亚族中缺失的序列 一般含有7 个残基 但序列的保守性不强 序列分析还发现 o 亚族不能糖基化 而b 亚族可以 这些序列上的差异可能可以部分地解释两 个距族在作用底物上的差异 7 12 4 膨胀素的氨基酸序列特点及蛋白结构 圈1 1 膨胀素蛋白的结构 膨胀素蛋白有一个约为2 2 2 5 个氨基酸的信号肽 该信号肽可引导初期的多肽进入内质网 高 尔基体分泌途径 而当蛋白进入内质网后 该信号肽即被切除 成熟的蛋白质约有2 5 2 7 k d 卡 要包含有两个区域 蚓卜1 一个是富含半胱氨酸的区域 它与一个来自木霉菌属的内切一1 4 b 一葡聚糖酶具有明显的相似性 这似乎暗示膨胀索的中间序列与4 5 一家族的内切葡聚糖酶的催化核 心具有同源性 也似乎提示它们具有功能上的相似性 但以b 一葡聚糖为底物时朱检测到膨胀素 的水解活性 而内切葡聚糖酶具有明显的催化活性但不能诱导细胞壁伸展 也许是底物在膨胀素 作用时发生了流变学变化 或是底物不适合等 c o s g r o v e 1 9 9 9 另一个是位p c 端有一系列保 守的色氨酸 这些色氨酸在空间上类似于某些细菌的c b d s d i n 1 9 9 4 色氨酸和相关的芳香族氨 基酸对蛋白质一碳水化合物的相互作用至关重要 冈此膨胀素c 一端的这些色氨酸和苯丙氨酸有可 能协助膨胀素结合剑细胞壁上 c o s g r o v e 1 9 9 9 前人研究表明 所有已克隆的植物膨胀素基蚓 在蛋白结构上具有一些比较保守的氢基酸残基或结构域 分布在整个蛋白骨架上 其中包括在n 端富含半胱氨酸区域内6 n 8 个保守的 胱氢酸 在c 端保守的4 个色氨酸 以及几个保守的氨基酸 片段 如 a t f w y g g g a c g c g s c h f d 和r v p c 见图1 1 中监色框内 12 5 膨胀素基因的基因组结构 目前 荚丁 植物膨胀素基因基因组结构的研究报道较少 而针对内含子的分析可以加深我们 对基两进化其至墓冈表达调控的了解 通过对拟南芥 水稻中膨胀素序列的分析发现 膨胀素基 i h t 要具有6 个内含子插入何点 a f 如图1 2 其