（遗传学专业论文）果蝇dx16基因功能分析.pdf

中文摘要 果蝇d x l 6 基因功能分析 研究生：万永奇 导师：谢维( 教授) 、 东南大学 s r 蛋白是一类保守的剪接因子，它不仅为组成型剪接所必需，在选择性剪接的调控中 也发挥着重要作用。d x l 6 基因是我实验室独立克隆的果蝇s r 蛋白基因，位于2 号染色体 左臂2 7 c 4 - - 5 区带，序列分析结果表明它具有s r 蛋白的结构特征。d x l 6 基因m r n a 在胚 胎发育早期广泛表达，后期则在神经系统高表达，在幼虫成虫盘的局部也有表达。 为了进一步研究d ) 【1 6 基因的功能。我们制备了特异针对d x l 6 的单克隆抗体，确定了 d x l 6 蛋白的整体表达谱及亚细胞定位，发现d x l 6 蛋白在胚胎发育早期广泛表达，后来局 限于外胚层，胚胎发育后期则主要在神经系统高表达，d x l 6 还在眼一触角成虫盘的局部以 及腿成虫盘的背侧部分表达。d x l 6 主要定位在细胞核内，与它是s r 蛋白并作为剪接因子 发挥功能的假设一致。通过酵母双杂交及g s t - - p u l ld o w n 实验发现d x l 6 与u 1 s n r n p 皿 单位c g 7 5 6 4 、s r 蛋白r b p i 及s r 蛋白激酶b o a 等剪接相关蛋白结合。我们确定了d o a 的前两个富含精氨酸和丝氨酸区域是它与d x l 6 相互作用所必需的结构域，并发现b o a 可 在体外磷酸化d x l 6 ，提示d x l 6 可能是d o a 新的底物，d o a 对d x l 6 的磷酸化可能对 d x l 6 的活性有重要的调控作用。碱性磷酸酶对果蝇蛋白进行去磷酸化处理后，d x l 6 蛋白 迁移率有明显改变，表明d x l 6 蛋白在体内受到磷酸化，并且磷酸化修饰程度较高。我们还 制备了特异性针对d o a 的多抗，发现d o a 也在果蝇神经系统高表达，与d x l 6 部分共定 位。d o a 在果蝇性别决定、神经发育、胚胎分节等方面都发挥重要作用，它在性别决定过 程中的功能已得到较充分的说明，但d o a 如何影响神经系统发育并不清楚。d x l 6 作为一 种在神经系统高表达的s r 蛋白，可能影响某些在神经系统发育过程中起重要作用的基因的 剪接，d o a 很有可能通过对d x l 6 的磷酸化修饰来调控d x l 6 的活性，从而参与神经发育。 d x l 6 基因区域p 因子插入突变导致果蝇致死，只有约5 的逃逸者，部分逃逸者有严重的 眼、腿、翅膀发育缺陷；d x l 6 纯合突变果蝇的n r x - ! 、r g r 、f r i n g e 及p d m 2 等基因表达缺 失；g a l 4 驱动下整体异位表达d x l 6 也使果蝇致死。上述实验结果共同表明，作为s r 蛋白 家族的成员之一，d x l 6 可能通过与其它剪接因子结合参与剪接复合体的组装，调控某些基 因的剪接，从而对果蝇发育有重要影响，是一个重要的发育相关基因。 关键词：黑腹果蝇，d x l 6 ，s r 蛋白，发育 英文摘要 f u n c t i o n a la n a l y s i so f d x l 6g e n ei nd r o s o p h i l a g r a d u a t es t u d e n t ：w a ny o n g q i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx 1 ew e i s o u t h e a s tu n i v e r s i t y s rp r o t e i n ( s e r i n e - a r g i n i n e - r i c hp r o t e i n s ) i sac o n s e r v e ds p l i c i n gf a c t u rf a m i l yt h a tn o to n l y i sr e q u i r e df o rc o n s t i t u t i v ep r e - m r n as p l i c i n gb u ta l s op l a y si m p o r t a n tr o l e si nr e g u l a t i o no f a l t e r n a t i v es p l i c i n g d x l 6i sas rp r o t e i ng e n eo f d r o s o p h i l ac l o n e di n d e p e n d e n t l yb yo u rl a b i t i sl o c a l i z e da tp o s i t i o n2 7 c 4 5 t h el e f ta r mo fs e c o n dc h r o m o s o m ea m i n oa c i ds e q u e n c e a n a l y s i sr e v e 目d st h a td x l 6c o n t a i n st h ed o m a i nf e a t u r eo fs rp r o t e i n a te a r l ys t a g e so fe m b r y o d e v e l o p m e n t , t h em r n a o fd x l 6i su b i q u i t o u s l ye x p r e s s e d h o w e v e r , a ll a t e rs t a g e so fe m b r y o d e v e l o p m e n t , i ti sh i g h l ye x p r e s s e di nt h ec e n t r a ln e n r o ms y s t e m i ni m a g i n a ld i s c so f t h el a v a e t h em r n ao f d x l 6b e c o m e se n r i c h e di nd i s t i n c tr e g i o n s t oi n v e s t i n g a t et h ef u n c t i o no f d x i 6 ，w eg e n e r a t e dt h es p e c i f i cm o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s t d x l 6 ，a n dd e t e r m i n e dt h ee x p r e s s i o np a t t e ma n ds u b c e l l u l a rl o c a t i o no fd x l 6p r o t e i n w ef i n d t h a td x l 6p r o t e i ni su b i q u i t o u s l ye x p r e s s e da te a r l ys t a g e so f e m b r y od e v e l o p m e n t , a n dt h e ni ti s r e s t r i c t e da tn e u r o e c t o d e n n ，a n dh i g h l ye x p r e s s e da tc e n t r a ln g r v o t l ss y s t e ma tl a t e rs t a g e so f e m b r y od e v l c o p m e n t d x l 6p r o t e i ni sa l s oh i g h l ye x p r e s s e da tv e n t r a la n dd o r s a ll o c a t i o n so f t h e e y ea n da n t e n n ap o r t i o n so f t h ee y e - a n t e n n ad i s ca n dt h ed o r s a ls e c t u ro f t h el e gd i s c c o n s i s t a n t w i t ht h eh y p o t h e s i st h a td x l 6i sas rp r o t e i na n df u n c t i o n s 勰as p l i c i n gf a c t o r , d x l 6i s p r e d o m i n a n t l yl o c a l i z e di nn u c l e a r d x l 6i n t e r a c t sw i t i lc g 7 5 6 4 ( s u b u n i to fu is n m q p ) s r p r o t e i nr b pa n ds rp r o t e i nk i n a s ed o a nv t r o t h ef i r s ta n ds e c o n ds e r - a r gr i c hr e g i o n s 艉 r e q u i r e df o rt h ei n t e r a n t i o nb e t w e e nd o aa n dd x l 6 d o ap h o s p h o r y l a t e sd x l 6 nv i t r o , t h i s s u g g e s t st h a td x l 6m a y b ean o v e ls u b s t r a t eo f d o aa n dt h i sp h o s p h o r y l a t i o ni se s s e n t i a lf o r t h e r a g u l a t i o no ft h ef u n c t i o no fd x l 6 a t i e rc 1 a pt r e a t m e n lt h ee l e c t r o p h o r e s i sm o b i l i t yo fd x l 6 d a c r e x ls i g n i f i c a n t l y ，t h i ss u g g e s t st h a td x i 6i sh i g h l yp h o s p h o r y l a t e d nv v o p o l y c l o n a l a n t i b o d ya g a i n s td o aw a sg e n e r a t e d i m m u n o s t a i n i n gr e s u l t sr e v e a lt h a td o a i sa l s oh i g h l y e x p r e s s e di ne m b r y oc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m d o ai se s s e n t i a lf o rs e xd e t e r m i n a t i o n ，i t e r v o u s s y s t e md e v e l o p m e n ta n de m b r y os e g m a n t i o n a h h o u g ht h ef u n c t i o no f d o a i ns e xd e t e r m i n a t i o n h a sb e e nc l e a r l ye l u c i d a t e d ，i t sr o l e si nn e r v o u ss y s t e md e v e l o p m e n tr e m a i nn n k o w n a sas r p r o t e i nh i g h l ye x p r e s s e di nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，d x l 6m a yp a r t i c i p a t ei nt h es p l i c i n go fs o m e g e n e si m p o r t a n t i nd e v e l o p m e n t d o ap e r h a p s r e g u l a t e st h ea c t i v i t y o fd x l 6t h r o u g h p h o s p h o r y l a t i o n , t h u sc o n t r i b u t e st on e r v o u ss y s t e md e v e l o p m e n t t h ep - e l e m e n ti n s e r t i o n a l m u t a t i o ni ng e n o m i cr e g i o nc o n t a i n i n gd x l 6c a o s e sl c m m l i t y o n l ya r o u n d5 e s c a p e r ss u r v i v e t h e r ea r e v e 佗d e f e c t so f b r i s t l e , l e ga n dw i n gi ne s c a p e r s t h ee x p r e s s i o no f n r x - 1 r g r , f r i n g e a n dp d m 2i sd e f i c i e n ti nd x l 6h o m o z y g o u sm u t a n td r o s o p h i l a g a l 4d r i v e nu b i q u i t o u s l ye e t o p i c e x p r e s s i o no f d x l 6a l s oc a u s e sl e t h a l i t y t a k i n ga l lt h e s er e s u l t st o g e t h e r , w ec o n c l u d et h a td x l 6i s an o v e lm e m b e ro fs rp r o t e i nf a m i l yi nd r o s o p h i l aa n di tm a yp a r t i c i p t ei nt h ea s s e m b l yo f s p l i c i n gc o m p l e xt h r o u g hi n t e r a c t i o nw i t ho t h e rs p l i c i n gr e l a t e dp r o t e i n sa n dp l a yi m p o r t a n tr o l e s i nd e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r , d x l 6 ，s rp r o t e i n , d e v e l o p m e n t i i 缩略词表 s r p r o t e i n s n i 心j p i 删 i m d s f 2 a s f 缩略词表 s e r i n e a r g i n i n er i c hp r o t e i n s r 蛋白 s _ m a l ln _ u c l e a rr i b o n u c l e o t 2 r o t e i n 核内小核糖核蛋白 _ r n a r e c o g n i t i o nm o t i f r n a 识别基序 _ r n ab i n d i n gd o m a i nr n a 结合结构域 _ s p l i c i n gf a c t o r2 剪接因子2 a l t e r n a t i v es _ p l i c i n g _ f a c t o r选择性剪接因子 h n r n p h e t e r o g e n e o u sn u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n 核内不均一核糖核蛋白 e s e i s s e j c e x o n i c - s p l i c i n ge n h a n c e r s 外显子剪接增强子 i n t r o n i c - s p l i c i n g _ s i l e n c e r 内含子剪接抑制子 e _ x o nj u n c t i o nc o m p l e x外显子接头复合体 n m dn o n s e n s e m e d i a t e dm r n ad e c a y 无义介导m r n a 降解 s d s p a g es d s p _ o l y _ a c r y l a m i d eg e l s d s 一聚丙烯酰胺 g s t c b c c i a p 凝胶电泳 g l u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s e谷胱甘肽转移酶 c a p - b i n d i n gc o m p l e x 帽结合复合体 一c a l f i n t e s t i n ea l k a l i n e p h o s p h a t a s e 牛小肠碱性磷酸酶 1 1 1 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：逐塑毒 日期：矽z o 7 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论 文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包 括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 东南大学博士学位论文 1 1 引言 第一章文献综述：s r 蛋白家族 真核生物的基因是断裂基因，外显子由内含子分隔。前体m r n a 转录后，内含子要在 剪接机制下被剪接体精确有效地去除，形成成熟的m r n a 才能作为翻译的模板。剪接有组成 型剪接( c o n s t i t u t i v es p l i c i n g ) 和选择性剪接( a l t e r n a t i v es p l i c i n g ) 两种，前者指一种前日k m r n a 经 过剪接后只形成一种成熟的m r n a ，翻译成一种多肽，而经过选择性剪接，同一种前体m r n a 则可以形成多种成熟m r n a ，翻译成不同的蛋白质。 剪接不仅是基因表达的步骤之一，而且也是基因表达调控的重要方面。选择性剪接使 有限数目的前体m r n a 可以翻译生成更多蛋白产物，大大拓展了基因组表达的潜能，是增加 蛋白质组复杂性的主要机制( b l a c k , 2 0 0 0 ；g r a v e l e y , 2 0 0 l ；m a n i a t i sa n dt a s i c ，2 0 0 2 ；r o b e r t s a n ds m i t h 2 0 0 2 ) 。在发育的不同阶段和不同组织中，同一基因经过选择性剪接产生各种结构 和功能都不同的i s o f o r m ，发挥不同的功能。如果蝇d s ( b a l i i 基因编码一种参与神经元连接的细 胞表面蛋白，其前体m r n a 经过选择性剪接后可以形成3 8 0 1 6 个不同的蛋白i s o f o r m ，几乎是 整个果蝇基因组基因数目的两倍( b l a c k , 2 0 0 0 ；g r a v e l e y , 2 0 0 1 ) 。选择性剪接是一种广泛存在 的现象。一半以上人类基因( 3 5 - - 6 0 ) 的转录本经过选择性剪接( m i r o n o ve ta 1 ，1 9 9 9 ； j o h n s o ne ta 1 2 0 0 3 ) ，利用外显子一外显子接头微阵列分析l 万个人类基因的结果显示至少7 4 的多外显子基因受到选择性剪接( j o h n s o n e t a l ，2 0 0 3 ) 。在神经系统中，数以千计的前体m r n a 经过选择性剪接翻译成特异性蛋白i s o f o r m ，决定离子通道和受体的特异性，参与学习与记 忆、神经元细胞识别、递质传递等等( g r a b o w s k ia n db l a c k , 2 0 0 1 ) 。7 0 - 9 0 0 4 的选择性剪接改 变了蛋白产物0 c a n e t a l 。2 0 0 1 ；m o d r e k e t a l ，2 0 0 1 ) 。剪接异常不仅可以引起严重的发育缺陷， ( x ue ta 1 ，2 0 0 5 ) ，与人类疾病也有很密切的关系( c a c e m sa n dk o m b l i h t t , 2 0 0 2 ；n i s s i m r a f i n i a a n dk e r e m2 0 0 2 ；f a u s t i n oa n dc o o p e r , 2 0 0 3 ；g a r e i a - b l a n e oe ta 1 。2 0 0 4 ) ，大约1 5 引起疾病的 突变影响剪接( k r a w c z a ke ta 1 ，1 9 9 2 ) ，剪接调控也作为一种遗传修饰因素影响疾病的表现度 ( n i s s i m r a f i n i aa n dk e r e m2 0 0 2 ) 。 剪接体主要由u l 、u 2 、1 3 4 、u 5 、u 6 等五种us n r n p s ( s m a l l n u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n ) 和多种非s n r n p 剪接囡子组成，在这些非r n p 剪接因子中，一类富含丝氨酸( s e r i n e , s ) 和精氨酸( a 画n i n e ，r ) 的蛋白，s r ( s e r a r gr i c h ) 蛋白发挥了非常重要的作用，它们与前体 m r n a 上的剪接调控序列相结合，并招募其它剪接辅助因子，促进剪接体的组装和催化活 性的正常发挥( g r a v e l e y , 2 0 0 0 ；b o u r g e o i s d a l 。2 0 0 4 ) 。s r 蛋白不仅是组成型剪接完成所必需， 在选择性剪接的调控中也起着非常重要的作用( g m v e l e y , 2 0 0 0 ；b o u r g e o i se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 s r 蛋白是一类进化保守，结构相似的蛋白家族，具有如下结构特征：氨基端有一个或 两个r n a 识别基序( r n a - r e c n g n i t i o nm o t i f , r a m ) ，羧基端有一个富含丝氨酸( s e r i n e ，s ) 和 精氨酸( a r g i n i n e ，r ) 残基的r s 结构域，s r 蛋白的命名也即由此而来。一般认为，r r m 决定 s r 蛋白的r n a 结合特异性，而r s 结构域则介导s r 蛋白与其它蛋白间的相互作用，招募 各种剪接因子，促进剪接体的组装和剪接位点配对( w ua n dm a n i a t i s ，1 9 9 3 ；b o u r g e o i se ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。但最近发现，r s 结构域也可以直接结合前体m r n a 分支点和5 剪接位点促进剪接， 表明r s 结构域可能在剪接过程中具有更复杂的功能( s h e na n dg r e e n ，2 0 0 4 ；s h e ne ta 1 ，2 0 0 4 ； s h e na n d g r e e n 2 0 0 6 ) 。在细胞内，s r 蛋白的r s 结构域作为介导s r 蛋白与s r 蛋白核输入 受体( t r a n s p o r t i n s r ) 结合的核定位信号( c a c o r e se ta 1 ，1 9 9 7 ；k a t a o k ae ta 1 ，1 9 9 9 ；l a ie ta 1 ， 2 0 0 0 ) ，并且决定个别s r 蛋白的核质穿梭( c a c e r e se ta 1 。1 9 9 8 ) 。r s 结构域丝氨酸的磷酸化在 第一章文献综述 s r 蛋白活性和定位的调控中起着重要作用( b u b u l y a e ta 1 ，2 0 0 4 ；s 锄f b r de ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 1 2s r 蛋白概述 1 2 1s r 蛋白的鉴定历史 s r 蛋白是后生生物中不可或缺的剪接因子，在酵母这样的低等生物中则不存在 ( g m v e l 锡2 0 0 0 ) 人们在哺乳动物中已发现1 0 种经典s r 蛋白：s r p 2 0 ，9 g 8 ，s r p 3 0 c 。 a s f s f 2 ，s c 3 5 ，s r p 4 0 ，s r p 4 6 ，s r p 5 4 ，s r p 5 5 ，s r p 7 5 ，它们分子量大小从2 0 到7 5 k d 不等。并 在各物种中高度保守( 见图1 ) ( s f b r de ta l ，2 0 0 3 ) 。目前鉴定一种蛋白是s r 蛋白的标准主要 有如下三条：( 1 ) 结构与图1 相似：n 端有一个或两个r n a 识别基序，c 端有一个r s 结构域； ( 2 ) r s 结构域中含有大量精氨酸，丝氨酸二肽，丽谷氨酸天冬氨酸一赖氨酸，精氨酸二肽的数 目有限；( 3 ) 具有恢复无s r 蛋白提取物剪接活性的能力( b o o i se ta 1 ，2 0 0 4 ) 最早发现的s r 蛋白是a s f 愿f 2 ，它由两个实验室以不同的方法独立发现：s f 2 ( s p j i c i n g f a c t o r2 ) 是一种可以恢复s 1 0 0 提取物剪接活性的剪接因子( i o a i n 日c ta 1 ，1 9 9 0 a ；k r a i n e ta 1 ， 1 9 9 0 b ) ，而a s f ( a h e m 砒j v es p l i c i n g 缸1 0 r ) 则可影响s v 4 0 早期前体m r n a5 剪接位点的选择 ( o e dm l e y , 1 9 9 0 ；g ee ta 1 。1 9 9 1 ) 。这两种不同的方法反映了s r 蛋白家族的两个重要特 征：首先，它能否恢复无s r 蛋白的提取物( 如s 1 0 0 提取物) 的完全剪接活性，这也表明各 种s r 蛋白至少在组成型剪接中的功能是可以互相替代的。其次，能够调控选择性剪接。 基于抗体的策略鉴定出另外几种s r 蛋白：s c 3 5 是通过一种针对分离的剪接体组分的单 克隆抗体鉴定出来( f u 卸dm i a t i s 。1 9 9 0 ) ，它的一般特征与a s f s 嗍相似。应用一种识 别r n a 聚合酶i i ( p o l ) 转录位点的单克隆抗体( m a b l 0 4 ) 之后通过两步纯化鉴定出s r p 2 0 ， s r p 4 0 ，s r p 5 5 和s r p 7 5 四种s r 蛋白( z a h l e r e ta 1 ，1 9 9 2 ；z a h l e re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。一种针对j l i l 鼢一 制备物蛋白的抗体鉴定出9 g 8 ( c a v 妇e ta l ，1 9 9 4 ) ，s r p 5 4 j i ! q 通过一种自身免疫抗体鉴定出 来( z h g d w i i 1 9 9 6 ) 。 s r 蛋白基因是机体发育与生存所必需的，如果蝇b 5 2 基因( 人s r p 5 5 的同源基因) 缺 失导致一、二龄幼虫致夕e 识i n g d 魄，1 9 9 4 ) 鸡d t 4 0 b 细胞中条件性敲除a s f 塔f 2 基因引起 细胞死亡( w a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) ，以线虫s f 2 a s f 同源基因b p - 3 为靶点进行r n a 干涉( r n a i l l t e 睡n ，r n a i ) 导致后期胚胎致死，以其它六种线虫s r 蛋白基因为靶点分别进行r n a 干涉无表型产生，但同时对多个线虫s r 蛋白基因进行r n a 干涉时，可观察到发育缺陷或致 死( l 0 n 舯me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这可能是因为这些s r 蛋白不参与必需基因的拼接，也可能是因为 其它s r 蛋白替代它们的功能。某些s r 蛋白可能是特异神经元所必需的，这些s r 蛋白缺陷引 起的轻微表型需用行为学或电生理等更精细的实验进行分析。 1 2 2s r 相关蛋白 上面已经提到，s r 蛋白共同的结构特征在于其氨基端有一个或两个r n a 识别基序，羧 基端有一个富含丝氨酸和精氨酸残基的r s 结构域。除s r 蛋白外，还有一类含有r s 结构域或 r s 相似结构域的蛋白，称为s r 相关蛋白( s r - m l a t e d p r o t c i n s ) 。生物信息学分析发现人类有 约5 0 种s r e 关蛋白，线虫有约8 0 种，果蝇有约1 1 0 种( b o u c h e r ，c ta 1 2 0 0 1 ) 。s r 相关蛋白的 功能包括：参与r n a 加工( 剪接与3 末端加丁) ，染色质组装与转录，具有酶活性( 激酶与 磷酸酶) 等( g m v e l e y , 2 0 0 0 1 。大部分s r 相关蛋白( 除m i i s r m l 6 0 之外) ，和s r 蛋白样， 包含至少一个r r m 和一个r s 结构域。但是，他们的整体结构和，或r s 结构域与s r 蛋白有显 著差别。比如，u 2 a f 6 5 在n 端有一个r s 结构域，c 端有三个r n a 识别基序，而s r 蛋白的r n a 识别基序是在n 端。在某些情况f ，s r 相关蛋白的整体结构与s r 蛋向一样，但r s 结构域不 2 东南大学博：t 学位论文 同。比如果蝇s r 相关蛋r s f l ( r e p r e s s o rs p l i c i n g f a c t o rl ，r s f i ) 是一种含有g r s 结构域( 富 含甘氨酸，精氨酸，丝氨酸：g l y c i n e a r g i n i n e s e d n e ) 的蛋白( g r s 结构域表示r s 结构域) ( l a b o u r i e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。但是这一结构域只含有几个r s 三肽。和一个r s r s 四肽。s r r p 8 6 ( s r - r e l a t e dp o l y p e p t i d eo f 8 6k d a ， s r 相关8 8 k d a 多肽) r s 结构域的中心区域含有一个8 0 氨基酸残基长富含e k r - - - 肽的结构域，正是这一结构域使其具有剪接抑制活性( b a m a r de t a 1 。2 0 0 0 ) 。另一种s r 相关蛋l 刍s r r p 4 0 ( s r - r e l a t e dp o l y p e p t i d eo f 4 0k d a , s r 相关4 0 k d a 多 肽) ，也称为s r p 3 8 ( c o w p e r e ta 1 ，2 0 0 1 ：s h i na n d m a n l e y , 2 0 0 2 ) ，其r s 结构域中赖氨酸，谷 氨酸天冬氨酸和谷氨酰胺，天冬酰胺残基的含量很高( 接近1 0 ) ，但这些氨基酸在经典r s 结构域中并不常见。 1 2 3s r 蛋白的r n a 结合区域 s r 蛋白的n 端r n a 结合区域由一个或两个8 0 到1 0 0 个氨基酸残基长的结构域组成，它 的功能主要是与前体r n r n a 及其它小核r n a ( s m a l ln u c l e a rr n a ，m r n a ) 结合，协助剪接复 合体的形成。这些结构域在核内不均一核糖核蛋白( h e t e r o g e n e o u sn u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n ， h n r n p ) 复合体中也有( k r e e i c , a n ds w a n s o n ，1 9 9 9 ；d r e y f u s se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，它们被称为r n a 结合结构域( r n a - b i n d i n g d o m a i n s ，r b d s ) 。核糖核蛋白结构域( r i b o n u c l e o p r o t e i n d o m a i n s ， r n p d o m a i n s ) ，或r n a 识别基序( r n a r e c o g n i t i o n m o t i f s ，r r m s ) 。其中有两个分别含有 八个和六个氨基酸的保守基序，称为褂岬一i 1 1 r n p - - 2 。脊椎动物的s r p 2 0 ，9 g 8 ，s c 3 5 ，s r p 4 6 和s r p 5 4 都只含有一个r r i v l ，而其它s r 蛋白则有两个r r m ( 图1 ) 。此外，9 g 8 在r r v l 下游 含有一个c c h c 型的锌指结构域，该结构域也参与r n a 识别( c a v a l o ee ta 1 ，1 9 9 4 ；c a v a l o ce t a 1 。1 9 9 9 ) ，在植物中也发现了类似含锌指的s r 蛋白( l o p a t oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 大部分n 末端r r m s 在r n p 一1 序列下游有一个序列非常保守的八肽( e d p r d a e ，d d ) ，它也是s r 蛋白家族的特征 之一 图1 s r 蛋白示意图( b o u r g e o i se t a l 2 0 0 4 ) 各s i 潘白按照分子量由小到大排列r r m ，r s 结构域和甘氨酸富集结构域分别以深灰色浅灰色和 黑色表示9 g 8 的锌指结构域和s r p 5 4 的电荷结构域也已标出 1 2 4s r 蛋白的r s 结构域 r s 结构域位于s r 蛋白的羧基端，其特征在于它含有大奄的精氨酸和丝氨酸，它们形 成r s 二肽。在a s f s f 2 和s c 3 5 的r s 结构域中，这两种氨基酸残基分别占7 6 与8 0 。 r s 结构域的长度变化很大，从2 4 个氨基酸残基( s r p 3 0 c ) 剑3 1 6 个氨基酸残基( s r p 7 5 ) 。 k s 结构域中常含有精氨酸重复，它们可能是核定位信号的一部分。此外，在某些s r 蛋自 第一章文献综述 ( 如9 g 8 和s r p 5 4 ) 中，有典型的八肽( r r s r s x s x ) 重复，但该序列的功能尚不清楚。 r s 结构域的主要功能是参与蛋白相互作用。s r 蛋白通过它们与其它s r 蛋白或剪接因 子的r s 结构域结合( 如t r a , t r a 2 ，u 1 7 0 l ( u 2 a f 3 5 ) ，促进剪接复合体的形成。r s 结构域中 丝氨酸可以被高度磷酸化，磷酸化对r s 结构域之间的相互结合非常重要：如a s f s f 2 的磷酸 化是它与u 卜一7 0 k 和u ls l l l 满异性结合所必需的( x i a oa n dm a n l e y , 1 9 9 7 ) ，而且a s f s f 2 的磷酸化与去磷酸化对体外剪接也都是必需的( c a ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 关于r s 结构域磷酸化对 s r 蛋白功能的调控下面还有更详尽的讨论 一般情况下，不同s r 蛋白的r s 结构域在功能上可以相互替代。用a s f s f 2 ，s c 3 5 ， s r p 4 0 希i s r p 2 0 进行的体内外交换实验表明，就对特异性底物的组成型剪接与选择性剪接而 言，r s 结构域可以相互替代，对细胞生存的影响也一样( c h a n d l e re ta 1 ，1 9 9 7 ；v a i ld e rh o u v a n v a n o o r d te t a l 2 0 0 0 ；w a n ge ta 1 1 9 9 8 ) 。将多种s r 蛋白的r s 结构域与同一种r n a 结合蛋白 ( 噬菌体m s 2 蛋白) 融合后进一步定量研究发现：每一种r s 结构域剪接激活活性不同 ( g r a v e l e ya n dm a n i a t i s 1 9 9 8 ；g r a v e l e ye ta 1 ，1 9 9 8 ) 。四肽r s 残基簇( r s r s 或s r s r ) 数目 与剪接活化活性之间存在一种近乎线性的关系，提示每一个这样的r s 簇可能作为一种基序 起作用。但是其它参数，如r s 二肽的密度或r s 簇的局部环境对其功能可能也非常重要，并 决定它们某些特定的功能。与大多数经典s r 蛋白不同，酵母双杂交实验发现s r p 5 4 特异性地 与s c 3 5 及a s f s f 2 结合，而与u 1 - - 7 0 k 或u 2 a f 3 5 的结合则很弱( z h a n ga n dw u , 1 9 9 6 ) 有 趣的是，对人a s f s f 2 和它的果蝇同源基因( 其中2 0 个r s 二肽中的8 个变成连续的甘氨酸) 的比较研究表明这些s r 蛋白的某些功能不能完全互相替代( a l l e m a n d , e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，这表明 s r 蛋白的某些功能是相对保守，可以互相替代的，但也有一些功能是各成员特异的，无法 互相替代。对s r 蛋白的多种功能还需要进一步深入解析。 1 2 5r s 结构域的r n a 结合功能 近年来，人们发现，r s 结构域不仅仅参与蛋白一蛋白闻的相互作用，其在剪接复合体 形成过程中还参与同r n a 的结合，这打破了以往对k s 结构域功能认识的局限，使人们对r s 结构域的功能有了更全面的了解。 目前关于s r 蛋白功能普遍接受的模型是蛋白一蛋白相互作用模型。该模型认为：与剪 接增强子结合的s r 蛋白的r s 结构域与其它含r s 结构域的剪接因子直接结合，招募其它剪接 因子，从而促进剪接体形成( g r a v e l e y , 2 0 0 0 ) 。2 0 0 4 年，g r e e n 等发现r s 结构域也可以通过 与r n a 结合来发挥功能：a 复合体中s r 蛋白a s f ，s f 2 的r s 结构域与r n a 直接结合，并且证 明与r n a 结合是r s 结构域的普遍特性( s h e n , e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 s r 蛋白r s 结构域与r n a 的结合是有时间顺序的：最早在e 复合体中，是u 2 a f 6 的r s 结构域与前体m r n a 分支点结合；接着，在a 复合体中，与剪接增强子结合的s r 蛋白的r s 结构域取代u 2 a f 6 5 r s 结构域，与分支点结合，最后，在后期剪接复合体中，则是另外一种 不与剪接增强子结合的s r 蛋白的r s 结构域与5 剪接位点结合( s h e na n dg r e e n , 2 0 0 4 ) 。在剪接 体组装的整个过程中，几种不同剪接因子的r s 结构域序贯性地与前体m r n a 的不同序列结 合( 图2 ) 。 r s 结构域与r n a 的结合拓宽了人们对s r 蛋白r s 结构域功能的认识，r s 结构域的r n a 结合功能与它参与蛋白相互作用之间并不互相排斥：目前已经很清楚地知道s r 蛋白磷酸化 状态的动态变化是完整剪接体组装所必需的，而r s 结构域的磷酸化对s r 蛋白的活性有着1 常重要的调控作用( g r a v e l e y , 2 0 0 0 ) 。磷酸化程度的高低可能决定r s 结构域是同r n a 结合还 是参与蛋白相互作_ l j ：低磷酸化的r s 结构域可能更易于同r n a 结合，而高磷酸化的r s 结构 域则可能通过带正电的精氨酸残基与带负电的磷酸化丝氨酸残基之间的结合介导蛋白一蛋 4 东南大学博士学位论文 白相互作用。 图2 r s 结构域与前体m r n a 的序贯性结合( h e r t e la n dg r a v e l e y , 2 0 0 5 ) 1 3s r 蛋白与剪接 1 3 1s r 蛋白与组成性剪接 目前对s r 蛋白功能的研究主要集中在它们参与前体m r n a 的剪接，s r 蛋白对组成性剪 接是必不可少的。这也是鉴定一种蛋白是否是s r 蛋白家族成员主要标准之一。s r 蛋白通过 与其它剪接因子及前体r n a 相互作用，从而招募各种剪接因子，促进剪接体的组装。 剪接体的组装主要有以下几个步骤：( 1 ) u l s n r n p 与5 剪接位点结合，s f i ( s p l i c i n