（外科学专业论文）肿瘤免疫治疗中ctl细胞、treg细胞及其相关性研究.pdf

t l 目录 l l i i i i ii iii i i1 1 1 1 1 1 1i il y 1 8 019 5 5 中文摘要 1 英文摘要 6 英文缩写 0 00 0 0 0060000 1 2 研究论文肿瘤免疫治疗中c t l 细胞 t r e g 细胞及其相关性研究 引言 1 4 第 部分t r e g 细胞在肿瘤特异性c t l 细胞对b 1 6 黑色素瘤的 体外杀伤试验中的作用 前言 1 7日f j 舌 一 一 一 l 材料与方法 o 0 9 doo oooooo 1 8 结果一 一 一 一 2 5 附图 2 7 附表 3 0 毫于论 3 1 卜结 3 3 参考文献 3 3 第二二部分t r e g 细胞对特异性c t l 体内杀伤试验中瘤细胞增殖与 凋亡的影响 萄百言 3 6习i j 吾 一 3 b 材料与方法 3 7 结果 一 4 3 附图 一 一 一 4 5 附表 一 5 1 讨论 5 2 j 结 一 一 5 5 参考文献 5 5 第三部分t r e g 细胞对特异性c t l 体内杀伤试验中抑瘤作用的 形态学观察 前f 言 一 5 8月 j 舌 一 一 一 a 毯 材料与方法 5 9 3 9 o 4 7 3 5 8 9 2 2 6 8 o 2 2 4 一b 0 o 1 6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9 9 9 l l 1 一 一景 一 一 一 挂 g 一 1 h r j r o r 7 扣 d y 献化 方 一 一献一 一 一 一 一 文 与 文 一 果图表论结考分言料果表论结考 一历 结附附讨小参部前材结附讨小参一 一 二 筒 丁1 人匕扛企 嚣一 甜 四 论述述谢人 第 结综综致个 中文摘要 肿瘤免疫治疗中c t l 细胞 t r e g 细胞及其相关性研究 摘要 目的 恶性肿瘤发病率增高 严重危害人类健康 目前针对肿瘤手术 放疗 化疗三大常规治疗方法却远远不能改变肿瘤治疗的现状 近年来随 着分子生物学技术的发展 免疫学理论不断丰富 现代免疫学技术也在不 断地推陈出新 人们从细胞和分子水平上对肿瘤与免疫系统的关系有了更 深刻的认识 为肿瘤免疫疗法在临床上的应用奠定了坚实的基础 过继性 细胞免疫疗法 a d o p t i v ec e l li m m u n o t h e r a p ya c i 已经成为继手术 放疗和 化疗后的第四种治疗模式 过继性细胞免疫疗法是指向肿瘤患者转输具有 抗肿瘤活性的免疫细胞 直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细 胞 达到治疗肿瘤的目的 蟊前以抗体疗法 t 细胞疗法和肿瘤疫苗为代 表的肿瘤被动免疫和主动免疫治疗 己经取得显著的进展 作为肿瘤治疗 的辅助手段在临床上显示出光明的应用前景 过继免疫治疗的关键在于筛选具有肿瘤特异性杀伤作用的效应细胞 肘靶细胞即肿瘤细胞产生致命的杀伤 以实现过继免疫治疗高效低毒的特 点 具有肿瘤特异性的细胞毒t 细胞 c y t o t o x i ctl y m p h o c y t ec t l 具有 杀瘤谱广 杀瘤活性高 增殖能力强等特点成为过继免疫治疗中常用效应 细胞而倍受关注 如何提高c t l 细胞数量及活性 增强其抗肿瘤特异性 是提高过继免疫治疗效果的关键 树突状细胞 d c 是迄今为止发现的效力最强的抗原递呈细胞 具 有高效摄取 加工 递呈肿瘤相关抗原 并激活初始免疫反应的独特功能 本实验利用c 5 7 b l 6 小鼠d c 细胞与t 细胞共同培养 并且负载b 1 6 黑 色素瘤特异性抗原 以便获得数量更多 杀伤活性更高 更具有特异性的 抗肿瘤效应细胞d c c t l 但是在体内试验中发现 抗肿瘤效应细胞在肿瘤微环境中通常被诱导 进入 免疫无能 i m m u n ea n e r g y 状态 因此不能有效地识别和杀伤肿 瘤细胞 出现效应细胞与肿瘤细胞大量共存的尴尬局面 消除体内的免疫 抑制细胞 充分发挥效应细胞的功能 对于提高肿瘤的治疗效果具有重要 意义 中文摘要 c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞c d 4 细胞的新成员 目前较为常用的是根据产 生的途径不同将c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞分为自然产生的调节性t 细胞 n a t u r a lr e g u l a t o r ytc e l l sn t r e g 和诱导产生的调节性t 细胞 i n d u c e d r e g a l a t o r yt c e l l si t r e g 两类 大量研究发现在霄癌 肺癌 乳腺癌等癌 症患者的外周血 肿瘤浸润淋巴结中都可以检测出c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞 c d 4 十c d 2 5 t r e g 细胞可能通过识别肿瘤抗原后活化发挥其免疫抑制作用 c d 4 c d 2 5 t r e g 通过细胞间相互接触或分泌细胞因子等机制 抑制机体 抗肿瘤免疫应答的产生 使机体处于对肿瘤低应答或无应答状态 这些研 究说明c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞对于肿瘤的免疫治疗是 个重要的障碍 因 此寻找既能增强免疫效应细胞的抗肿瘤作用又能抑制或清除 c d 4 斗c d 2 5 t r e g 细胞阻抑作用的方法 将是提高和改善肿瘤免疫治疗的 个崭新途径 本研究将b1 6 黑色素瘤特异性抗原致敏的成熟d c 与t 细胞共同培 养 诱导生成具有肿瘤特异性免疫效应细胞d c c t l 而且应用免疫磁珠 分选的方法 m a g n e t i cc e l ls o r t i n g m a c s 去除c d 4 c d 2 5 1 t r e g 细胞成分 从体外杀伤试验 体内的抑瘤效果 细胞形态学变化 对细胞增殖和凋亡 的影响等多方面观察d c c t l 细胞的杀伤效果 同时比较于t 细胞分化 形成c t l 的不同时期删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞成分对d c c 2 l 特异性杀 伤效果的影响 从而探究d c c t l 细胞 t r e g 细胞在抗肿瘤免疫中所起 的作用以及相互关系 为肿瘤的免疫治疗提供理论基础及实验室资料 方法 本实验以c 5 7 b l 6 小鼠的b1 6 黑色素瘤动物模型作为研究对 象 制备黑色素瘤动物模型 并应用6 0 c o 对小鼠黑色素瘤动物模型进行 照射 使小鼠机体达到非髓性淋巴细胞删除状态 则c 5 7 b l 6 小鼠的黑 色素瘤动物模型的免疫细胞丧夫 便于效应细胞回输完成免疫重建 取小鼠脾脏制备d c 和t 细胞 b 1 6 黑色素瘤细胞采用冻融法制备肿 瘤全抗原 将b 1 6 黑色素瘤抗原致敏d c 细胞完成肿瘤全抗原的负载 将 d c 与t 共同培养 诱导t 细胞分化产生效应细胞c t l 并通过流氏细胞 术检测d c 细胞的免疫表型 确定d c 细胞成熟活性 用m a c s 法分别 td c 细胞与t 细胞共同培养前后删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞成分 便得 到培养前删除c d 4 c d 2 5 十t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞与 培养后删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞2 组 中文摘要 另设未删除c d 4 c d 2 5 十t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞组及 对照组2 组 然后再将n m l d 状态的b 1 6 黑色素瘤c 5 7 b l 6 小鼠8 0 只 按随机 数字表法分为4 组并经鼠尾静脉进行效应细胞d c c t l 回输 第l 组 培养前删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞组 第2 组 培养后删除c d 4 c d 2 5 十t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞组 第3 组 未删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的 d c c t l 细胞组 第四组 对照组 采用m t t 染色法检测4 组的体外杀伤实验 观察效应细胞d c c t l 对b 1 6 黑色素瘤的杀伤效果 同时观察体内回输d c c t l 效应细胞后小 鼠的生活习性 肿瘤的临床特征 d c c t l 细胞及靶细胞的超微结构与细 胞增殖与凋亡特征等形态学表现 证实特异性抗原负载的d c c t l 细胞 对肿瘤的杀伤效能 最后 运用流氏细胞术 f i a c s 及酶联免疫吸附实验 e l i s a 检 测人体内t r e g 细胞 t n t q 及i l 1 2 含量变化 证实化疗药物的抗肿瘤 彬 l r 币1 t 0 及对机体免疫系统的影响 结果 d c 细胞诱导负载b 1 6 黑色素瘤肿瘤抗原的d c c t l 细胞活 化时可见细胞增大 胞质丰富 活力良好 与肿瘤细胞接触后则诱导肿瘤 细胞出现凋亡及胀亡表现 高效杀伤肿瘤细胞 培养前删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞的具有肿癯特异性的d c c t l 细胞 组 培养后删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞 组 未删除c d 4 4 c d 2 5 t r e g 细胞的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞组 m q t 法体外杀伤试验 三组效应细胞对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用 培养前删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞d c c t l 细胞组和培养后删除 c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞d c c t l 细胞组对8 1 6 黑色素细胞的杀伤作用明显 高于 p 0 0 5 b 1 6 黑色素瘤的体内抑瘤试验三组实验组d c c t l 细胞均可使瘤体 缩小 抑瘤率明显高于对照组 p o 0 5 2 组删除c d 4 十c d 2 5 1 t r e g 细胞 的具有肿瘤特异性的d c c t l 细胞组抑瘤率明显高于未删除 中文摘要 c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞d c c t l 效应细胞组 p 0 0 5 流氏细胞术检测肿瘤细胞增殖周期的变化 3 组实验组与对照组比较 g o g l 期细胞比率 a i 显著升高 s 期无明显变化 g 2 胱期细胞比率 p i 显著下降 p o 0 5 删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞成分两组g o g 1 期细胞 比率 a i 明显高于未删除c d 4 c d 2 5 t r e g 组 g 2 m 期细胞比率 p i 显 著低子未删除c d 4 c d 2 5 t r e g 组 s 期无明显变化 p o 0 5 化疗药物改变肿瘤患者体内t r e g 细胞 n 妤一o 及i l j 2 含量 三种 指标不仅说明化疗药物对机体免疫机能有显著影响 而且还可以做为评估 化疗效果的指标 结论 l 特异性抗原致敏的d c c t l 细胞对b1 6 黑色素瘤细胞有较强的杀 伤作用 特异性抗原致敏的d c c t l 细胞可以作用于肿瘤细胞的细胞周 期 影响肿瘤细胞的增殖与凋亡 充分说明d c c t l 细胞是一种具有强 大肿瘤杀伤能力且具有肿瘤特异性的过继免疫治疗的效应细胞 2 删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞成分后的特异性抗原致敏的d c c t l 细 胞抗肿瘤免疫效应更具特异性与高效 说明c d 4 十c d 2 5 t r e g 能够抑制具 有肿瘤特异性的效应细胞d c c t l 去除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞 重新募 集效应性t 细胞能够增强机体的抗肿瘤作用 必将成为一种可行的肿瘤 免疫治疗方法 3 不同时间删除c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞后 从抑瘤作用 对肿瘤细胞 细胞周期的影响和对肿瘤细胞的杀伤作用上都有一定的差异 但没有统计 学意义 说明c d 4 c d 2 5 t r e g 细胞各个亚群的来源和作用机制还需要进 步的研究 4 化疗药物改变机体内c d 4 c d 2 5 t r e g n 师 及i l 12 含量 对 机体免疫系统有显著影响 同时也是评估化疗效果的指标 联合使用中药 可以减轻其毒副作用 一 查垫墨 一 一一 关键词 树突状细胞 细胞毒t 细胞 c d 4 c d 2 5 t 细胞 黑色素瘤 免疫耐受 免疫治疗 一 5 英文摘要 r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc t lc e l l sa n dr e g u l a t o r ytc e l l si n a n t i m i n o ri v a m u n i w a b s t r a c t o b j e c t i v e a d o p t i v ei m m u n o t h e r a p yi so n eo ft h eh o t t e s ts u b j e c t si n b i o t h e r a p yo ft u m o r t h et r e a t m e n ti sn o to n l yt h es u p p l e m e n tt oc o n v e n t i o n a l t h e r a p ys u c ha ss u r g i c a lo p e r a t i o n c h e m o t h e r a p ya n dr a d i o t h e r a p y b u ta l s o g i v i n g t h ef o u n db a s ef o rt h ec l i n i c a lt r e a t m e n tt ot h et u m o rn o w w i t h e f f e c t o rc e l l sb e i n gi n p u tb a c ki n t o c h ep a t i e n t t h e yc a nk i l lt h et a r g e tc e l la t o e c ew i t hl i t t l es i d ee f f e c t sa n dt o x i c a n te f f e c t sd u r i n gt h et r e a t m e n t a d o p t i v e i m m u n o t h e r a p 5 7h a sg o o dt h e r a p e u t i ce f f e c to nt h et u m o r b e c a u s ei tc a n m i n i m i z et h et u m o ra n dk i l it h ec e l l sa n db l o c kt h e i rt r a n s f e ra n dr e c i d i v i s m c y t o t o x i c tl y m p h o c y t e c t l c e l s a so n eo f t h en e w t y p e i m m u n o c o m p e t e n c ec e l l s h a v eh i g he f f i c i e n c yi na n t i t u m o ri m m u n i w c t lc e l l sh a v ew i d e s p r e a du s a g ei nv a m o ra d o p t i v ei m m u n et i a e r a p y b e c a u s e t h e ys h o wh i g h l ye f f c i e n tc y t o l y f i ce f f e c t f a s t e rp r o l i f e r a t i o ns p e e dr a t et h a n o t h e ri m m u n o c o m p e t e n c ec e l l si na n t i t u m o ri m m u n i t y t h ek e yo fs t u d i e si s t of i n dh o wt oe n h a n c et h e i rc y t o y t i ca n da n t i t u m o rs p e c i f i c i t ya c t i v i t ys o t h a ti tw i l ll e a du st oab r i g h tf f t t u r ei nt u m o rt r e a t m e n t d e n d r i t i cc e l l s d c a r et h em o s t p o t e n ta n t i g e np r e s e n t i n gc e l l s a p c 1 w t nt h ea b i l i t yt oa c q u i r e p r o c e s s p r e s e n ta n t i g e n sa n dt h eu n i q u ec a p a b i l i b o fi n i t i a t i n g p r i m a r yi m m u n er e s p o n s e sa g a i n s tt u m o r a s s o c i a t e da n t i g e n s d c sc r nt u mt h etc e l l si n t ot h ea c t i v ec e l l sw i t hh i 馥a b i i i r yt oa n t i t u m o r 7 f h ek i l l e rc e l l sa r ew e l lk m o w na st h ec t l s w ec a ns e p a r a t ed e s tc e l l s f r o mt h es p l e e na n dc u l t u r er e s p e c t i v e l y t h e nd c sa r el o a d e dw i t hs p e c i f i c t u m o ra n t i g e n b16m e l a n o m a w ec a nc o c u l t u r et u m o ra n t i g e n s e n s i t i z e d d c s w i mtc e i l s 獬dt h e nt h ed c sc a nt u r nt h etc e l l si n t ot h ec t l s t h e c f l si n d u c e db yt h et u m o ra n t i g e n s e n s i t i z e dd e sh a v eh i g h e ra c t i v i t y c y t o i i ce f f e c ta n dm o r ea n t i t u m o rs p e c i f i c i t y w ec a no b t a i nt h ee f f e c t o r c e l sd c c t l sw i t ht h et u m o r s p e c i f i ca n t i g e nt ob 16m e l a n o m a 6 英交摘要 b u ti np r a c t i c e t h ee f f e c t o rc e l l sa n dt u m o rc e l l sc a nb es e e na l i v e t o g e t h e rp e a c e f u l l y i nt h et u m o rm i c r o e n v i r o n m e n t t h ea n t i t u m o r i m m u n o c o m p e t e n c ec e l l sa r er e d u c e di n t oi m m u n ea n e r g ya n di m m u n o l o g i c a l t o l e r a n c ec o n s t a n t l y s ot h ee f f e c to ft h ec t lst ok i l lt h et u m o rc e l l sd e s c e n d s o b v i o u s l y i ti sv e r yi m p o r t a n tf o ru st od e l e t et h ei m m u n o d e p r e s s i o nc e l l sa n d i n c r e a s et h ea n t i t u m o re f f e c t t h a ti st h en e ww a yt ot u m o ri m m u n o t h e r a p y c d 4 c d 2 5 r e g u l a t o r ytc e l l sa r ean e wm e m b e ro ft h ec d 4 t c e l l s t h e ya r et h em o ei m p o r t a n ts u b s e to fr e g u l a t o r ytc e l l s t r e g t h a tp l a ya l l e s s e n t i a lr o l ei nm a i n t a i n i n gi m m u n o l o g i c a ls e i f t o l e r a n c e t h e yh a v et h e f u n c t i o no fd o w n r e g u l a t i n gt h et u m o ri m m u n i t ym e d i a t e db ytc e ll s c d 4 c d 2 5 t r e g sa l s oa r ed i v i d e di n t ot w og r o u p sb yp r o d u c e dc h a n n e l t h e 1 w c g r o u p sa r en a t u r a lr e g u l a t o r ytc e j i s n t r e g a n di n d u c e dr e g u l a t o r yt c e l i s i t r e g c d 4 一c d 2 5 十t r e g si n c r e a s ei nt h ep e r i p h e r a lb l o o da n d t u m o r i n f i w a t i o nl y m p h o g l a n d u ai nm a n yt u m o rp a t i e n t s s u c ha sb r e a s tc a n c e r l u n gc a n c m g a s t r i cc a n c e ra n ds oo n c d 4 c d 2 5 十t r e g ss u p p r e s sl m n r a d e r e s p o n s e sm a m 1 yb yc e l lc o n t r a c t d e p e n d e n ti n t e r a c t i o n so rs e c r e t i n gs o l u b l e c y t o k i n e s t h o r o f o r e t od 毒l e t eo ra t t e n u a t et h ee f t 色c to fc d 4 c d 2 5 r f r o g s w i l le v o k ee f f e c t i v ea n t i t u m o ri m m u n i t y w h i c hm a yb e c o m eaf e a s i b l e i m m u n o t h e r a p yf o rc a n c e r w i t ht h i s e x p e r i m e n t w eu s et h es p e c i f i ca n t i g e n s e n s i t i z e dd c c t l c e i sa st h ea n t i t u m o ri m m u n o t h e r a p yc e l l st oc u r et h eb16m e l a n o m at u m o r a n i m a lm o d e l w ec a no b s e r v en o to n l yt h em o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n c e c e l l c y c e c e l ip r o l i f e a t i o na n d c e i la p o p t o s i si nv i v o b u ta l s ot h ek i l l i n ge f f e c ti n v k r o m o r e o v e r t h ed e l e t i o no ft h ec d 4 十c d 2 5 十t r e g sb ym a g n e t i cc e l l s o r t i n g m a c s a n do b s e r v a t i o nt h ei n f l u e n c eo nt h ek i l l e f f e c t i o ni nt h e t l l i t o rt r e a t m e n ts h o w st h er e a t i o n s h i pc d 4 十c d 2 5 t r e g sa n dt h ea d o p t i v e u m n u n o t h e r a p yi nb 16m e t a n o m a i nt h i s 踌硪w em a ya n a l y s ea n dd i s c u s s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd c c t lc e l l sa n dr e g u l a t o r ytc e l l si na n t i t u m o r i m m u n i t yi no r d e rt of i n dm o r et r e a t m e n tm e t h o d sa n dt h e o r yf o u n d a t i o nt o c li n i c a lt h e r a p yi na n 己i t u m o ri m m u n o t h e r a p y t h o u g ht h ee x p e r i m e n t m e t h 8 d s t h e 鹜16m e l a n o m at u l i 娃o rc o l i sa r ec a l t u r e di nv i t r oa n d 英文摘要 i n i e c t e di n t ot h ec 5 7 b l 6m o u s eb o d yt om a k et h ea n i m a lm o d e l s t h e nt h e a n i m a lm o d e l sa r ei r r a d i a t e db y 叫c o r a yo nt h et o t a lb o d vi no r d e rt o e li m i n a t ei t si m m u n o lf u n c t i o n t e nt h ea n i m a lm o d e l si nan o m a r r o w l y m p h o c y md e l e t i o n n m l d s t a t e i ti sas p e c i a lp e r i o df o r u st or e s t i t u tt h e i m m u n es y s t e mw i t hn e wi m m u n o c e l l s d c sa n dtc e l l sa r ei s o l a t e d 盘o mc 5 7 b l 6m o u s e s p l e e n b yt h e a n a l y s i so ft h ed c si m m u n ee p i t o p et os h o wt h em a t u r es t a g e t h ed c sa r e c u l t u r e da n dl o a d e dw i t ht h ebl6m e l a n o m at u m o rs p e c i a la n t i g e n d c sc a n i n d u c et h etc e l l si n t ot h ed c c t l sw i t ht u m o rs p e c i f i c i t y b e f o r ea n da f t e r c u k u r e a n t i g e n s e n s i t i z e d d c c t l sw e r e g o t t e n t h e m e t h o do fm a c s s y s t e mw a su s e dt od e l e t ec d 4 十c d 2 5 十r e g u l a t o r ytc e l l s s ow eh a v et w o g r o u p sa n t i t u m o ri m m u n o c o m p e t e n c ec e l l s d c c t lw i t h o u tc d 4 c d 2 5 t r e g s t h e ya r ea f t e ra n db e f o r et h ec u l t u r eo fd c c t lb yu s i n gm a c s s s t e mt od e l e t ec d 4 i c d 2 5 t r e g sr e s p e c t i v e l y 胎a l s oh a v et h et h i r dg r o u p t h es p e c i f i ca n t i g e n s e n s i t i z e dd c 乙 卫t lc e l l sw i 也o u td e i e t i o nc d 4 7 c d 2 5 7 r e g u a o r ytc e l l s t h ef o r t hg r o u pt h ec o n t r o lg r o u p 80c a s e so fc 57 b l 6m o u s ea n i m a lm o d e l sh a eb e e nr a n d o m l yd i v i d e d i n t o1 4 0 u rg r o u p s t h ef i r s tg r o u p t h et u m o rs p e c i f i c i t yd c c r lt h a tg e t s b e f o r et h ec u l t u r et od e l e t ec d 4 十c d 2 5 十t r e g s t h es e c o n d g r o u p t h et u m o r s p e c i f i c i t yd c c t l t h a tg e t sa r e rt h ec u l t u r et od e l e t ec d 4 c d 2 5 十t r e g s t h e t h i r d g r o u p t h e t u m o r s p e c i f i c i t y d c c t lt h a t g e t s w i t h o u td e l e t i o n c d 4 c d 2 5 t r e g s t h ef o r t hg r o u p t h ec o n t r o lg r o u pt h a ti s t ou s en o r m a l s o d i u m t oi n s p e c td c c t l s k i l l i n ge f f e c tt ob16m e l a n o m ai nv i t r ob yt h e m e t h o do fm o n o n u c l e 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