（生物医学工程专业论文）RISC相互作用蛋白的确定及功能研究.pdf

天津医科大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ep r o t e i n sc o r r e l a t e dw i mr i s cu s i n gy e a s tt w o - h y b r i d s y s t e ma n df u r t h e ri d e n t i f yt h e i rf u n c t i o n s m e t h o d s ：c o d i n gr e g i o nf o rh u m a na g 0 2ct e r m i n a iw a sc l o n e di n t ot h ep s o s v e c t o ra sb a i tp l a s m i d s c r e e n i n go fp r o t e i n si n t e r a c tw i t l lb a i tp r o t e i nw a sc a r d e d o u tu s i n gc y t o t r a p y e a s tt w o h y b r i ds y s t e mw i t ht h ee d n a l i b r a r yf r o mh u m a n l u n g a f t e rt h ev e r i f i c a t i o no f s p e c i f i c i t yo fp r o t e i l l p r o t e i ni n t e r a c t i o n s ，t h ei n t e r a c t i o n s b e t w e e nb a i ta n dt a r g e t sw e r ec o n f i r m e du s i n gi m m u n o c o p r e c i p i t a t i o na n dw e s t e r n b l o t i nv i v o ，t h ee f f e c t so fi n t e r a c t i v ep r o t e i n so nr i s ca c t i v i t i e sw e r e i n v e s t i g a t e d b ye x p r e s s i n gt h ep r o t e i n si nr n a is y s t e mo fh u m a ng l i o b l a s t o m ac e l ll i n eu 3 7 3 r e s u l t s ：2 2p u t a t i v ep o s i t i v ei n t e r a c t o r sw e r ef o u n db yl i b r a r ys c r e e n i n g a f t e r v e r i f i c a t i o no fs p e c i f i c i t yo fp r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s ，7p l a s m i d sr e m a i n e d p o s i t i v ei n t e r a c t o r s u s i n gi m m u n o c o p r e c i p i t a t i o nf o rf u r t h e rc o n f i r m a t i o n , w e u l t i m a t e l yf m d4 i n t e r a c t i v ep r o t e i n s ：h o m o s a p i e n sp r o t e a s o m e2 6 ss u b u n i t , a t p a s e ，3 ；h o m os a p i e n sd n af r a g m e n t a t i o nf a c t o r , 4 5 k d a , a l p h ap o l y p e p t i d e ( d f f a ) ，i s o f o r m2 ：h o m os a p i e n sp 5 3 - a s s o c i a t e dc e l l u l a rp r o t e i n ( p a c t ) ；h o m o s a p i e n sr e t i n o b l a s t o m ab i n d i n gp r o t e i n6 ( r b b p 6 ) ，i s o f o r m2 e x p e r i m e n t si nv i v o p r o v e dt h a th o m os a p i e n sp r o t e a s o m e2 6 ss u b u n i ta t p a s e3i n c r e a s e st h ea c t i v i t y o fi u s ca n dh u m a np a c t r e p r e s s e st h ea c t i v i t yo fr i s c k e yw o r d s ：y e a s tt w o h y b r i d ；r n a i ；r i s c ；a t p ；d f f a ；p a c t ；r b b p 6 - 3 - 天津医科大学硕士研究生学位论文 英文缩略语 英文缩英文全名中文译名 写 r n a ir n ai n t e r f e r e n c ei 斟a 干扰 s i r n as m a l li n t e r f e r i n gr n a小干扰r n a i u s cr n a - i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e xr n a 诱导的沉默复合体 d f f ah o m os a p i e n sd n a f r a g m e n t a t i o n人类d n a 断裂因子，4 5 k d a , 0 【多肽 f a c t o r , 4 5 k d a , a l p h ap o l y p e p t i d e p l a c th o m o s a p i e n sp 5 3 - a s s o c i a t e dc e l l u l a r人类p 5 3 相关细胞蛋白 p r o t e i n r b b p 6h o m os 印i e n sr e t i n o b l a s t o m a视网膜神经胶质瘤结合蛋白6 b i n d i n gp r o t e i n6 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 s d ss o d i u md o d e c y ls u l p h a t e十二烷基磺酸钠 e d l - e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 1 3 - m e1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l肛一巯基乙醇 d e p c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d t td i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 i 玎r e v e r s et r a n s c r i p t i o n逆转录反应 d bd n a b i n d i n gd o m a i nd n a 结合结构域 a da c t i v a t i o nd o m a i n转录激活结构域 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研 究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的 地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 学位论文版权使用授权书 本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意 学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 名：私聊躲 日期：汐多年璺为多阳 经指导老师同意，本学位论文属于保密，在岁年后解密即可 天津医科大学硕士研究生学位论文 翩雷 一、r n a 干扰及其分子机制 r n a 干扰( r n a i ) 是一种在进化上保守的用来控制基因表达的方法。在 r n a i 所造成的基因沉默过程中，双链r n a ( d s r n a ) 弓 导在序列上与其同源的 m r n a 的降解。f i r e 和m e l l o 在线虫中首次发现基因沉默现象，它们观察到长的 2 9 9 个b p 的d s r n a 能够介导基因沉默。h a m i l t o n 和b a u l c o m b e 在植物中观察到小 r n a 介导的沉默现象。z a m o r e 等和e l b a s h i r 等在果蝇中对于小干扰r n a 的结构 和来源进行了生物化学方面的研究。 r n a 干扰是在各种真核细胞中进行特异性的基因表达沉默的一个强有力 的生物学方法，并且对于功能性基因组、通过确认体内的靶来进行药物筛选和 开发新的基因特异性药物都具有很大的潜力。 由于r n a 干扰技术能够迅速、有效地抑制某个基因的表达，所以作为一种 简单的、有效的代替基因敲除的遗传工具，r n a i 在功能基因组学及疾病治疗等 方面显示出了广阔的应用前景。目前r n a i 技术在机制研究和应用方面均具有惊 人的进步。r n a i 或相关的s i r n a 技术在2 0 0 0 - - 2 0 0 4 年连续四年被列入十大科技 进步成果之一。该技术正吸引着众多学者对其进行更深入的研究，科研成果日 新月异，发展迅猛，已成为当今研究领域最引人注目的热门话题之一。 r n a 干扰的特征是d r o s h a 负责对具有d s r n a 结构域的内源性表达的 r n a ，主要是细胞核里的m i c r 0 砒呵a ( m i i 矾a ) 前体进行加工【。d i c e r 对这些细 胞质中的前体进一步加工成m i r n a 。d i c e r 也负责将其它外源性d s r n a 分子加 工成小的双链r n a ，它们具有特征性的2 - 3 n t 的3 悬垂，称小干扰r n a ( s i r n a ) 。 经d i c e r 加工过的r n a 是解旋的，其中一个链被整合到含有a r g o n a u t e 蛋白家 族成员的核糖核蛋白( 时o ) 复合体中。对于s i r n a 来说，该r n p 复合体叫 作r n a 诱导的沉默复合体( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) ，对于 m i r n a 来说，该复合体称m i r n p ( 与m i r n a 相关的s c ) 。s i r n a 与靶序 天津医科大学硕士研究生学位论文 列之间是完全或接近完全互补的，r i s c 的a r g o n a u t e2 组份介导对靶转录本的 剪切，剪切是在距离单链s i r n a5 端1 0 m 的位点进行的【2 。3 】。相反，m i r n p 大 多抑制翻译，其反应的关键特征是m i r n a 和靶转录本之间存在序列错配件一。 这个r n a 干扰过程的机制如下图1 所示。遗传学和生物化学的研究表明， a r g o n a u t e 蛋白是r n a i 所必须的【”。 t 面强皿旺盈i 丌 一 一黑：一= = ：“意 图1 ：r n a 干扰的机制示意图 1 a r g o n a u t e 蛋白家族 a r g o n a u t e 蛋白组成了一个高度保守的家族，其成员与数种生物的r n a i 和 相关现象有关。a r g o n a u t e 蛋白是约1 0 0 k d a 的碱性蛋白家族，其成员均含有两 个共同的结构域，p a z 和p i w i 结构域悼，如图2 所示。位于a r g o n a u t e 蛋 白n 端的p a z 结构域含有1 3 0 个氨基酸，在a r g o n a u t e 蛋白和d i c e r 中均发现 了该结构域。真核生物的p a z 结构域中央是一个口桶形( b a r r e l ) ；一侧是两个 萎 之。 天津医科大学硕士研究生学位论文 n 端螺旋；另一侧是一个保守的组件：该组件由一个p 发夹和一个0 【螺旋组成 【1 0 1 1 】。位于a r g o n a u t e 蛋白c 端的p i w i 结构域含有3 0 0 个氨基酸。第一次发 现a r g o n a u t e 蛋白的结构是对黑腹果蝇a r g o n a u t e 2 ( d m a 9 0 2 ) 的p a z 结构域 进行n m r 和x 线分析而获得的【1 0 1 。 n i - 1 3 p a zp 附l 图2 ：a g 0 2 的结构示意图 a r g o n a u t e 蛋白家族包括许多成员，如秀丽线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 中的r d e 1 1 7 ，链孢霉属( n e u r o s p o r a ) 中的q d e 2 【1 2 1 ，拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 中的 a g 0 1 、a g 0 2 、a g 0 3 、a u b e r g i n e t l 3 】和果蝇中的p i w i 1 4 】等。 2 a r g o n a u t e 蛋白对m i r n a 和s i r n a 的选择性 许多真核生物都含有a g o 多基因家族，该家族的成员在发挥其生物学功能 时具有特异性。如4 种人a r g o n a u t e 蛋白都能结合s i r n a 和m i r n a ，但只 有a g 0 2 能够介导对靶r n a 的剪切【2 ，3 1 。 秀丽线虫的缺乏r d e l ( 秀丽线虫a g o 家族的2 3 个成员之一) 的突变体 不能进行s i r n a 指导的r n a i ，但是其m i r n a 途径却是正常的 7 1 ；而a l g i ( a g o 样基因1 ) 和a l g 2 的突变体能进行r n a i ，却缺乏m i r n a 沉默途径【1 引。 在拟南芥中，与a g 0 1 相结合的r n a 包括m i r n a 、t a - s i r n a ( t r a n s a c t i n g s i r n a 、t a - s i r n a ) 和转基因的s i i 矾a ，但是却不包括病毒s i r n a 和与染色质 沉默有关的2 4 n t 的s i r n a 2 5 】。 在果蝇的a g o 突变体中也发现了其s i r n a 和m i r n a 途径的多样化。果蝇 a g 0 2 的基因突变会导致对f t zd s r n a 不产生r n a i 的表型，也就是说a g 0 2 天津医科大学硕士研究生学位论文 对于由外源引入的d s r n a 所产生的r n a i 是必要的【1 5 】。进一步的研究表明在 s i r n a 双链结合到r i s c 前体【1 6 1 上之后的r i s c 组装过程中，s i r n a 双链解旋 需要a g 0 2 。虽然如前所述a g 0 2 是s i r n a 指导的r n a i 中的一个重要因素， 但是对于由m i r n a 指导的r n a 剪切来说，a g 0 2 却并不是必须的。综上所述， a g 0 2 很有可能是s i r n a 进入r i s c 的一个特异性的解旋和载入因子，并且还 可能是s i r n a 引发的r i s c 中的一个必须组分。 果蝇中的a g 0 1 对于s i r n a 双链的产生，s i r n a 引发的r i s c 的形成，或 s i r n a 指导的剪切来说不是必须的。但是a g 0 1 对于m i r n a 介导的靶r n a 的 剪切却是必须的【”】。也有报导说胚胎中的s i r n a 介导的r n a i 需要a g 0 1 。该t 文中说a g 0 1 在s i r n a 的生成和靶m r n a 降解之间的某些步骤发挥作用。 a g o i 可能会有助于s i r n a 整合进入功能性的r i s c ，或者像a g 0 2 一样本身 就是r i s c 的组份。a g 0 1 的这种活性可以包括维持s i r n a 的5 磷酸基团；作 为组装多蛋白复合体的支架；解旋s i r n a 为与靶m r n a 进行碱基配对来选择 链：或者作为剪切m r n a 的核酸酶的成份之一。a g 0 1 的这些可能的功能并不 是相互排斥的。例如，s i r n a 可以通过整合进r i s c 而得到稳定【1 7 1 。进一步的 研究表明a g 0 1 与m i r n a 的成熟和或稳定性有关。在胚胎中表达的a r g o n a u t e 蛋白家族之间存在一定程度的功能互补性【l 。7 1 。 3 a r g o n a u t e 蛋白与d i c e r 酶的相互作用 对于r n a i 来说有两类重要的蛋白：p a z 和p i w i 结构域蛋白( p p d ) 和 d i c e r 家族的成员。只要具有一个位于中央的p a z 结构域和一个位于羧基端的 p i w i 结构域的蛋白都是p p d 家族的成员【l 引。人类a g 0 2 蛋白就是p p d 蛋白家 族的成员。d i c e r 包含3 个区域，如图3 所示：a t p 酶解旋酶结构域，p a z 结 构域和r n a s e i i i 结构域。其中把r n a s e i i i 结构域进一步分成两个i 斟a s e i i i 基序 ( m o t i f ) a 基序( m o t i f ) b 和一个d s r n a 结合结构域( d s r m ) 。 天津医科大学硕士研究生学位论文 a t p a s d h e l i c a s e 雕眨r n a s e | l 扮s r 鹾 n h 3 = = h 叫 脚压皿c 。h 图3 ：d i c e r 的结构示意图 最初认为，异型( h e t e r o t y p i c ) 的p a z p a z 相互作用介导p p d d i c e r 复合 体的形成，但是因为许多d i c e r 的异构体不具有p a z 结构域，所以这似乎是不 成立的【1 9 1 。有报道说d i c e r 和a g 0 2 的p a z 结构域之间并没有发现稳定的相互 作用【2 0 l 。现在认为a r g o n a u t e 蛋白的p a z 结构域很可能是直接啮合由d i c e r 产 生或释放的s i r n a m i r n a 2 1 1 。 已知a g 0 2 的p i w i 结构域能够有效地结合到d i c e r 上【2 0 1 。且a g 0 1 中的 一个含有p i w i 结构域的区域也能结合到d i c e r 上i z 2 。a g 0 2 只能结合到全长的 d i c e r 或其羧基端区域，该区域无p a z 结构域，但含有d s r n a 结合结构域 ( d s r m ) 和r n a s e r i 结构域。总之，这些结果表明无论是d i c e r 还是p p d 的 p a z 结构域都与p p d 和d i c e r 之间的相互作用无关。 n a s s e rt a h b a z 等【2 川在2 0 0 4 年报道了d i c e r 和p p d 蛋白之间的稳定的相互 作用是直接的，这种作用不需要双链或单链的r n a 。他们还利用酵母双杂交分 析排除了那些在纯化过程中和d i c e r 或p p d 共同纯化下来的蛋白对d i c e r - p p d 相互作用的可能影响。 如前所述，a g 0 2 的p i w i 结构域能有效地结合在d i c e r 的羧基端区域。进 一步的研究表明a g 0 2 的p i w i 盒子与r n a s e m a 结构域的作用最强。而a g 0 2 的p i w i 盒子与r n a s e l i i b 结构域之间的相互作用以及a g 0 2 的p i w i 结构域 与r n a s e l i i a 结构域的作用相对较弱。p p d 蛋白的结构域和d i c e r 的d s r m 之 间没有发现相互作用。总之，p p d 蛋白的p i w i 盒子与d i c e r 的i 矾a s e i 结构域 直接相互作用。此外，还有报道说a g o 蛋白的p i w i 结构域抑制d i c e r 的 r n a s e i i i d s r n a 结合结构域的活性【捌。这种相互作用被解释成一种底物转移作 天津医科大学硕士研究生学位论文 用，并且估计p i w i 与d i c e r 之间的相互作用可能会促进m i r n a s i r n a 的释放 2 3 1 4 r n a i 中的小r n a 指导的核酸内切酶 p f a g o 是一种来自耐热微生物( a r c h e b a c t e r i u mp y r o c o c c u sf i a r i o s u s ) 的 a r g o n a u t e 蛋白。p f a g o 的p i w i 结构域与r n a s eh 酶家族的结构很相似r - - 级 结构的拓扑很保守。并且已知r n a s eh 能剪切r n a d n a 杂合体中的r n a 链。 将位于拟南芥a g 0 1 核心的p i w i 结构域在具有剪切活性的某些保守碱基 处进行突变后，出现了一些完全不具有剪切活性，但是能结合m i r n a 的突变 体，这些说明a g 0 1 具有核酸内切酶活性。进一步研究显示拟南芥的最小r i s c 复合体只含有a g 0 1 和与其结合的s i r n a ，这表明a g 0 1 本身就具有剪切活性， 可能不需要其它相关蛋白【2 5 1 。 有报道只需要a g 0 2 就能在加入s i r n a 引导链( g u i d es t r a n d ) 的情况下产 生r i s c 对靶m r n a 的剪切活性。而将a g 0 2 中所预测的具催化性的羧基末端 ( c a r b o x y l a t e s ) ( p i w i 结构域上的活性位点) 突变以后，破坏了s i r n a 引导的剪 切活性。r n a s eh 与r n a i 中的核酸内切酶催化的反应具有相似的特征：依赖 m 9 2 + ，产物末端是3 - o h 和5 磷酸化的。 总之，这些证明了人类a g 0 2 是r n a i 途径中能对靶m r n a 进行剪切的内 切酶活性的执行者【2 4 】。值得进一步研究的是：虽然所有被预测的具催化性的天 冬氨酸的p i w i 结构域都是保守的，但为什么并不是所有a r g o n a u t e 蛋白都能表 现出剪切活性? 在对靶r n a 剪切的过程中，存在着怎样的调控分子来对r i s c 的活性进行调控? 对于这些问题目前了解的还不是很清楚，本文研究了与r i s c 中发挥剪切活性的a g 0 2 蛋白相互作用的几种蛋白，并确定了它们的功能。 二、筛选与a g 0 2 相互作用蛋白的方法酵母双杂交系统简介 目前研究蛋白质一蛋白质相互作用的方法有很多，但是大多数只能研究几种 天津医科大学硕士研究生学位论文 感兴趣的蛋白之间的相互作用，通量较低。酵母双杂交系统则可以一次性大规 模的筛选出与目的蛋白相互作用的很多种蛋白，不但克服了其它方法费时费力 的缺点，而且可以给我们的研究工作以有效的提示，有助于找到新的有意义的 相互作用的蛋白。目前发展起来的常用系统主要有两种类型：g a l 4 双杂交 系统和s o s 蛋白介导的双杂交系统。 g a l 4 双杂交系统的基本原理是基于真核细胞起始基因转录需要有反式 转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的( m o d u l a r ) ，即这些因 子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有d n a 结合结构域 ( d n ab i n d i n gd o m a i n ，简称为b d ) 和转录激活结构域( a c t i v a t i o nd o m a i n , 简称为 a d ) ，它们是转录激活因子发挥功能所必需的。如果使用重组d n a 技术把它们 在空间位置上分开并且在同一个宿主细胞中表达，那么d n a b d 和a d 的多肽 就不会直接相互作用也就不会激活应答基因。然而，如果d n a - b d 和a d 能在 启动子区域被携带到一个空间上相互临近的位置，那么分别位于两个融合蛋白 上的d b 和a d 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转 录与表达。 我们选用的c y t o t r a p ( s t r a m g e n e 公司) 酵母双杂交系统属于s o s 蛋白介 导的双杂交系统，它为体内检测蛋白一蛋白相互作用提供了一个新颖的方法。 如图4 所示它是根据产生的融合蛋白在酵母细胞质中的相互作用能激活r a s 信 号途径，从而诱导细胞生长。c y t o t r a p 系统的这些特性使研究者们能够对于那 些使用通常的双杂交或相互作用陷阱系统不能分析的蛋白进行研究。这些蛋白 包括转录激活因子或抑制因子，或者那些在细胞质中需要翻译后修饰的蛋白， 以及在通常的双杂交系统中对酵母生长有毒性的蛋白。 c y t o t r a p 系统使用温度敏感的突变株s c e r e w i s i a e 酵母菌株c d c 2 5 h ，它 在c d c 2 5 基因的1 3 2 8 个氨基酸残基处含有一个点突变。c d c 2 5 基因是人类s o s ( h s o s ) 基因的酵母同系物，它编码一个能够结合并激活r a s 的鸟苷酸交换因 天津医科大学硕士研究生学位论文 子，这样就启动了r a s 信号转导途径。e d c 2 5 突变阻止宿主在3 7 的生长，但 是在许可温度( 2 5 ) ，宿主的生长是正常的。c y t o t r a p 系统是根据人类s o s 蛋白能够弥补c d c 2 5 的缺陷并激活酵母r a s 信号途径的能力。h s o s 蛋白的表达 和其在细胞膜上的定位使得c d c 2 5 h 酵母菌株能够在3 7 c 生长。h s o s 在细胞膜 上的定位通过双杂交蛋白的表达来实现。 将编码你所感兴趣的蛋白( 诱饵蛋白) 的d n a 克隆到p s o s 载体的m c s ， 它将表达一个h s o s 和诱饵蛋白的融合蛋白。将表达另一个感兴趣的蛋白的d n a 或者一个表达文库克隆到p m y r 载体的m c s ，它将表达一个融合蛋白，该蛋白 含有能使融合蛋白锚定在细胞膜上的十四烷基序列。这些融合蛋白在c d c 2 5 h 酵母菌株中共表达，然后将酵母细胞在3 7 。c 的严格温度下孵育。如果诱饵和靶 蛋白在物理上相互作用，h s o s 蛋白就被带到细胞膜上，因此激活r a s 信号途径， 并且允许c d c 2 5 h 酵母菌株在3 7 生长。 m 4 ：c y t o t r a p 双杂交系统中所示用的r a s 信号途径的示意图 三、本课题研究的意义及基本思路 本课题的研究目的是找到与人类a g 0 2 相互作用的蛋白，从而阐明r n a 干扰中r i s c 复合体的可能调控机制，所以我们采用如下的基本思路进行研究： 以能表达人类真核翻译起始因a g 0 2 c 端的p s o s 质粒作为诱饵，采用 c y t o t r a p 酵母双杂交系统，选用人类肺组织的c d n a 文库，筛选与诱饵相互作 用的蛋白，并在酵母中验证蛋白一蛋白相互作用的特异性。将筛选出来的相互 天津医科大学硕士研究生学位论文 作用蛋白和诱饵蛋白在真核h e k 2 9 3 细胞中共同表达，用免疫共沉淀和w e s t e r n b l o t 技术进一步验证二者的相互作用。经过免疫共沉淀的验证，最后确定有四 种蛋白与人类a g 0 2 蛋白相互作用。我们又进一步研究了这四种蛋白在体内对 a g 0 2 发挥r n a 干扰的剪切功能的影响。 我们选择了在人类胶质瘤细胞系中高表达的8 7 蛋白( 本室自行克隆得到的 蛋白，已证明其对u 3 7 3 的生存至关重要，若细胞中8 7 蛋白的表达受到抑制则 会引起细胞的死亡) 的m r n a 作为靶，利用细胞内的r n a 干扰系统，将人工 合成的s i i 矾a 双链通过转染的方式导入细胞内使其发挥r n a 干扰的功能。同 时分别将能表达筛选得到的四种相互作用蛋白的载体导入细胞中，观察这几种 蛋白的表达对8 7 蛋白表达量以及细胞表型的影响。 天津医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 第一部分：酵母菌株标志性表型的鉴定及诱饵质粒的构建 1 实验材料 1 1 主要试剂及配制 y p a d 琼脂平板( 1 l ) ：1 酵母抽提物，2 b a c t o 蛋白胨，2 右旋葡萄糖， 2 b a c t o 琼脂粉，4 0m g 腺嘌呤硫酸盐 t r i z o lr e a g e n ti n v i t r o g e n , 美国 d e p c鼎国，北京 u l t r a p u r ea g a r o s e g i b c o ，美国 1x t a e ：0 0 4 0 mt r i s a c e t a t e 和0 0 01m e d t a ，p h 7 5 d n a 电泳用6 x l o a d i n gb u f f e r ：4 0 f i e o l l ( w v ) ，0 0 6 溴酚兰 氯仿国产 异丙醇国产 乙醇国产 w e s t e r n 化学发光试剂p e r k i ne l m e r 公司，美国 b l o t t o ：5 0 m mt r i s ( p h 8 o ) ，2 m mc a c l 2 ，0 0 1 a n t i f o a m a ，0 0 5 t w e e n2 0 ， 0 0 2 n a n l ，5 脱脂奶粉 1 x t b s t ：1 0 0 m m t r i s ( p h 8 0 ) ，1 5 m n a c l ，5 t w e e n 2 0 1 2 主要仪器 水浴恒温箱( d k 8 ) 上海精宏试验设备有限公司 水平电泳槽北京市六一仪器厂 超净工作台( b c m - 8 )苏州净化设备公司 p c r 扩增仪( 9 6 0 0 ) 美国p e 公司 电热恒温孵育箱( d n p - 9 0 8 2 ) 上海精宏试验设备有限公司 1 3 天津医科大学硕士研究生学位论文 干燥消毒烤箱( d h g 一9 2 4 6 a ) 紫外分光光度计 台式离心机 低温高速离心机( 5 4 1 7 c ) 摇床( t s 1 ) 低温高速离心机 2 实验方法 2 1 酵母菌株标志性表型的鉴定 上海精宏试验设备有限公司 美国b i o t e k 仪器公司 德国e p p e n d o r f 公司 德国e p p e n d o r f 公司 海门市其林贝尔仪器公司 s i g m a3 k l8 s i g m a ，德国 ( 1 ) 由于宿主菌株c d c 2 5 hy e a s ts t r a i n ( a ) 的基因型为m a t au r a 3 5 2h i s 3 2 0 0 a d e 2 1 0 1l y s 2 8 0 1t r p l 9 0 1l e u 2 31 1 2c d c 2 5 2g a l + ，为了检测其营养需求， 分别使用只缺乏色氨酸( t r p ) ，亮氨酸，( l e u ) ，组氨酸( h i s ) ，尿嘧啶( u r a ) 的 1 0 x d r o p o u t 氨基酸溶液制备四种s d 琼脂平板。 ( 2 ) 取一8 0 0 c 的酵母甘油储存物，在四个营养缺陷平板上划线，并同时在一个 y p a d 琼脂平板上划线，室温孵育4 至6 天。若在y p a d 平板上生长，而不在四 个s d 琼脂平板上生长则酵母菌株表型正确。 2 2 总r n a 的提取和鉴定 ( 1 ) 一瓶h e k 2 9 3 细胞长成单层后( 约5 x 1 0 6 细胞) ，倒掉培养液用p b s 液洗一 次，加l m lt r i z o l 到培养瓶中，轻轻晃动混匀，冰浴5 分钟，将液体转移到一 个1 5 m l 离心管中。 ( 2 ) 加2 0 0 9 l 预冷的氯仿，充分振荡混匀，冰浴静置预约1 5 分钟至分层。 ( 3 ) 4 。c ，1 4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，小心吸取上层水相到一个1 5 m l 离心管中，加 入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，冰浴1 小时。 ( 4 ) 4 ，1 4 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，弃上清。 ( 5 ) 加入1 1 1 1 1 7 5 乙醇( d e p c 处理过的水配制的) ，温和震荡。 ( 6 ) 4 ，1 4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清。 天津医科大学硕士研究生学位论文 ( 7 ) 室温晾干5 1 0 分钟，加2 0 l t l d e p c 处理过的水溶解。 ( 8 ) 取0 5 u l 测o d 2 6 0 和o d 2 8 0 根据o d 2 6 0 计算r n a 的浓度，并计算o d 2 6 0 与 o d 2 8 0 的比值以鉴定r n a 的质量。 ( 9 ) 取l u g 总r n a 溶解于1 0 u l d e p c 处理过的水中，与2 u l6 x l o a d i n gb u f f e r 混 合后上样，在1 琼脂糖胶中电泳，8 0 v , 3 0 分钟。观察2 8 s 与1 8 s 两条带的亮 度比值以鉴定r n a 的质量。 立即进行反转录反应，或存于8 0 保存备用。 2 3 逆转录( i 盯) 及聚合酶链式反应( p c r ) 2 3 1 用o l i g od t 作为引物进行r t 反应，合成e d n a 第一链 ( 1 ) 制备退火反应混合物 总r n a 5 p g o l i g od t ( 1 p g t l )1 p l 加d e p c 处理过的水至1 1 “l ( 2 ) 6 5 c 水浴箱中孵育1 0 分钟，冰上冷却2 分钟，1 2 0 0 0 r p m 离心5 秒 ( 3 ) 在每一个退火反应混合物中分别加入 4 p l 5 x f i r s t s t r a n db u f f e r lp l1o d n t ps o l u t i o n ( 10 m m ) 2 p l 0 1 md t t l p l r n a s i n l “l逆转录酶s u p e r s c r i p ti i 混匀上述混合物 ( 4 ) 4 2 孵育l 小时 ( 5 ) 7 0 孵育1 0 分钟 ( 6 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心5 秒，放置冰上后使用。 2 3 2 用特异性引物进行p c r 扩增。 天津医科大学硕士研究生学位论文 ( 1 ) 在0 2 m l p c r 管中配制以下p c r 反应体系试剂混合物 1 0 x p c rb u f f e r 5 9 l dntp(25ram)lgl 引物( 2 5 9 m ) ( 正义+ 反义)1 9 l + 1 9 l 模板( r t 产物) 2 5 p l t a q 酶 1 5 u 加h 2 0 至 5 0 p l ( 2 ) 混匀并进行热循环 9 4 3 m i n 9 4 。c l m i n 1 f 5 60 0 l m i n 3 1 个循环 7 2 2 m mj 7 2 1 0 m i n ( 3 ) 完成热循环后，p c r 反应管应取出放在冰上 ( 4 ) 用p c r 产物进行1 琼脂糖凝胶电泳 ( 5 ) 从凝胶中回收p c r 产物 i 取一个干净的0 5 m l 离心管，用注射器针头在下方扎一个小洞并在内部塞少 量的玻璃棉，外面套上一个1 5 m l 离心管。 i i 在紫外透射仪中用刀片将p c r 产物在胶上所对应的条带切割下来，放在 0 5 m l 离心管中。 i i i 室温7 0 0 0 r p m ，离心5 分钟，弃去0 5 m l 离心管，1 5 m l 离心管中的液体即为 所得到的p c r 产物。 2 3 3 酶切消化电泳回收的p c r 产物和p s o s 空载体各约l p , g 。 2 3 4 连接并转化x l l 一b l u e 感受态细菌。 ( 1 ) 在0 5 m l 离心管中配制以下连接体系 天津医科大学硕士研究生学位论文 1 0 x 连接缓冲液 1 2 p 1 t 4 d n a 连接酶1 l 回收的p c r 产物 2 l 回收的p s o s 载体 8 “1 ( 2 ) 混匀后室温放置2 小时。 ( 3 ) 按照通用的大肠杆菌转化步骤，取5 1 a l 连接反应混合物，转到x l l b l u e 感 受态细菌中。 ( 4 ) 将细菌铺于氨苄l b 平板上，3 7 c 倒置孵育过夜。 2 4 证实诱饵克隆插入片段的正确性 ( 1 ) 小量制备质粒d n a ，酶切鉴定重组子中含有正确的p s o s 质粒和插入片段。 ( 2 ) 测序证明插入片段与s o s 结构域读码框一致，并且插入的d n a 片段没有突 变。 2 5 在酵母中确定蛋白一蛋白的相互作用 ( 1 ) 观察第2 ，4 和5 个转化的平板( 见第二部分2 2 ) ，并且比较它们在室温( 2 2 - 2 5 0 c ) 的生长情况是否如下表中所预期。 ( 2 ) 从每个转化中至少选择3 个克隆，以转移至l j s d g l u c o s e l ) 和s d g a l a c t o s e ( - u l ) 上来检测能够使酵母在3 7 0 c 生长的相互作用。 ( 3 ) 在无菌9 6 孔板的每个孔中分装2 5 p 1 无菌水。将每个克隆转移到不同的空中， 在无菌水中重悬酵母克隆。 ( 4 ) 将2 5 1 a l 的酵母水的混悬物滴到两块s d g a l a c t o s e ( - u l ) 琼脂平板和两块 s d 毋u c o s e ( u l ) 琼脂平板中的一块上。 ( 5 ) 将每种的一个平板在3 7 0 c 孵育。将每种的另一个平板在室温孵育5 天。 ( 6 ) 经过至少5 天的孵育后，评定酵母菌在3 7 0 c 的生长 2 6 证明诱饵蛋白表达 2 6 1 酵母中蛋白纯化 天津医科大学硕士研究生学位论文 ( 1 ) 在一个5 0 m l 的离心管中加入5m ls d g l u c o s e ( - l ) 培养液。用一个转化有 p s o s 诱饵质粒的c d c 2 5 h 单克隆接种。 ( 2 ) 室 温( 2 2 - 2 5 。c ) 孵育酵母培养物并剧烈摇动( 2 5 0r p m ) ，直到培养物饱和 ( h 天，直至u o d 6 0 0 1 0 ) 。 ( 3 ) 将培养物在室温离一i 二, 1 0 0 0 g ，5 分钟，收集沉淀。 ( 4 ) 在2 0 0 9 l 新鲜加入蛋白酶抑制剂的分离蛋白用细胞裂解液( c e l ll y s i sb u f f e r f o rp r o t e i ni s o l a t i o n ) 中重悬酵母细胞。 ( 5 ) 加入等体积的酸洗玻璃珠，4 涡旋细胞5 分钟。 ( 6 ) 4 。c1 2 ，0 0 0 g 离心5 分钟，收集裂解物。 ( 7 ) 将上清转移到一个新的1 5 m l 离心管中，放置冰上。 ( 8 ) 向沉淀和玻璃珠的混合物中加入1 0 0 山的分离蛋白用细胞裂解液( c e l l l y s i sb u f f e rf o rp r o t e i ni s o l a t i o n ) ，4 0 c 剧烈涡旋5 分钟。 ( 9 ) 4 。c1 2 ，0 0 0 g 离心5 分钟收集细胞裂解物。 o o ) 合并两次的上清。 2 6 2w e s t e r nb l o t 分析 ( 】) 灌制1 0 的s d s p a g e 胶，待胶凝后将纯化酵母蛋白所得的上清与上样缓冲 液混合后取3 0 u l 上样。 ( 2 ) 8 0 v 恒压电泳2 d , 时后，在转移电泳槽中4 c ，1 2 0 v 恒压转膜过夜。 ( 3 ) 将膜取出后放于b l o t t o 中室温封闭2 d 时。将鼠抗人s o s 的单克隆抗体作为 一抗用b l o t t o 稀释后，室温摇动( 2 5 r p m ) 孵育膜2 4 , 时。 ( 4 ) 用1x t b s t 洗膜3 次，每次5 分钟。 ( 5 ) 将羊抗鼠的二抗用b l o t t o 稀释后，室温摇动( 2 5 r p m ) 孵育膜l d 时。 ( 6 ) 用1x t b s t 洗膜3 次，每次5 分钟。 ( 7 ) 将膜放于显影液中轻轻晃动3 分钟。 ( 8 ) 曝光1 0 分钟，冲