（发酵工程专业论文）l组氨酸产生菌的选育及其发酵条件的优化.pdf

摘要 摘要 本论文应用代谢控制发酵原理，系统地研究了l 组氨酸产生菌的选育、摇瓶发酵培 养基、发酵条件以及葡萄糖酸钙对产酸的影响。主要研究内容和结果如下： 在分析了l 组氨酸和核苷酸生物合成途径的关系及代谢途径反馈调节机制的基础 上，确定了l 组氨酸高产菌的定向育种方案。以谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a - m i c u m ) w h 0 5 0 6 ( s h i - , a m t r ) 为出发菌株产酸量为5 3 l g l ，经u v 、n t g 及d e s 逐级诱 变处理，依次赋予腺嘌呤脱氨酶营养缺陷型( a d e n a s e ) 、次黄嘌呤营养缺陷型( h x 3 、黄嘌 呤营养缺陷型( x a n 3 、l 组氨酸酶缺陷型( h i s t a s e 。) 、6 一巯基嘌呤抗性抗性( 6 一m p r ) 、5 氟尿 嘧啶( 5 f u r ) 最终获得一株l 组氨酸产生菌w h l 2 6 3 ( s h i ，a m t k ，a d e n a s e ，h x 。，x a n ， h i s t i d a s e ) 产酸量为8 5 0 9 l ，产酸较出发菌提高了6 0 。 对菌株w h l 2 6 3 进行传代1 0 次培养，发酵7 2 h 产酸量变化很小。证明该菌株具有 遗传的稳定特性。 利用单因素、正交实验及响应面方法，对摇瓶分批发酵培养基及发酵条件进行优化。 得出了最佳碳源为葡萄糖糖、氮源为硫酸铵，得到的最佳培养基为( g l ) ：葡萄糖9 9 o o ， ( n h 4 ) 2 s 0 42 9 3 0 ，k 2 h p 0 4 。3 h 2 01 2 5 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 0 ，c a c 0 32 0 0 0 。z n z + 、m g 计、 f e 2 + 和m n 2 + 浓度分别为2 2 m m o l l ，1 8 m m o l l 、1 2 m m o l l 和0 2 7 m m o l l 时，组氨酸产 量达到最大。培养基初始p h 7 ，0 ，接种量6 7 ，装液量1 5 m l 2 5 0 m l 三角瓶，往复式摇 床3 0 0 c ，摇瓶转速1 0 0 次r a i n ，发酵周期7 2 h 。产酸为1 0 3 0 9 l 。 通过添加葡萄糖酸钙来增加葡萄糖酸激酶的活性，改变细胞的糖代谢途径。使l 组氨酸产量提高到1 0 5 0 9 l 。 关键词：l 组氨酸；谷氨酸棒杆菌；诱变育种；优化；发酵 a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n ，t h ep a p e rf o c u s e so nt h e b r e e d i n go fl h i s t i d i n eh y p e r - p r o d u c e rw h 12 6 3 ，t h es u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no f s h a k i n gf l a s k ，t h ee f f e c to fc a l c i u mg l u c o n a t eo nl - h i s t i d i n ef e r m e n t a t i o n t h em a i nr e s e a r c h c o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： t h em e t h o d so fb r e e d i n gl h i s t i d i n ep r o d u c e rf r o mc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mw e r e d e c i d e db a s e do nt h er e l a t i o n s h i pw i t hb i o s y n t h e s i s p r o c e s so fn u c l e o t i d ea n df e d b a c k r e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fl - h i s t i d i n eb i o s y n t h e s i s t h el h i s t i d i n ep r o d u c e rw a sd e r i v e d f r o mt h eo r i g i n a ls t r a i nc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mc l w 0 5 0 6b ys t e p w i s em u t a g e n i c t r e a t m e n t sw i t l lu l t r a v i o l e t ( u v ) ，n - m e t h y l - n - n i t r o - n n i t r o s o g u a n i d i n e ( n t g ) a n dd i e t h y l s u l f a t e ( d e s ) t h eo b j e c t i v em u t a n ts t r a i nw h i c ha b s e n ta m pd e a m i n a s e ，i m ps y n t h e t a s e ， i m p d e h y d r o g e n a s ea n dh i s t i d i n a s ew a so b t a i n e d 1 1 1 el h i s t i d i n ep r o d u c i n gs t r a i nw a sa l s o e n d u e d 谢t 1 1o t h e rt w og e n e t i cm a r k e r s ：6 - m p k ，5 f u r t h ef i n a lm u t a n tw h 12 6 3c o u l d a c c u m u l a t el h i s t i d i n e8 5 0 9 lw h i c hw a sa b o u ta s16 0 a st h eq u a n t i t yp r o d u c e db yt h e p a r e n t a ls t r a i n t h ew h12 6 3s t r a i nw a sp a s s e dd o w no v e rt e ng e n e r a t i o n sf o r7 2 hf e r m e n t a t i o nt h ea c i d p r o d u c t i o nw a sl i t t l ec h a n g e d t h a tp r o v e dt h es t r a i n 、砸mag e n e t i cs t a b i l i t yc h a r a c t e r i s t i c u s i n gs i n g l ef a c t o r , o r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d s ，c o m et ot h e b e s ts o u r c eo fc a r b o ni sg l u c o s e ，n i t r o g e ns o u r c ei sa m m o n i u ms u l f a t e ，t h eb e s tm e d i u ma r e ( g l ) ：g l u c o s e9 9 0 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 42 9 3 0 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 01 2 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 0 ，c a c 0 32 0 0 0 t h eb e s tc o n c e n t r a t i o n so fz n 2 + ，m 9 2 + ，f e 2 + a n dm n 2 + a r e2 2 m m o l l ，1 8 m m o l l ，1 2 m m o l l a n d0 2 7 m m o l l t h ei n i t i a lp h 7 0 ，v a c c i n a t i o no f6 7p e r c e n t ，w i t l lv o l u m eo f15 m l 2 5 0 m l t r i a n g u l a rf l a s k ，t e m p e r a t u r e3 0 。c ，f l a s ks p e e d10 0 m i n n l ef e r m e n t a t i o np e r i o di s7 2 h t h e m u t a n ts t r a i nc o u l da c c u m u l a t el h i s t i d i n e10 3 0 9 l b ya d d i n gc a l c i u mg l u c o n a t et oi n c r e a s eg l u c o n i ca c i dk i n a s ea c t i v i t y , l e a d i n gt ot h e i m p r o v e m e n to fh e x o s em o n o p h o s p h a t e ( h m p ) s h u n tf l u xa n di t ss p e c i f i ca c t i v i t yg r e a t l y t 1 1 e m u t a n ts t r a i nc o u l da c c u m u l a t el h i s t i d i n e10 5 0 9 l k e y w o r d s ：l - h i s t i d i n e ；c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ；m u t a g e n t i cb r e e d i n g ；o p t i m i z a t i o n ； f e r m e n t a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 叁垒垂 日 期： 竺! 星! 幺；兰芝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留，使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 筮盘 导师签名： 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 l 组氨酸( l h i s t i d i l l e ) 化学名为l - q 一氨基- p 一咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性 0 审哗肛p 洲 厂 来自核糖 磷酸核糖异构酶；( 5 ) 谷 氨酰胺胺基转移酶；( 6 ) 咪唑甘油磷酸脱氢酶；( 7 ) 8 1 a 氨醇磷酸氨基转移酶；( a ) s g 氨醇磷酸磷酸酯 酶；( 9 ) 组氨醇脱氢酶 1 3 鎏重奎堂堡主堂垡丝塞 本途径由1 1 步酶催化反应组成，因有两个酶是双功能酶，所以共有9 个酶所催 化。组氨酸操纵子有九个结构基因组成，规定了与组氨酸生物合成有关的九个酶分子 结构，九个结构基因按大致的生化顺序在d n a 上形成一束，集中存在于d n a 的某 一区域内，组成一个组氨酸操纵子，为一个操纵基因所控制。途径中的第一步是由磷 酸核糖a t p 焦磷酸化酶所催化的限速反应，该酶受l 组氢酸的反馈抑制。当l 组氨 酸的量超过微生物生理需要时，l 组氨酸就会反馈阻遏参与l 组氨酸生物合成的所 有酶的合成，这种阻遏属于协调阻遏。 组氨酸 脱i 腻氨 ， 组胺尿酐酸咪唑丙酮酸 j 肛咪唑乙酸亚胺甲基谷氨酸眯唑乙酸咪唑乳酸 谷氨酸n h 3甲酸 图2 - 2 l 组氨酸分解途径【2 8 】 。 f i g 2 2t h ea m y i o y s i sp a t h w a yo fl h i s t i d i n e 在谷氨酸棒杆菌中，合成的l 组氨酸会不断的被利用掉，如图2 2 所示，脱氨作 用是分解的主要途径，l 组氨酸酶( 组氨酸解氨酶) 是分解的关键酶，可以把l 组氨酸 脱氨形成尿刊酸，再通过一系列的反应生成谷氨酸，从而被再次利用。如果使l 组 氨酸大量积累，就必须阻断其进一步分解。 2 3 2l 一组氨酸高产菌育种思路 若用微生物发酵法生产l 组氨酸，就必须解除l 组氨酸自身的反馈调节。由于 l 组氨酸是终产物，用一般营养缺陷型的方法来积累像l 组氨酸这样非支链途径的 终产物是不行的。必须选育适当地调节突变株。了解了l 组氨酸的合成途径及其相 关的其它代谢途径，我们就可以根据各个途径上的调节位点进行调节，使代谢流尽可 能多地流向l 组氨酸。 l 组氨酸代谢途径及调节机制比较复杂，要选育l 组氨酸高产菌株，就必须对细 胞原有的代谢途径进行改造( 图2 3 ) 。由于该菌株具有莽草酸营养缺陷型标记，转酮酶 活力很小，5 磷酸核糖焦磷酸( p r p p ) 大量积累。所以中心任务之一就是增大其核 心前体物质p r p p 向l 组氨酸的代谢流。 1 4 第二章l 组氨酸高产菌的选育 鸟三磷 l 5 磷酸核糖 ( r 5 p ) l 磷酸核糖焦磷酸 ( p r p p ) l 组氨酸 ( 盔) ； 型甘油磷酸 ； 腺三磷( p r - a t p ) f 鸟苷酸_ 叭苷酸( i m p k ( 1 ) 腺三磷( a t p ) ( g 哩( 3 腺苷酸( a m p ) 黄苷酸( x m p ) 腺苷酸琥珀酸 ( 1 ) a m pd e a mi n a s e ( 2 ) i m ps y n t h e t a s e ( 3 ) i m pd e h y d r o g e n a s e 图2 3l 组氨酸及其相关合成途径【2 9 】 f i g 2 3t h es y n t h e t i cp a t h w a yo fl - h i s t i d i n e ( 1 ) a m pd e a n l l q a s e ( 2 ) i m ps y n t h e t a s e ( 3 ) i m pd e h y d r o g e n a s e p r p p 不仅是l 组氨酸的前体物，同时也是嘌呤、嘧啶的前体物，因此p r p p 的 合成不但要受到l 组氨酸的反馈调节，也要受到嘌呤、嘧啶的反馈调节。同时这些 物质的合成途径作为l 组氨酸合成的旁支，必然会影响到l 组氨酸的积累。尤其是 与a t p 的合成途径，有两次相交、相互联系和相互影响如图2 4 所示。 图2 - 4 l 组氨酸与a t p 的关系 f i g 2 - 4r e l a t i o no fh i s t i d i n ea n da t p 通过研究制定选育思路：( 1 ) 选育缺失腺嘌呤脱氨酶( a d e n a s e ) 、肌苷酸q m p ) 合成 酶、肌苷酸( i m p ) 脱氢酶活性突变株，增加p r p p 向l 组氨酸的代谢流。( 2 ) 选育嘌呤、 嘧啶结构类似物抗性突变株，解除嘌呤、嘧啶对其合成途径最关键的限速酶磷酸核糖 转移酶的反馈抑制和阻遏。( 3 ) 以l 组氨酸为惟一碳源氮源选育组氨酸裂解酶缺陷型 菌株来解除组氨酸分解代谢。( 4 ) 对选育出的菌株进行传代实验，检验其遗传稳定性。 1 5 江南大学硕士学位论文 2 4 结果与讨论 2 4 1l 一组氨酸标准曲线的测定 ( 1 ) l 一组氨酸标准溶液的配制 准确称取5 0 m g l 组氨酸标准品，溶解定容至5 m l ，配制成10 9 l 的标准溶液。 ( 2 ) 标准曲线的制作 准确吸取l 组氨酸标准溶液0 ，0 6 ，1 2 ，1 8 ，2 4 ，3 0 ，3 6 m l 于5 m l 比色管 中，分别加水至3 m l ，配成l 组氨酸含量分别为0 0 ，2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 ，1 2 0 9 l 的测定溶液，在最佳吸收波长5 1 0 n m 测定l 组氨酸的标准曲线。如图2 5 所示。 o 2 5 0 2 宝0 1 5 。o0 1 0 0 5 0 0 2 4 681 01 2 l h i s t i d i n e ( g l ) 图2 5l 组氨酸标准曲线 f i g 2 5t h es t a n d a r dc u r v eo fl - h i s t i d i n e 从图2 - 5 可以看出，当组氨酸在2 - 1 2 9 l 时，o d 和l h i s t i d i n e 含量之间有很好 的线性关系，可以作为定量分析的标准曲线。 2 4 2 茵体生长曲线的测定 接一环菌体于种子培养基中，进行培养，每隔2 h 取0 2 m l 待测菌液，加入5 m l 0 2 5 m o l l 盐酸溶液中，摇匀，用7 2 1 型分光光度计，l c m 光程5 6 2 n m 测o d 值，其 生长曲线如图2 6 所示。 l 0 8 。0 6 8 o 4 0 2 0 024681 01 21 41 6 t h 图2 - 6w h 0 5 0 6 的生长曲线 f i g 2 - 6g r o w t hc u r v eo f 、7 哪0 5 0 6 o 4 h 为延迟期，培养至4 h 时，菌体开始进入对数生长期，1 2 h 时基本达到稳定 1 6 兰三兰兰：丝茎墼查兰堕堕垄堕 期。取培养1 0 h 时的菌体作为诱变的出发菌。此时，菌体处于对数生长的中后期，菌 体具有较高的生长活力，细胞对外界物质较敏感，此时结构类似物能比较容易地进入 细胞内，从而解除某些物质对酶的反馈抑制或阻遏。 2 4 3 诱变剂量和时间的确定 2 4 3 1u v 诱变时间的选择 取一环培养1 0 h 的菌体于带玻璃珠的装有1 5 m l 磷酸缓冲液的碘量瓶中，摇1 0 m i n 使菌体分散，分别取4 m l 于已灭菌的平皿内在紫外灯下照射不同时间，测致死率结 果见表2 1 。故选择处理时间为5 0 s 。 表2 - 1u v 处理w h 0 5 0 6 致死率结果 t a b l e 2 - 1t h el e t h a l i t yo fw h 0 5 0 6b yu vt r e a t m e n t u v 处理时n ( s )致死率( ) 2 0 3 5 5 0 6 5 5 3 7 5 8 8 9 4 2 4 3 2d e s 诱变剂量的选择 d e s 是一种诱变常用的烷化剂，可引起g ：c 和a ：t 的互换，从而引起d n a 复 制时碱基配对错误。与亚硝基胍不同，一般选择致死率7 0 8 0 或者更低时，正突变 率较高。采用浓度为2 0 m l l 的d e s ，对菌体处理不同时间，结果如表2 2 所示。选 择d e s 的处理时间为2 0 m i n ，致死率为7 5 。 表2 - 2d e s 处理w h 0 5 0 6 致死率结果 t a b l e 2 2t h el e t h a l i t yo fw h 0 5 0 6b yd e st r e a t m e n t d e s 诱变时n ( m i n )致死率( ) 1 0 2 0 3 0 5 6 7 5 9 0 2 4 3 3n t g 诱变时间的选择 采用n t g 诱变菌株，一般在致死率较高时产生的正突变率高，实验中用最终浓 度2 5 0 t g m ln t g 溶液，对菌体处理不同时间，测定致死率，结果见表2 - 3 ，因为， 故将处理时间定为3 5 m i n 。 表2 - 3n t g 处理w h 0 5 0 6 致死率结果 t a b l e 2 3t h el e t h a l i t yo fw h 0 5 0 6b yn t g n t g 处理时n ( r a i n )致死率( ) 1 5 2 5 3 5 4 5 5 3 7 5 9 2 9 9 1 7 江南大学硕士学位论文 2 4 4l 组氨酸产生茵的选育 2 4 4 1 腺嘌呤脱氨酶( a d e n a s e ) 活性突变株的筛选 如图2 3 所示，要减弱a m p 向i m p 的代谢流必须减弱该途径的关键酶a d e n a s e 活性。用u v 处理w h 0 5 0 6 产生菌，筛选在含有8 - a g 的培养基上生长较弱或不能生 长的突变株，在发生正突变的菌株中有3 株产酸提高较为明显( 表2 - 4 ) ，以产酸最高 的w h 0 8 4 1 ( 6 0 5 9 l ) 为下一步研究和诱变的出发菌株。 表2 _ 4 突变株产酸结果 t i a b l e 2 4y i e l do fl h i s t i d i n eo f a d e n a s e m u t a n t s 缺失肌苷酸( i m p ) 合成酶活性突变株的获得 如图2 3 所示，阻断i m p 代谢流向g m p 有利于积累更多a t p ，将w h 0 8 4 1 经d e s 诱 变后，涂布在完全培养基上，培养4 8 h 后，用双平板法进行筛选。挑出在添加次黄嘌 呤( h x ) 的基本培养基上能生长而在不含或含量较低的h x 的基本培养基上不能生长的 菌落。就获得了缺失肌苷酸合成酶活性的突变株，产酸量最高的为w h 0 9 2 1 ( 6 5 0 9 l ) 。 再以该菌株为出发菌株进行下一步诱变。 表2 5h x 抗性浓度对产l 组氨酸影响 t a b l e 2 5e f f e c to f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f h xi nt h ep r o d u c t i o no f l - h i s t i d i n e 从表2 5 可以看出，4 0 m g lh x 抗性平板上的菌株明显b k 2 0 m g lh x 抗性平板上的 菌株的正突变率要高，这说明抗性较高的菌株细胞中，肌苷酸( i m p ) 合成酶的活性被 反馈抑制或阻遏。 缺失肌苷酸( i m p ) 脱氢酶活性突变株的筛选 如图2 3 所示，为了阻断i m p 向x m p 的代谢流，需选育黄嘌呤( x a n ) 营养缺陷型突 变株，将w h 0 9 2 1 经n t g 诱变后涂布于添力l l x a n 的基本培养基上，挑选在含x a n 的基 本培养基长出的菌落。即获得缺失肌苷酸脱氢酶活性的突变株w h l 0 2 5 ，该菌株产酸 量达7 3 0 e l 。再以该菌株为出发菌株进行下一步诱变。 从表2 6 可以看出，1 0 m g l x a n 抗性平板上的菌株明显l ；匕5 m g l x a n 抗性平板上的 菌株的正突变率要高，这说明在浓度较高的培养基中，肌苷酸( i m p ) 脱氢酶的活性被 反馈抑制或阻遏。 1 8 第二章l 组氨酸高产菌的选育 & 2 - 6x a w e 性浓度对产l 组氨酸影响 t a b l e 2 6e f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fx a ni nt h ep r o d u c t i o no fl h i s t i d i n e 组氨酸酶缺陷型突变株的筛趔3 0 】 如图2 2 所示，l 组氨酸主要通过组氨酸酶进行脱氨p ，生成尿酐酸。通过对菌 株w h l 0 2 5 进行d e s 诱变处理，得到组氨酸酶缺陷型菌株( h i s t a s e ) 来抑制组氨酸的 分解代谢。诱变后选出产酸较高的3 株，如表2 7 所示。 表2 7 组氨酸酶缺陷型菌株的结果 t a b l e 2 。7r e s u l to fh i s t i d a s e 1 e s sm u t a n t s 注：+ 为生长；为不生长 从表2 7 中结果看出，未带上组氨酸酶缺陷型标记的出发菌株能利用组氨酸生长， 而组氨酸酶缺陷型菌则不能利用组氨酸，并使组氨酸的积累有所提高。 2 4 4 2 核苷酸类结构类似物抗性突变株的筛选 在细胞的代谢途径中，组氨酸和核苷酸的合成存在一定的关联，尤其是嘌呤类物 至1 | 三二二二二二二二二二二二二三三三! ：啶 b - 核穗j 恕磷酸核p 爿氯 ( 卿) o 表示代蹴方向吆示反馈调节 图2 7l 组氨酸和核苷酸合成途径的关系 f i g 2 7r e l a t i o no fh i s t i d i n ea n d n u c l e o t i d ea n a b o l i s m 从图2 7 中看，核苷酸类物质反馈调节5 磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的转化，因 而筛选核苷酸类结构类似物抗性菌株就可以解除对磷酸核糖焦磷酸激酶( p r p p k e ) 的 反馈抑制，增加p r p p 的生成，从而促进l 组氨酸的生成。本实验将a d e n a s e 。、h x 、 x a n 。和h i s t a s e 标记的菌株w h l l 9 1 经n t g 诱变处理，筛选6 巯基嘌呤抗性1 3 引、5 氟尿嘧啶抗性来解除核苷酸类物质对p r p p k e 的反馈抑制，从而提高l - 组氨酸的合 1 9 江南大学硕士学位论文 成能力。 表2 - 8 出发菌株w h l1 9 1 对6 - m p 及5 - f u 药物抗性 t a b l e 2 8t h ec r i t i c a lc o n c e n t r a t i o no f6 一m pa n d5 - f ur e s i s t a n c e 本实验试图选育出具有嘌呤结构类似物6 巯基嘌呤( 6 - m p ) ，嘧啶结构类似物5 - 氟尿嘧啶( 5 f u ) ，以提高l 组氨酸的产量。 以菌株w h l l 9 1 为进一步诱变的出发菌株，预先确定了6 。m p 与5 - f u 临界致死 浓度( 表2 8 ) 分别为2 0 9 l 与1 5 9 l 。把n t g 诱变后的菌悬液直接涂于含有不同 浓度的6 - m p 和5 - f u 的药物筛选平板上( 表2 9 ) ，从筛选平板上挑选生长良好的大 菌落，然后经摇瓶初筛、复筛得到相对高产菌株。表2 - 9 表明当菌株同时带有6 - m p 、 5 f u 双重抗性标记时，l 组氨酸明显提高。产量最高的突变株w h l 2 6 3 积累l - 组氨 酸8 5 0 9 l 。 表2 - 9 核苷酸类结构类似物抗， 生突变株的筛选结果 t a b l e 2 - 9r e s u l to f m u t a n t sr e s i s t a n tt oa n a l o g so fn u c l e o t i d e 2 4 5w h l 2 6 3 遗传稳定性研究 因为多重抗性交叉难以增加抗性标记，再加上组氨酸反馈调节很复杂，组氨酸产 生菌( 带有遗传标记菌株) 较容易发生回复突变，组氨酸产量很不稳定，而且会出现异 常发酵。将w h l 2 6 3 连续传代1 0 次经7 2 h 发酵实验发现，各菌株产酸量变化很小( 表 2 1 0 ) ，利用葡萄糖的能力也无明显差异，说明该菌株具有很好的遗传稳定性。 袁2 1 0 菌株w h l 2 6 3 遗传稳定性 t a b l e 2 1 0t h eg e n e t i cs t a b i l i t yo f m u t a n tw h l 2 6 3 传代次数123456789 1 0 l 组氨酸( g l ) 8 7 3 7 8 87 6 98 2 16 9 57 3 68 7 58 8 08 5 88 3 9 残糖( g l 、4 3 1 3 8 95 7 12 9 86 6 54 4 32 8 92 4 73 9 04 5 6 2 0 第二章l 组氨酸高产菌的选育 2 4 6l 一纽氨酸菌种选育谱系 图2 8 为l 组氨酸产生茵w h l 2 6 3 的诱变育种谱系图。 菌株 w h 0 5 0 6 ( sh l - ，a m r r ) j ru v w h 0 8 4 1 ( sh a ，a m t r , a d e n a s e 。) j rd e s w h 0 9 2 1 ( s h a - ，a m t r ，a d e n a s e , h x ) in t g 【广组氨酸产量( g l ) 5 3 1 w h l 0 2 5 ( s h ，a m t k ，a d e n a s e - , h x ，x a n ) jd e s w h l l 9 1 ( s h a ，a m na d e l l ；a s e , h x - ，x a n ，h i s t i d a s e ) in t g w h l2 6 3 ( s h l ，a m t r ，a d e n a s e , h x ，x a f f ，h i s t i d a s e , 6 m p r ，5 f u r ) 图2 - 8 谷氨酸棒杆菌l 组氨酸产生菌w h l 2 6 3 选育谱系 6 0 5 6 5 0 7 3 0 7 8 0 8 5 0 f i g 2 8s c h e m a t i cc h a r to fm u t a g e n s i sp r o c e d u r ef o rl - h i s t i d i n ep r o d u c e rw h 12 6 3 2 5 本章小结 本章以谷氨酸棒杆菌w h 0 5 0 6 为出发菌株，根据选种的原则即增加p r p p 向l 组氨 酸的代谢流，提高l 组氨酸的发酵单位，减少核苷酸的合成；解除核苷酸、组氨酸对发 酵过程中关键酶的抑制及阻遏作用以及阻断组氨酸的分解途径。通过u v 、d e s 和n t g 诱变处理选育出一株能够较多积累l 组氨酸的菌株w h l 2 6 3 ( s h i 。，a m t r ，a d e n a s e 。，h x ， x a n ，h i s t i d a s e 。，6 - m p r ，5 f u r ) 。经连续传代培养，菌株具有良好的传代稳定性，在含8 0 9 l 葡萄糖、3 0 9 l 硫酸铵的培养基中直接发酵7 2 h ，产酸可达8 。5 0 9 l 。 2 l 江南大学硕士学位论文 3 1 前言 第三章l 组氨酸发酵条件的优化 发酵是一个复杂的生物化学变化过程。受很多环境条件的影响，代谢控制发酵能否 获得成功，目的产物产量的高低，取决于其代谢控制机制是否能够被解除和解除的程度。 菌种的生理特性对于目的产物的生成是关键因素，但是发酵条件，如基质成分及其浓度、 温度、p h 值、溶解氧( 通风量) 的控制不仅关系到微生物的生长，而且还影响代谢产物的 产量。 人为控制代谢、控制微生物发酵途径、提高发酵产率的方法，因目的代谢产物不同， 所采用的方法和途径也各有差异，归纳起来，一是改变微生物遗传特性，二是控制发酵 条件，目的都在于解除( 或加强) 微生物的控制机制，尽管微生物具有稳定的基因型，但 却有随环境变化而改变其本身组成和代谢的惊人能力。虽然环境条件不能改变细胞的基 因型，但能显著地改变其基因的表达。这种自我适应的反映速度很快，正是由于微生物 具有如此强的自我调节能力，微生物才能广泛地存在于自然界。 一般发酵过程可以简单地分为两个阶段：一是菌体生长阶段，这个时期主要是菌体 利用营养成分大量合成细胞；二是产物合成阶段，在这个阶段中，改造过的细胞代谢途 径发挥作用，开始合成目的代谢产物。发酵条件的优化就是围绕着在这两个阶段中怎样 提高菌株生产能力而进行的。发酵形式不同，其优化的方式也不同。在分批发酵中，由 于所有的营养物是一次性加入，所以只能通过改变初始培养基的组成和培养条件来调整 细胞发酵能力。 发酵随着各个研究阶段的目的不同，培养基的优化也不同，有初期的摇瓶发酵条件 优化，小试和中试的发酵罐培养基优化，最终的发酵生产优化。初期的摇瓶发酵条件优 化是以摸索培养基成分为主，不断驯化菌株，所以此时的培养基优化包括，改变培养基 中碳氮源的成分和配比，添加各种维生素和金属离子，增加或减少接种量等；在进入小 试和中试后，已经初步具备了发酵生产的条件，所以在发酵罐中进行培养优化时，要对 发酵状态进行随时跟踪，充分了解菌体细胞和发酵液在两个不同的阶段中发酵过程的变 化，从而分析细胞内的代谢状况，并通过补料、改变通风量、搅拌转速来对发酵过程进 行调整；在最终生产实验中，由于前面已经打下良好的基础，在此阶段主要考虑如何改 进发酵罐的通风系统、搅拌桨、进料管等设备，使之能更好地提供一个发酵环境。 本章主要通过单因素实验、正交实验、响应面分析等方法研究了l 组氨酸摇瓶发酵 实验用培养基成分及配比，并对发酵条件进行了优化。确定发酵培养基的最佳组成成分， 确定了菌株的最佳发酵条件。 第三章l 组氨酸发酵条件的优化 3 2 材料与方法 3 2 1 实验菌株 l 组氨酸产生菌w h l 2 6 3 ( s h i - , a m t r , a d e n a s e ，h x 。，x a n 。，h i s t i d a s e , 6 m p r , 5 f t j r ) 。 3 2 2 实验仪器与试剂 同2 2 2 。 3 2 3 培养基 优化前同2 2 3 。 3 2 4 培养方法 优化前同2 2 4 。 3 2 5 分析方法 同2 2 7 。 3 3 结果与讨论 3 3 1 摇瓶发酵培养基优化 3 3 1 1 不同碳源对l 组氨酸发酵的影响 碳源是构成菌体和合成l 组氨酸的碳架及能量的来源，能构成细菌和真菌干重的 5 0 左右。不同氨基酸产生菌除能利用葡萄糖外，对蔗糖、果糖、麦芽糖和醋酸等的利 用能力各不相同【3 3 1 ，在发酵培养基中分别加入葡萄糖、蔗糖、果糖和麦芽糖进行l 组 氨酸发酵，碳源添加量与所添加的葡萄糖达到相同的含碳质量为准，结果如图3 1 所示。 3 岛 锱 】藤 一 一一i 一一一l 一 葡萄糖蔗糖果糖麦芽糖 图3 - 1 发酵培养基不同碳源的比较 f i g 3 1t h ec o m p a r i s o no fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e si nf e r m e n t a t i o nm e d i u m 从图3 1 可以看出，当以葡萄糖为碳源时l 组氨酸产量明显比其它碳源要高，因此 2 3 江南大学硕士学位论文 选择葡萄糖作为w h l 2 6 3 发酵生产l 组氨酸的最佳碳源。 3 3 1 2 不同浓度葡萄糖对l 组氨酸发酵的影响 葡萄糖作为本实验的碳源，其作用非常重要，直接影响到菌体的生长和产酸的水平。 改变发酵培养基中葡萄糖的添加量，考察其对产酸的影响，如图3 2 所示。 1 0 ，8 若6 鬈4 - 一 2 0 i 一_ 一一一一一 6 08 01 0 01 2 01 4 0 葡萄糖( g l ) 图3 - 2 葡萄糖含量对发酵的影响 f i g 3 2t h ee f f e c to fg l u c o s eo nh i s t i d i n ep r o d u c t i o n 从图3 2 可以看出：在葡萄糖含量为l o o g l 的发酵培养基中，产酸量最大。当葡萄 糖浓度减小时，合成组氨酸的碳架物质减少，从而影响到组氨酸的积累。当葡萄糖浓度 大于l o o g l 时，组氨酸的产量略有下降。由于葡萄糖对己糖激酶和磷酸果糖激酶有激 活作用，进一步通过e m p 途径进行降解，从而会对h m p 途径有所削弱，导致l - 组氨 酸积累的下降。 3 3 1 3 不同氮源对l 组氨酸发酵的影响 氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成l 组氨酸氨基的重要组成成分。氮 源分为无机氮和有机氮，一般菌体利用无机氮比较迅速，利用有机氮比较缓慢。发酵培 养基一般采用含有快速和慢速利用的混合氮源，如氨基酸发酵中一般采用铵盐和豆饼水 解液，试验研究了硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、磷酸铵和醋酸铵对发酵的影响。 o 岛 窿 掘 寒 一 1 0 8 i 一一i 硫酸铵氯化铵硝酸铵磷酸铵 醋酸铵 图3 3 发酵培养基不同氮源的比较 f i g 3 3t h ec o m p a r i s o no fd i f f e r e n tn i t r o g e ns o u r c e si nf e r m e n t a t i o nm e d i u m 由图3 3 可见，以硫酸铵为氮源时产酸量最大，因此选择硫酸铵为发酵培养基的氮 2 4 兰三垩兰：望茎墼垄壁墨竺塑垡丝 源。 3 3 1 4 不同浓度硫酸铵对l 组氨酸发酵的影响 作为发酵培养基中的氮源，主要是参与菌体代谢物质的合成，构成细菌和真菌干重 的8 胁1 4 。似乎所有的细菌和真菌都可以利用氨( 以n i - 1 4 + 的形式) ，这是氨在代谢中的 重要作用的反映，因为氮元素是以氨的形式进入细胞组分的。在许多的实验和工业规模 的发酵中，n h 4 + 经常是优先选用的氮源，并以( n i - h ) 2 s 0 4 的形式加入。但这种化合物为 生理酸性盐，细胞对n i - h + 的利用通常会使培养基的p h 值迅速下降，从而影响菌体生长。 改变培养基中硫酸铵的添加，考察其对组氨酸发酵的影响，如图3 4 所示。 o 岛 甾 卑 一 i _ 一一一i 一_ 一 2 53 03 54 04 5 硫酸铵( g l ) 图3 4 硫酸铵对发酵的影响 f i g 3 4t h ee f f e c to fa m l i l o m as u l f a t eo nh i s t i d i n ep r o d u c t i o n 从图3 4 结果可看出硫酸铵浓度小于3 5 l 时，产酸下降，此时氮源的供应不能满 足菌体细胞的需求，从而影响到组氨酸的积累；而浓度较大时，则产酸下降，此时完全 满足菌体生长的要求，但随着铵离子的增加，菌体会有一个自动贮存铵离子的系统，将 其结合到谷氨酸或天冬氨酸上形成谷氨酰胺或天冬氨酰胺，从而使代谢流向有利于e m p 途径的方向偏转，导致组氨酸产量的下降。 3 3 1 5 不同氮碳比( c ：n ) 对l 组氨酸发酵的影响 实验考察了发酵培养基中不同碳氮比对l 一组氨酸发酵的影响。结果见表3 1 。 表3 - 1c ：n 对l 组氨酸的影响 t a b l e 3 - 1e f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc ：ni nt h ep r o d u c t i o no fl - h i s t i d i n e 表3 1 中所列各配比均能满足菌体生长需要但当碳氮比小于1 0 0 ：1 2 时，组氨酸产 量相对较低；另一方面，当碳氮比大于1 0 0 ：1 2 时，组氨酸产量较高，尤其当含氮量为 望塑奎堂堡主堂垡笙奎 碳氮比为1 0 0 ：1 8 6 时，组氨酸产量最高。 3 3 1 6 玉米浆对l 组氨酸发酵的影响 玉米浆是一种有机氮源，并含有较多的氨基酸和生长因子，是微生物生长所需营养 物质的直接提供者。由于转酮酶缺陷型菌株自身不能合成芳香族氨基酸，菌体生长所必 需的芳香族氨基酸由玉米浆供给，培养基中玉米浆的含量严重影响着缺陷型菌株的生长 及l 组氨酸的产量。在发酵培养基中加入不同浓度的玉米浆，摇瓶发酵7 2 h ，检测l 组 氨酸的产量，如图3 5 所示。 1 0 8 掌6 訾4 “2 _ 一l 一一一一一一_ 一 1 3 57 9 玉米浆( g l ) 图3 - 5 玉米浆对组氨酸产量的影响 f i g 3 - 5t h ee f f e c to fc o r ns t e e pl i q u o ro nh i s t i d i n ep r o d u c t i o n 从图3 - 5 知：玉米浆浓度在5 9 l 时，组氨酸的产酸达到最大，而其浓度小于5 9 l 时， 产酸下降很快，原因是玉米浆作为有机氮源，当不添加玉米浆时，菌体生长较弱，组氨 酸的积累受到影响。当玉米浆浓度增大时，其中的其它成分对合成代谢起到了负面作用， 使产酸水平下降。 3 3