（微生物学专业论文）对硝基苯酚降解菌pseudamonibacter+spnp1的研究.pdf

中由大学硕士学位论文 对硝基苯酚降解菌p s e u d a m o n i b a c t e rs p n p - 1 的研究 专业：微生物 硕士研究生：吴小映 指导教师：刘玉焕副教授 摘要 随着工业化的高速发展，环境污染问题已经引起了人们高度的关注。硝基 化合物，特别是对硝基苯酚( p n p ) 被广泛地用作医药、染料、农药、塑料等的 合成前体，常常在生产和使用过程中被释放到环境中，有机磷农药甲基对硫磷在 环境中水解也会释放出对硝基苯酚，由于机磷农药的广泛性应用，对硝基苯酚在 环境中必然积累，危害生态环境。鉴于对硝基苯酚对人类和其它生物的毒性，美 国将其列为优先监测污染物。微生物能利用特定的有机物，并以其为唯一碳源、 氮源和能源生长。目前，国内外对p n p 的微生物降解已经作了不少研究，对其生 物降解途径也有一定的了解。 本研究从受污染的地方采集样品，筛选分离到一株能高效降解对硝基苯酚 的n p 一1 菌株，通过形态观察和1 6 sr d n a 序列同源性比较分析，初步鉴定该菌株 为p s e u d a m o n i b a c t e rs p ，该菌株是微生物降解对硝基苯酚的一个新种，它能 以对硝基苯酚为唯一碳源、氮源和能源生长。 通过对n p 一1 菌株的培养特性和降解特性研究，确定该菌株生长的最适温度 v 和p h 分别是3 5 、p h7 8 ，在l b 培养基中耐受对硝基苯酚的最高浓度是2 0 0 m g l ；通气性越好越有利于细菌降解对硝基苯酚，其降解反应的最佳温度、p h 、 中山大学硕士学位论文 碳源、氮源分别是3 5 、p h7 4 、甘油和硫酸铵，比较合适的接种量在1 到 3 之间，大部分无机离子与化学试剂都能不同程度地抑制菌株对p n p 的降解； 底物类似物苯酚在一定程度上抑制了细菌对p n p 的分解，代谢途径中间产物对苯 二酚和1 ，4 - 苯醌强烈抑制菌株n p 一1 对p n p 的降解。 运用响应面法对n p - 1 菌株的降解条件进行统计优化，优化后的培养基组成 是：甘油0 5 ( 体积比) ，( n h 。) ：s 0 41g l ，k 2 h p o 。1 5 a l ，k h ：p o 。0 7 8g l ， m g s o n0 8 6g l ，n a c l0 3 9g l 。结果表明：优化的培养条件使n p 一1 菌株降解 对硝基苯酚的速率提高了1 4 倍多，说明优化的效果是明显的。 最后，构建了此菌株完整的基因组文库，这为进一步克隆对硝基苯酚降解 基因，构建高效的对硝基苯酚降解工程菌打下基础，并为找出新的功能基因提供 可能。 关键词：对硝基苯酚，生物降解，1 6 sr d n a ，表面响应法，基因文库 i 】 中山大学硕士学位论文 s t u d yo nap - n it r o p h e n o ld e g r a d i n g p s e u d a m o n i b a et e rs p n p 一1 m a 2 0 r ：m i c r o b i o l o g y m a s t e r ：x i a o y i n gw u s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o r y u h u a nl i u a b s t r a c t r a p i di n d u s t r i a l i s a t i o ni nt h ew o r l dt o d a yh a sm a d ep o l l u t i o na m a t t e ro fp r i m ec o n c e r n a m o n go t h e r s ，n i t r o a r o m a t i cc o m p o u n d sa r ew i d e l y d i s t r i b u t e di nt h ee n v i r o n m e n t p - n i t r o p h e n o l ( p n p ) ，i np a r t i c u l a r ，h a s b e e nu s e di nt h em a n u f a c t u r eo fp h a r m a c e u t i c a l s ，p e s t i c i d e s ，p l a s t i c i z e r s a z od a y s ，e x p l o s i v e se t c i ti sa l s oam a j o rm e t a b o l i t ei nt h eh y d r o l y s i s o fo r g a n o p h o s p h a t e ss u c ha sp a r a t h i o nw h i c hh a v eb e e nc o m m o n l yu s e da s p e s t i c i d e s ，a sar e s u l t ，i tc a na c c u m u l a t ei ns o i la n dw a t e r ，a n dc a u s e d e l e t e r i o u se f f e c t st ot h eb i o l o g i c a ls y s t e m sd u et ot h e i ra c u t et o x i c i t y 矿n i t r o p h e n o lh a sb e e nl i s t e da sap r i o r i t yp o l l u t a n tb yt h eu n i t e ds t a t e s e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y ao b v i o u sf e a t u r eo fm a n ym i c r o o r g a n i s m s i st h e i rc a p a c i t yf o ru s i n gap a r t i c u l a ro r g a n i cc o m p o u n da st h es o l e s o u r c eo fc a r b o n ，n i t r o g e n ，a n de n e r g y t o d a y ，m a n yr e s e a r c h sh a v eb e e n e x t e n s i v e l ys t u d i e do np - n i t r o p h e n o lb i o d e g r a d a t i o na n d ak n u m b e ro f b i o d e g r a d a t i o np a t h w a y sh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e da n d r e v i e w e d as t r a i nn p _ lt h a tc a nd e g r a d e 矿n i t r o p h e n o lw a si s o l a t e df r o mt h e i l l 中山人学硕士学位论文 s o i ls a m p l e sw h e r ew a sp o l l u t e d t h i ss t r a i nc a ng r o ww i t h 矿n i t r o p h e n o l a ss o l es o u r c eo fc a r b o n 、n i t r o g e na n de n e r g y o nt h eb a s i so ft h e c h a r a c t e r i s t i c so fm o r p h o l o g ya n dt h ea n a l y s i so ft h e1 6 sr d n as e q u e n c e ， s t r a i nn p 一1w a si d e n t i f i e da sp s e u d a m o m b a c t e rs p a n dc o n s i d e r e da st h e n o v e lg e n u sw i t hc a p a c i t yf o rd e g r a d i n g 矿n i t r o p h e n 0 1 i nt h i sr e s e a r c h ，w es t u d i e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c so fg r o w t ha n d b i o d e g r a d a t i o no fp n pi np s e u d a m o n f b a c t e rs p n p 一1 t h er e s u l ti st h a t ： t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rg r o w t ho fp s e u d a m o n i b a o t o ts pn p 一1i s3 5 w h i l et h eo p t i m a lp hi s7 8 ：i nl bm e d i u m ，i tc a n tg r o ww i t h p - n i t r o p h e n o lw h i c h c o n c e n t r a t i o ne x c e e d2 0 0m g l ：t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r e 、p h 、c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c ef o rt h ed e g r a d a t i o no fp n p i np s e u d a m o m b a c t o ts p n p 一1i s3 5 、p h7 4 、g l y c e r i na n d ( n h 4 ) 2 s 0 4 ， r e s p e c t i v e l y ：s u i t a b l ei n o c u h ms i z e f o rt h i ss t r a i nd e g r a d i n gp n pi s b e t w e e di 0 a n d3 0 v a r i o u sm e t a li o n sa n dc h e m i c a c o m p o u n d sm o s t l y r e s t r a i nt h ed e g r a d a t i o no fp n pi np s e u d a m o n i b a c t e rs p n p1 p h e n o l 、 h y d r o q u i n o n ea n dp - b e n z o q u i n o n ea l s or e s t r a i nt h ed e g r a d e r i o no fp n pt o ad if f e r e n te x t e n t r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e d t o o p t i m i z e t h ec u l t u r e c o n d i t i o n sf o rp - n i t r o p h e n o ld e g r a d a t i o ni np s e u d a m o n i b a c t e r s p n p 一1 ，w e g o tt h em o s ts u i t a b l em e d i u mc o n t a i n n i n g ：g l y c e r i n0 5 ，( n h 4 ) 2 s 0 41g l ， k 2 h p 0 41 5g l ，k h 2 p 0 40 7 8g l ，i g s 0 40 8 6g l ，n a c l0 3 9g l t h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n sa l l o w e dt h er a t eo fd e g r a d a t i o no fp n po fs t r a i nn p 一1t ob e i n c r e a s e dt o1 4t i m e s a tl a s t ，w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dag e n o m i cl i b r a r yo fs t r a i nn p 一1 ， w h i c h c o u l db eu s e df o rs c r e e n i n gf u n c t i o n a lg e n ea n do t h e rf u r t h e r r e s e a c h k e y w o r d s ：矿n i t r o p h e n o l ，b i o d e g r a d a t i o n ，1 6 sr d n a ，r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ，g e n o m i cli b r a r y 中山大学碛士学位论文 第一章前言 自然环境中，存在着一个微生物世界，它们与人类、动物、植物及环境形成 了密切的、交互影响的复杂关系。微生物个体微小、种类繁多，目前发现的微生 物已达十多万种，而且相信微生物资源远远不止于此数目，还具有非常巨大的发 掘潜力。微生物数量庞大，它们在自然界形成的生物物质总量为( 2 1 0 ) 1 0l 2 k g ( 以碳计) ，与所有动物包括人类所形成的生物物质总量( 6 1 1 ) 1 0 ”k g 处于 同一个数量级 i 。微生物是生态系统的重要成员，特别是作为分解者分解系统 中的有机物，对生态系统乃至整个生物圈的能量流动、物质循环、净化自然环境 等方面发挥着独特的、不可起替代的作用 2 。目前，环境微生物的研究已经成 为指导与解决其他环境科学许多基本问题的重要领域。随着科技与社会经济的飞 速发展，相伴面来的是环境问题一一环境污染和生态破坏，微生物降解污染物的 巨大潜力在控制污染，修复污染环境中发挥了重要作用。 生物降解的研究始于2 0 世纪4 0 年代，起初人们认为，生物降解是指土壤、水 体和废水生物处理系统中的需氧微生物对天然和合成有机物的破坏或矿化作用。 随着对有机污染物降解过程研究的深入，生物降解的内涵也在不断深化和拓展， 所谓生物降解就是通过生物的作用将污染物分解成小分子化合物的过程。这里生 物类型包括各种微生物、高等植物和动物。虽然高等植物和动物能够代谢和降解 许多有机化合物，但对另外一些有机污染物却不具有降解能力，而微生物却具有 将大多数有机化合物降解为无机物质( 水、二氧化碳和矿物质) 的潜力，所以微生 物是有机化合物生物降解中的首要因子。由于在各种生物降解中微生物所起的作 用最大，所以一般提到生物降解就是指微生物降解。生物修复是近年来才发展起 来的一门新兴技术，其定义是：利用特定的生物( 植物、微生物或原生动物) 吸收、 转化、清除或降解环境污染，实现环境净化，恢复生态效应的生物措施。也有学 者认为：生物修复是指采用工程化方法，利用微生物将土壤、地下水和海洋中的 有毒有害物质“就地”降解成二氧化碳和水，或转化为无害物质的方法。与“生 物降解”相比，在“生物修复”比较强调人为因素。因此，可以认为，生物降解是 一个自然发生的过程，而生物修复则是人为地创造各静条件，促进生物降解的过 中山大学硬士学位论文 程。 随着社会的发展，人类的生存环境形势亦日趋严峻。环境污染是摆在我们面 前的不可回避的待解决大难题。生产、生活垃圾，工业废水、废气，有机农药、 化肥的大量使用，各种生化用品废弃物等等，对我们的生态环境造成巨大威胁， 人类的生命健康也面临着挑战。人们一直在努力探索行之有效的，从资金、操 作、效果等能实现的处理环境污染道路。进行环境治理一般采用物理的、化学的、 生物的或相互结合的方法。生物降解与生物修复给我们提供一条清晰的生物治理 思路。生物治理发展历史并不长，还存在许多不完善的地方，但它的优点正日益体 现，主要表现在如下几个方面： ( 1 ) 高效污染物在自然界中由于光解、水解及微生物降解等各种因素的作用， 总会逐渐降解，但速度相对较慢。生物修复的作用就是加速其降解过程，因而它具 有高效的特点。 ( 2 ) 安全在大部分情况下，生物修复只是一个自然过程的强化，其最终产物是 c0 ：、水和脂肪酸等，不会形成二次污染或导致污染物的转移，可以达到污染物 永久去除的目的，使土地的破坏和污染物的暴露减少到最小程度。 ( 3 ) 省费用生物修复技术是所有处理技术中最便宜的，其费用约为焚烧处理费 用的三份之一到四份之一。 ( 4 ) 应用范围广生物修复技术可以同时处理到受污染土壤和地下水。特别 是在其它技术难以使用的场地，如建筑下或公路下，其它修复方法无法操作，用生 物修复技术则可顺利进行。 微生物是一个具有多功能的化学反应群体，微生物对于难降解的污染物具有 联合降解的群体优势，如对于难降解的污染物，可以通过一些微生物的共代谢机 制，首先将它转化为能被另一些微生物作为碳源与能源的化合物，然后再由另一 些微生物将其彻底分解和转化掉，这样就大大地拓展了微生物对难降解物的作用 范围：对于人类不断合成的各种新颖的化合物具有不断更新的降解能力，所以， 微生物对污染物的降解具有巨大的潜力。由于微生物的代谢类型极其多样，作为 一个整体，作为它的代谢活动能够完成氧化反应、还原反应、脱羧反应、脱氨基 2 中山大学硕士学位论文 反应、水解反应、酯化反应、脱水反应、缩合反应、氨化反应、和乙酰化反应等 各种各样的化学反应。所以，微生物已经成为环境工程中降解污染物的主要工具。 研究表明，微生物在环境污染的压力下，每时每刻都在发生变异，不断地更新它 们的降解能力，不断的产生能降解新污染物的新菌种。因此可以从中筛选出一些 污染物的高效降解菌，也可以利用定向驯化，选育出污染物的高效降解菌，使不 可降解的或难降解的污染物，转变为能可降解的或容易降解的化合物，甚至使它 们迅速高效地去除掉。 微生物对大分子污染物的降解和转化的一般途径 由于大分子污染物是不能透过细胞膜的，首先由微生物细胞产生的胞外酶在 细胞外将其分解为能透过细胞膜的化合物进入细胞，然后，由细胞内酶系统将它 们逐步分解成为能进入三羧酸循环的物质进入三羧酸循环，最后彻底分解为c 0 ： 等。途径如下图： 区匦一匝圣鲴一 匝区垂亟囹一围一圈 微生物分解有机物的能力是惊人的，可以说，凡自然界存在的有机物，几乎 都能被微生物分解。有些微生物，如葱头假单孢菌( p s e u d o m o n a sc e p a c i a ) 甚 至能降解9 0 种以上的有机物，再如，对生物毒性很大的甲基汞，能被抗汞微生 物如p s e u d o m o n a sk 6 2 菌株分解、转化为元素汞，有毒的氰化物、酚类化合物等 也被不少微生物作为营养物质利用、分解；有一些微生物( 如诺卡氏菌属、假单 孢菌属、分枝杆菌属和某些酵母和霉菌) 能降解和转化烃类化合物如石油；多氯 联苯( p c b ) 在工业上应用很广，但对人体有毒害性，在环境中很难降解，美国 研究者曾应用解脂假丝酵母( c a n d y d a l o o 抄t j c ac e r e v i s i a e ) 、红色诺卡氏菌 ( r u b r a ) 、和酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a 甸等混合处理p c b ，使其完 全降解掉；在研究中，很多合成化合物如聚乙二醇、增塑剂、聚乙烯醇等等都有 中山大学硕士学位论文 相应微生物分解。 现代的环境污染迫切需要人们更充分地利用微生物的降解活性，不幸的是有 些化合物含有高度抗酶分解的结构元素或取代基。尽管环境微生物具有逐渐进 化、适应的功能，但酶催化途径的自然进化需要多种基因成分的改变，速度很慢， 不能适应现代环境保护的要求。通过共代谢等各种生物技术的应用，在弄清微生 物降解环境污染物的能力和途径的基础上，应用现代基因工程技术，扩展微生物 酶对基质的专一性和代谢途径，更有效地处理和降解各种污染物，更好地保护环 境。 生物修复被认为是现代环境生物技术的核心内容，其1 7 1 的是将有机污染物的 浓度降低到低于检测限或低于环保部门规定的限度。这项技术正被用于清除土 壤、地下水、废水、污泥、工业塑料和气体中的污染物。金属虽然不能被生物降 解，但生物修复可以通过微生物将其转移或降低其毒性。 生物修复是一门涉及多学科的技术，对它进行深入的研究，需要运用工程科 学、微生物学、农药残留检测技术和分子生物学等多种技术，相信随着这些学科 的发展，生物修复技术将会有更广阔的发展空问。生物修复研究的最终目的是应 用于生产实践。近年来，应用的范围正逐渐扩大，应用技术也日益成熟，但总体上 还不能满足实际需要，今后应加强农药生物修复的应用研究，使之从实验室走向 具体场所。生物修复中主要涉及两大问题，即有效性和安全性评价。为提高有效 性今后将应用分子微生物学分离、鉴别、构建更高效降解和聚集有害有毒化合物 的微生物。为提高生物修复的安全性评价水平，需发展鉴定微生物的分子生物技 术，以确定微生物在环境中的去留和基因。随着应用的发展，生物修复所带来的风 险也应引起高度重视，如工程菌的安全性问题等，如何消除或减轻这些风险，是 摆在我们面前的一项艰巨任务。 1 1 对硝基苯酚及含酚废水的危害 对硝基苯酚是染料、医药、农药等精细化工产品生产的重要中间体，。其生产 是用对硝基氯化苯，在一定条件下进行水解反应，制得对硝基酚钠，再经过酸化 后制得对硝基苯酚。生产过程中排放的废水中除含有硝基苯酚外，还有微量的硝 4 中由大学硕士学位论文 基氯苯和水解反应产生的大量氯化钠。 酚类化合物尤其是硝基苯酚属于国家严格控制排放的有毒物质，硝基芳香族 化合物是重要的化工原料，被广泛地用作医药、染料、农药、塑料等的合成前体， 常常在生产和使用过程中被释放到环境中，对生态系统造成影响 3 ，是一类重要 的环境污染物质。有机磷农药甲基对硫磷在环境中水解也会释放出对硝基苯酚， 虽然农药的毒性降低但产生的对硝基苯酚仍具有相当高的毒性，芳香环上硝基的 引入使得这类化合物的生物降解变得更加困难。这类化合物中硝基为吸电子基， 使得苯环上的电子云密度大大下降，使氧化酶的亲电子攻击大大受阻，造成在 自然界中较难降解，且具有“三致”作用 4 - 6 。由于机磷农药的广泛性应用， 对硝基苯酚在环境中必然积累，危害生态和人类健康。 含酚废水是一种常见的工业废水，其来源广、数量多、危害大，给环境带来 了严重的污染，有害于人类健康及生物的生长繁殖，并且影响经济的可持续发展。 在我国，纺织、制药、橡胶、塑料、树脂、造纸、石油、化肥、油漆、皮革、消 毒剂等工业生产部门排放的废水中均含酚，尤其是焦化厂、煤气厂产生大量的含 酚废水，其含酚量( 挥发酚) 可达1 6 0 0 3 2 0 0m g l 。此外，炼油厂、石油工厂等排 出的废水中，含酚量都很高。由于污水处理的技术水平和成本等的原因，各类型 的工厂、农药厂和电镀厂等大量排出未经处理或处理未达标的污水，其中酚类化 合物是最常见的水体污物 7 - 8 。含酚废水对人类的危害非常严重，酚类是原生 质剧毒物质，人体摄入一定量时，会出现急性中毒症状，长期饮用被酚污染的水， 可引起头晕、出疹、瘙痒、贫血及各种神经系统症状，苯的代谢主要在肝氧化、 代谢、解毒，从而对人的肝脏造成毒害 9 ；酚类对渔业生产、农作物均造成极 大的危害。 由于工业排污等原因，在近岸水体中能检测到许多酚类化合物我国胶州湾 和杭州湾表层海水中酚的含量分别高达3 9m g l 1 0 。酚的毒性严重影响海 水生物的生长和繁殖，危及人类健康；松花江中位于吉林省中部，由于工业的迅 猛发展，松花江每日承纳数百万吨的工业废水，尤其是吉林化工区的染料、石油炼 制、造纸、制药等行业排放的有机废水，使松花江有机污染较为突出，目前已检 出有机污染物3 0 0 余种，而且不断有新的化学品排入江中，其中取代苯类是江中的 主要污染物 1 1 ；杨丽，徐镜波，刘征涛等采用鼠伤寒沙门氏菌体外回复突变试验 中山大学硕士学位论文 ( a m e st e s t ) ，对1 2 种苯酚类化合物( 5 种烷基酚、6 种氯酚、1 种硝基酚) 的 致突变性进行了分析。研究结果表明除2 ，4 一二氯苯酚外，其他1 1 种苯酚类化 合物对t a 9 8 菌株均具有直接致变作用，突变机理可能是移码突变除此之外，对 壬基苯酚对t a 9 7 和t a l 0 0 ，4 - 辛基苯酚对t a 9 7 也分别具有阳性诱导作用 1 2 ； 有研究发现，在渔业生产中，如水中含低浓度的酚类时( 0 卜o 2m g l ) ，会使 生长鱼的鱼肉有异味，高浓度( 7 0 5m g l ) 时造成中毒死亡；含酚浓度高的废 水更不适合灌溉，会使农作物枯死减产甚至失收 1 3 。由此可见，酚类化合物对 环境、人类危害巨大，且其污染形势已经非常严峻。 各国水质标准中对酚的含量都有非常严格的规定。在我国工业废水中酚的排 放规定不得超过0 5m g l ，地面水中不得超过0 0 1m g l 。酚类化合物被美国国 家环保局列入1 2 9 种优先控制污染物之一，含酚废水在我国水污染控制中也被列 为重点解决的有害废水之一，硝基苯酚属于优先监测污染物 1 4 ，治理与监察此 类化合物对保证人类健康和生态的安全具有重要意义，为了达到经济有效地降解 含酚废水，国内外学者进行了大量的研究，清除工业废水中酚及其衍生物的方法 包括：萃取、活性碳吸附、化学氧化、光电氧化和微生物降解等，均取得一定的 成就，而作为一种经济有效且无二次污染的微生物降解方法，有着巨大和必然的 应用前景。自然界存在的微生物，种类繁多、适应性强、具有分解多种多样人工 合成有机物的功能，对于减少污染净化环境具有很大的潜力。关于微生物降解硝 基芳香烃的研究，已有不少报道，并己取得一定的成就。 1 2 对硝基苯酚化学结构极其性质 分子式：c 6 i 。n 0 3 结构式： n 侥 分子量： 1 3 9 1 2 6 中山a - 4 e 硕_ _ = 学位论文 通用英文名称： 性状： 用途： 毒性： p n it r o p h e n o l ，4 - h y d r o x y n i t r o b e n z e n e ， p - h y d r o x y n it r o b e n z e n e ，p n p 淡黄色结晶体，工业品为棕色结晶体。熔点1 1 3 一1 1 4 ， 沸点2 7 9 。溶于乙醇、乙醚及热水中，在空气中氧化颜 色逐渐变深。 可作为医药，染料的原料，亦可作指示剂。 有诱导有机体产生突变的危险，吞食、吸入或通过皮肤接触 会导致中毒，对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激作用，具腐蚀 性。 下面是一些毒性试验数据 1 5 ： o r l - r a t s c u r a t i v n - d 0 6 i p r m u s u n r m a m l d 5 0 l d 5 0 l d 5 0 l d 5 0 l d 5 0 口服 皮下注射 静脉注射 腹膜内注射 还没经报道的 已公布的最低致命剂量 导致实验对象5 0 死亡的致命剂量 1 3 对硝基苯酚降解菌的种类 1 6 3 s 7 g g g k k g g k k k g g g m m g g m m m 2 0 5 0 o o 5 7 2 2 l 7 1 l u n r r l 虻 删 测 中山大学硕士学位论文 近几十年的研究表明，许多微生物参与了对硝基苯酚这类有毒物的生物降解 反应。据不完全的国内外资料看，已发现分离的对硝基苯酚降解菌有： p s e u d o m o n a s ( 假单胞菌属) ，b a c i u s 涝孢杆菌属) ，n o c a r d i a ( 诺卡氏菌属) ， r h o d o c o c c u s 侄工球菌属) ，a c i n e t o b a c t e r ( y f ；动杆菌) ，r a l s t o n ia m o r a x e j a 漠 拉菌属) ，a r t h r o b a c t e r ( 节杆菌属) ，b u r k h o l d e r i ac o p a c i a ( 洋葱伯克霍尔德 菌) ，s p h i n g o m o n a s ( 鞘氨醇单胞菌属) ，r h o d o b a c t e r ( 红杆菌属) ，f l a v o b a c t c r i u m ( 黄杆菌属) 等十多个种属。 7 0 年代以来已报道了十多个种属的几十株细菌能降解硝基苯酚，并陆续发现 降解硝基苯酚的有放线菌、丝状真菌及酵母菌等等；国内伊萍等在硝基苯酚污染 土壤中分离筛选到6 个属包括：芽孢杆菌属、假单胞菌( p s e u d o n o m a 曲、柠檬酸 杆菌属彬i t r o b a c t e r ) 、肠杆菌属陋n t e r o b a c t e r ) 、克氏杆菌属和埃希式菌属 共4 7 株细菌和酵母属、青霉菌属等菌株能转化硝基苯酚类化合物。p a n d e yg 和 c h a u h a na 等分离的r a l s t o n i as p s j 9 8 可以利用p - n i t r o p h e n o l ( p n p ，对硝基 苯酚) ，4 一n i t r o c a t e c h o l ( n c ，4 - 硝基儿茶酚) ，0 一n i t r o b e n z o a t e ( o n b ，间硝 基苯甲酸盐) ，p - 一n i t r o b e n z o a t e ( p n b ，对硝基苯甲酸盐) ， 和 3 - m e t h y l 一4 一n i t r o p h e n o l ( m n p ，3 一甲基一4 一硝基苯酚) 作为唯一碳源与氮源生长； z a b l o t o w i c zr m 等分离一株s p h i n g o m o n a ss t r a i nu g 3 0 可以矿化r n i t r o p h e n o l 和p e n t a c h l o r o p h e n 0 1 ( p c p ，五氯苯酚) 。总之，自然界中能降解对硝基苯酚的 微生物资源正在不断被发现，而且很多菌株的底物范围很广，这些菌种不仅为研 究对硝基苯酚生物降解的代谢途径及遗传调控基础理论提供丰富的材料，而且这 些生物资源也也可以应用于硝基芳香烃的生物治理，对生态环境的净化作出贡 献。 1 4 对硝基苯酚生物降解途径 微生物分解硝基芳香烃化合物有下面四个策略 3 9 ： ( 1 ) 对于一些带有两个或者三个硝基的芳香烃化合物，有的细菌首先攻击苯 环，羟基化形成某种中间体，而且此过程伴随着硝基释放； 中山久学硕士学位论文 ( 2 ) 在单加氧酶催化下，在硝基苯上引入一个氧原子，同时释放硝基； ( 3 ) 双加氧酶在许多种的硝基芳香烃化合物的芳香环上加入两个羟基，使硝 基释放出来； ( 4 ) 先将硝基化合物上的硝基还原为相应的羟胺，然后在酶的催化下重排转 化为羟基化合物，后者进一步裂坏反应进入下一步降解，此类型的化合物有 n i t r o b e r l z e n e ，4 一n i t r o t o l u e n e 与4 一n i t r o b e n z o a t e 等。 对硝基苯酚可以为微生物提供c 和n 元素，能完全矿化对硝基苯酚的微生物 可以以其为唯一碳源、氮源和能源生长。细菌降解p n p 一般有两个经典途径：( 1 ) b q h q ( b e n z o q u i n o n e h y d r o q u i n o n e ) i j 空；( 2 ) t h b ( 1 ，2 ，4 - t r i h y d r o x y b e n z e n e ) 途径。这两个途径都最终将p n p 氧化还原为m a l e y l a c c e t a t e ，然后进一步生成 酮戊酸进入三羧酸循环彻底氧化为c o ：和水。p n p 详细生物降解途径请参考下页 图1 “4 0 。 第一个途径在革兰氏阴性菌里面比较常见，m a r a x e l l as p 和b u r k h o l d e r i a c e p a c i ap k j 2 0 0 菌株就是通过此途径，对硝基苯酚可能经由b e n z o q u i n o n e ( 1 ， 4 一苯醌) 氧化还原生成h y d r o q u i n o n e ( 对苯二酚) ，此过程伴随着硝基的释放， 双加氧酶裂解h y d r o q u i n o n e 生成4 - h y d r o x y m u c o n i cs e m i a l d e h y d e ，后者在酶 作用下转化为m a l e y l a c c e t a t e ，进入下一步降解 4 1 ； a r t h r o b a c t e rs p 通过 第二个途径降解p n p ，p n p 先被还原为4 - n i t r o c a t e c h o l 或者4 一n i t r o r e s o r c i n o l ， 单加氧酶催化下释放出硝基同时生成1 ，2 ，4 一t r i h y d r o x y b e n z e n e ( t h b ，1 ，2 ，4 ， 一苯三酚) ，1 ，2 ，4 t r i h y d r o x y b e n z e n e 在酶催化裂环生成m a l e y l a c c e t a t e ，后 者在一系列的酶作用下最终氧化为二氧化碳和水 4 2 ，有文献报道， h a v o b a c t c r i u ms p 和n o c a r d i as p 也属于这一降解途径。细菌在降解对硝基 苯酚的过程中，可以获取其生长所需的c 源、n 源与能源，体现着微生物与污染 物之间一种相互作用的奇妙关系。 9 中山入学硕士学位论文 0 0 s c e a o 蝥。西r 五= j 斋卉嗣l ：g ! ：竺：竺：l o h a 。 回 图1 1p n p 生物降解途径示意图 s c e a 。太。圆 f i g 1 1 p n pd e g r a d a t i v ep a t h w a y sb y i c r o o r g a n i s m 中由大学硕士学位论文 1 5 对硝基苯酚降解酶的研究 微生物降解对硝基苯酚全过程不是由一个单酶完成的，是在一系列酶共同作 用下的结果。但第一步酶促反应非常关键，决定着对硝基苯酚继续进一步的降解。 目前为止，对硝基苯降解酶已经有不少的研究报道，但总的来说还不是非常的全 面深入，只是处于研究的一个初步阶段，特别是国内，几乎找不到关于这方面的 详细报道。对p n p 降解酶酶系的研究具有非常重要的意义，它可以使人们进一步 清楚硝基苯酚酶促降解的具体机理，在此基础上找出可以人为控制的因素，为高 效、经济地处理硝基苯酚类污染物提供一个科学的理论基础。 在上一节微生物分解硝基芳香烃化合物途径已经提到，细菌移去硝基苯上的 硝基有几种不同的策略，其中不同的途径涉及不同类型的催化酶。最早有关此类 酶报道的是p - n i t r o p h e n o l 一2 一h y d r o x y l a s e ( 对硝基苯酚一2 一羟化酶) ，在 n o c a r d i as p 菌株的细胞粗提液中发现，它可以将p n p 转化为 4 - n i t r o c a t e c h o l 4 3 ：z e y e ra n dk o c h e r 4 4 从p s e u d o m o n a sp u t i d ab 2 纯化 到一个可溶性硝基苯酚加氧酶，这个酶可以将o r t h o - n i t r o p h e n o l 氧化生成 c a t e c h o l ( 儿茶酚) 和亚硝酸盐：e c k e r e ta 1 4 5 3 指出在2 ，6 一d i n i t r o p h e n 0 1 ( 2 ，6 - 二硝基苯酚) 的降解中，d i o x y g e n a s e ( 双加氧酶) 对硝基基团发出攻 击并将它转移掉；据文献报道4m e t h y l 一5 一n i t r o c a t e c h o lo x y g e n a s e 从 b u r k h o l d e r f a s p s t r a i nd n t 4 6 纯化出来，此酶可以将 4 - m e t h y l 一5 一n it r o c a t e c h o l 氧化生成苯醌并伴随着释放出硝酸盐。 1 5 1m o r a x e l l as p 的对硝基苯酚降解酶酶系 s p a i a 和g i b s o n 两人详细研究了m o r a x e l as p 降解对硝基苯酚的途径并研 究了此降解途径的一系列酶 4 1 ，比较具体深入的揭示了m o r a x e l l as p 在h q 途径中的对硝基苯酚酶解机理。 ( 1 ) p n p o x i d i z i n ge n z y m e 和n a d p d e p e n d e n tq u i n o n er e d u c t a s e ： 中由太学硕士学糠论文 研究表明：对硝基苯酚先在p n p o x i d i z i n ge n z y m e ( p n p 加氧酶) 作用下生成 最初产物对苯醌，苯醌随后被n a d p d e p e n d e n tq u i n o n er e d u e t a s e ( 依赖于n a d h 的对苯醌还原酶) 还原生成对苯二酚，他们认为催化这两步反应的酶是一起结合 于细胞膜上并且是不可分开的，所以降解过程中对苯醌不会积累，因为它很快就 会被还原为对苯二酚，在此步酶促反应中，p n p 的硝基释放出来并被羟基取代： ( 2 ) d i o x y g e n a s e ： 对苯二酚在d i o x y g e n a s e ( 双加氧酶) 催化下裂环生成4 一b d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e ，后者在相应酶作用下转化为m a l e y l a e e t a t e ，4 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e 作为中间产物可以被高效液相色谱( h p l c ) 检测到，d i o x y g e n a s e 是一个可溶性酶，催化活性依赖于f e 离子并被环裂解酶的抑制剂 2 2 一d i p y r i d y l 抑制： ( 3 ) m a l e y l a c e t a t er e d u c t a s e m a l e y l a c e t a t e 在途径中会迅速降解产生酮烷酸，但s p a i a 和g i b s o n 并没能 在实验当中检测到m a l e y l a c e t a t er e d u c t a s e ，但他们指出：当h y d r o q u i n o n e 转化为m a l e y l a c e t a t e 时没有发现n a d h ，但h y d r o q u i n o n e 进一步转化为酮烷酸 时却有n a d h 出现，而n a d h 正是m a l e y l a c e t a t er e d u e t a s e 催化机制所必需因子， 因此他们推测，m o r a x o l l as p 实际上是存在m a l e y l a c e t a t er e d u c t a s e 的，只 是由于某些未知的原因导致不能检测到。 1 5 2b a c i l l u ss p h a e r i c u sj s 9 0 5 的对硝基苯酚降解酶 b a c i l l u ss p h 鲁e r j c u sj s 9 0 5 是经由t h b 途径降解对硝基苯酚的 4 7 ，与 f o r a x e l l as p 的降解途径不同，所以它们催化降解的酶也有所差异。 m o n o o x y g e n a s e ： 中山大学硕士学位论文 这是v e n k a t e s w a r l u 和k a d i y a l a 等在b a c i l l u ss p h a e r i c u sj s 9 0 5 中纯化 到的p n p 单加氧酶。m o n o o x y g e n a s e 催化第一第二步反应，先将p n p 羟基化生成 4 一n i t r o c a t e c h 0 1 ，4 一n it r o c a t e c h o l 随后氧化生成t h b 并移掉硝基，后者以硝 酸盐形式释放出来。研究发现：这个酶由两个部分a 和b 组成，基团a 是一个黄 素蛋白，是一个还原酶，基团b 表现出羟基化酶活性，基团a 和b 都对p n p 最初 两步降解非常重要，如果失去其中之一就失去催化活性，即单独的基团a 或基团 b ，都不能将p n p 硝基取代并将它转化为t h b ，只有两者结合才具备完整的酶促 催化能力。m o n o o x y g e