（应用化学专业论文）荧光分析法在DNA测定中的研究和应用.pdf

摘要 近年来，荧光分析法在各个领域的应用率有着显著的提高。当大分子和其他 物质发生作用的时候，体系会有荧光信号的变化，这是因为它的微环境发生改变 从而使得它的物理和化学性质发生改变。基于这些，荧光分析法可以用于d n a 的 测定以及d n a 和其它物质相互作用机理的研究。本论文主要涉及以下三方面工 作： 1 应用荧光分析法研究了槲皮素一钴一核酸三元体系，发现槲皮素与c o ( i i ) 的二元络合物与变性小牛胸腺d n a 结合后荧光增强，并且强度与d n a 浓度成正比， 并由此建立了荧光法测定d n a 的分析方法。此方法快速、灵敏、准确，而且为研 究槲皮素等黄酮类药物与d n a 的作用机理提供了参考依据和理论支持。 2 通过光谱法研究了喹诺酮类抗生素，金属离子和d n a 之间的相互作用。 喹诺酮类药物可以用来测定d n a 的含量。同时，紫外和荧光光谱法用于研究喹诺 酮类抗生素，金属离子和d n a 三元体系的作用机理。喹诺酮可以和c d + 或d n a 形 成稳定的二元配合物，而喹诺酮、c u ”和d n a 三者之间可以形成稳定的三元配合 物。我们计算了它们之间的结合位点数和结合常数，并且寻求了最佳的结合条件。 3 研究聚阳离子和9 n a 之间的相互作用。通过共振光谱法，聚阳离子可用 于测定d n a 的含量。该方法可信、准确且简便。红外和紫外光谱用于反应的机理。 结果表明在反应过程中由于d n a 的微环境发生改变导致d n a 的构象发生改变。 关键词：荧光，共振光散射，d n a a b s t r a c t r e c e n t l yt h ef l u o r e s c e n c ea n a l y s i sa p p l i e di ne v e r yf i e l dh a si n c r e a s e dm a r k e d ly _ f l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e sa r eg e n e r a l l ys e n s i t i v et oc h a n g ei nt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a l e n v i r o n m e n ta n dc a nb eu s e dt oc h a r a c t e r i z er i g i dd y n a m i c so fm a c r o m o l e c u l e st o w h i c ht h e ya r ea t t a c h e d b a s e do nt h e s e ，t h em e t h o d so ft h ed e t e r m i n a t i o no fd n a a n dt h es t u d yo ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n do t h e rm o l e c u l e sa t ee s t a b l i s h e d t h et h e s i si sc o m p o s e do ft h r e ep a n sa sf o l l o w ： i np a r to n e ，t h em e t h o do ff l u o r e s c e n c ea n a l y s i si su s e di nt h es t u d yo ft h e q u e r c e t i n + c o ( i i ) + d n as y s t e m t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f q u e r c e t i n + c o ( i i ) c o m p l e xi n c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o no fd n a t h em e t h o di n d e t e r m i n a t i o no fd n ai sb a s e do nt h i s t h i sm e t h o dh a sm a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha s q u i c k ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dh i g hp r e c i s i o n ，p r o v i d i n gp r o o f sa n dt h e o r i e sf o rt h es t u d y o fo t h e rf l a v o n e s i np a r tt w o ，t h ei n t e r a c t i o no fn u o r o q u i n o l o n ea n t i m i c r o b i a la g e n t ，m e t a li o na n d d n ah a sb e e ns t u d yb ys p e c t r a lm e t h o d t h ef l u o r o q u i n o l o n ec o u l db eu s e dt o d e t e r m i n et h ea m o u n to fd n a a l s o ，t h em e c h a n i s m so ft h ei n t e r a c t i o na m o n g f i u o r o q u i n o l o n e ，d n aa n dc u “a r es t u d i e db yf l u o r e s c e n c ea n du vs p e c t r am e t h o d t h ef l u o r o q u i n o l o n ec a nf o r ma s t e a d yb i n a r yc o m p l e xw i t h c u “o rd n a f l u o r o q u i n o l o n ea n dd n a c a nf o r mc o m p l e xm e d i a t e db yc u “t h ec o m p o s i t i o no f t h ec o m p l e xi sd e t e r m i n e d t h ea f f e c t st ot h er e a c t i o na r ea l s of o u n d i np a r tt h r e e ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np o l y c a t i o na n dd n aw a ss t u d i e d t h e p o l y c a t i o nc o u l db eu s e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fd n ab yl i g h ts c a t t e r i n gm e t h o d t h i sm e t h o di sr e l i a b l e p r e c i s ea n ds i m p l e f t l r s p e c t r aa n du v - s p e c t r aa r eu s e dt o s t u d yt h em e c h a n i s m so ft h ei n t e r a c t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec o n f o r m a t i o no f t h ed n ah a sc h a n g e dd u r i n gt h ei n t e r a c t i o nb e c a u s et h em i c r o e n v i r o n m e n to fd n a c h a n g e s k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c e ，r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，d n a 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果由本人承担。 几， 敝储签名涮1 帆自6 年6 月5 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解湖北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 ( 保密论文在解密后遵守此规定) 论文作者签名：五彳了铽 签名日期：矾年6 月，同 翩签名霉多介导师签名广f 砂号 签名日期：如6 年护莎 、绪论 核酸，也称为多聚核苷酸，是构成生命的重要化学物质。可分为两种不同的 类型，即脱氧核糖核酸( d e o x y 曲o n u c l e i ca d d ，简称d n a ) h i 核糖核酸 b o n u d e i c a c i d ， 简称r n a ) 。这两类核酸在所有的动物和植物中都存在，d n a 是种遗 传物质，主要存在于细胞核染色体中。r n a 在蛋白质生物合成中起着突出作用， 主要分布在细胞质中。 1 核酸的研究进程 1 1 双螺旋的发现 核酸研究中划时代的工作是w a t s o n 和c r i c k 于1 9 5 3 年创立的d n a 双螺旋 结构模型。这种模型的提出是建立在对d n a 如下三个方面的认识的基础之上的。 首先，研究学者在核酸化学研究中获得了d n a 化学组成及结构单元的知识，特 别是c h a r g a f f 于1 9 5 0 1 9 5 3 年发现的d n a 化学组成的新事实，即d n a 中四种 碱基的比例关系为a ，t - g c = 1 ；再则，化学工作者通过x 射线衍射技术对d n a 晶体的研究中获得了一些原子结构的最新参数；最后，遗传学研究所积累的有关 遗传信息的生物学属性的知识也给模型的建立提供了很大的支持。 综合以上三方面的知识所创立的d n a 双螺旋结构模型，不仅阐明了d n a 分子的结构特征，而且提出了d n a 作为执行生物遗传功能的分子，从亲代到予 代的d n a 复制( r e p l i c a t i o n ) 过程中，遗传信息的传递方式及高度保真性。其正确 性于1 9 5 8 年被m e s e l s o n 和s t a h l 的实验所证实。d n a 双螺旋结构模型的确立为 遗传学进入分子水平奠定了基础，是现代分子生物学的里程碑。从此核酸研究受 到了前所未有的重视。 1 2 日新月异的研究进展 核酸研究的进展日新月异，所积累的知识几年就要更新。其影响面之大，几 乎涉及生命科学的各个领域。双螺旋结构创始人之一的c r i c k 于1 9 5 8 年提出的 分子遗传中心法贝l j ( c e n t r a ld o g m a ) 揭示了核酸与蛋白质间的内在关系，以及r n a 作为遗传信息传递者的生物学功能。并指出了信息在复制、传递及表达过程中的 一般规律，即d n a r n a 一蛋白质。遗传信息以核苷酸顺序的形式贮存在d n a 分子中，它们以功能单位在染色体上占据一定的位置构成 n i ( g e n e ) 。因此， d n a 顺序测定无疑是非常重要的。1 9 7 5 年s a n g e r 发明的d n a 测序( d n a s e q u e n c i n g ) 加减法为实现这一想法起了关键性的作用。由此而发展起来的大片段 d n a 顺序快速测定技术m a x m 和g i l b e r t 的化学降解法( 1 9 7 7 年、和s a n g e r 的 末端终1 1 2 - 法( 1 9 7 7 年1 ，已是核酸结构与功能研究中不可缺少的分析手段。我国学 者洪国藩于1 9 8 2 年提出了非随机的有序d n a 测序新策略，对d n a 测序技术的 发展作出了重要贡献。目前，d n a 测序的部分工作已经实现了仪器的自动化操 作。凭借先进的d n a 测序技术及其它基因分析手段，人类正在进行一项以探明 自身基因组( g e n o m e ) 全部核苷酸顺序( 单倍基因组含3 x1 0 9 碱基对) 为目标的宏 伟计划一人类基因组图谱制作计划( h u m a ng e n o m em a p p i n gp r o j e c t l 。 w a t s o n c r i c k 模型创立3 6 年后的1 9 8 9 年，一项新技术扫描隧道显微镜( s c a n n i n g t u n n e l m i c r o s c o p y ，s t m ) 使人类首次能直接观测到近似自然环境中的单个d n a 分子的结构细节，观测数据的计算机处理图像能在原子级水平上精确度量出 d n a 分子的构型、旋转周期、大沟( i n a j o rg r o o v e ) 及4 , 沟( m i n o rg r o o v e ) 。这一成 果是对d n a 双螺旋结构模型真实性的最直接而可信的证明。 2 核酸的分子结构 核糖核酸为单链结构。脱氧核糖核酸的结构有一级结构、二级结构、三级结 构之分。 2 1d n a 的一级结构 d n a 的一级结构是指d n a 分子中核苷酸的排列顺序，d n a 顺序( 或序列) 是这一概念的简称。由于核苷酸之问的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基顺 序。d n a 是分子量巨大的生物高分子，如人的d n a 就包含了3 1 0 9 个碱基对， 如此数目的碱基所能容纳的信息量之大是可想而知的。生物世界里形形色色的遗 2 传信息都包含在组成d n a 的a 、g 、c 、t 这四种核苷酸的排列顺序之中。d n a 分子中不同排列顺序的d n a 区段构成特定的功能单位，这就是基因，不同基因 的功能各异，各自分布在d n a 的一定区域。基因的功能取决于d n a 的一级结 构。 2 2d n a 的二级结构 d n a 的二级结构为相互平行而走向相反而形成的双螺旋构型。d n a 双螺旋 结构的要点如下； ( 1 ) 主链( b a c k b o n e ) ：由脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接而成。d n a 的主链有 两条，它们似“麻花”状绕一共同轴心以右手方向盘旋，相互平行而走向相反形 成双螺旋构型。主链处于螺旋的外侧，这正好解释了由糖和磷酸构成的主链的亲 水性。所谓双螺旋就是针对两条主链的形状而言的。 ( 2 碱基对( b a s ep a s o ：碱基位于螺旋的内侧。它们以垂直于螺旋轴的取向通过糖 苷键与主链糖基相连，同一平面的碱基在两条主链间形成碱基对，配对碱基总是 a 与t 和g 与c 。碱基对以氢键维系，a 与t 间形成两个氢键。d n a 结构中的 碱基对与c h a t g a f f 的发现正好相符。从立体化学的角度看，只有嘌呤与嘧啶间配 对才能满足螺旋对于碱基对空间的要求，而这两种碱基对的几何大小又十分相 近，具备了形成氢键的适宜键长和键角条件。每对碱基处于各自自身的平面上， 但螺旋周期内的各碱基对平面的取向均不同。碱基对具有两次旋转对称性的特 征，即碱基旋转1 8 0 。并不影响双螺旋的对称性，也就是说双螺旋结构在满足两 条链碱基互补的前提下，d n a 的一级结构产并不受限制。这特征能很好的阐 明d n a 作为遗传信息载体在生物界的普遍意义。 ( 3 ) 大沟和小沟：大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。 小沟位于双螺旋的互补链之间，而大沟位于相毗邻的双股之问。这是由于连接于 两条主链糖基上的配对碱基并非直接相对，从而使得在主链间沿螺旋形成空隙不 等的大沟和小沟。在大沟和小沟内的碱基对中的n 和o 原子朝向分子表面。 ( 4 ) 结构参数：螺旋直径2 r i m 螺旋周期包含1 0 对碱基；螺距3 4 咖：相邻碱基 对平面的间距0 3 4 n m 。 2 3d n a 结构的多态性 d n a 分子有a 、b 、c 、d 、e 和z 等几种构象。其中a e 构象的d n a 都 有一个共同的特点，即它们都是右手双螺旋；两条反向平行的核苷酸链通过w a t s o n c r i c k 碱基配对结合在一起，链的重复单位是单核苷酸，这些螺旋中都有两 个螺旋沟。分为大沟与小沟，只是它们的宽窄和深浅程度有所不同。而z 构象 是左手双螺旋，在主链中各个磷酸根呈锯齿状排列，有如“之”字形一样，因此 叫它z 构象( 英文字z i g z a g 的第一个字母) 。另外，这一构象中的重复单位是二核 苷酸而不是单核苷酸；而且z d n a 只有一个螺旋沟，它相当于b 构象中的小沟， 它狭而深，大沟则不复存在。应当指出z d n a 的形成通常在热力学上是不利的。 因为z - - d n a 中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产生静电排斥。但是，d n a 链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。d n a 解螺旋却是d n a 复制和 转录等过程中必要的环节，因此认为这一结构位点与基因调节有关。此外，d n a 螺旋上沟的特征在其信息表达过程中起关键作用。调控蛋白都是通过其分子上特 定的氨基酸侧链与d n a 双螺旋沟中的碱基对一侧的氢原子供体或受体相互作 用，形成氢键从而识别d n a 上的遗传信息的。大沟所带的遗传信息比小沟多。 沟的宽窄和深浅也直接影响到调控蛋白质对d n a 信息的识别。z d n a 中大沟消 失，小沟狭而深，使调探蛋白识别方式也发生变化。这些都暗示z d n a 的存在 不仅仅是由于d n a 中出现嘌岭一啶嘧交替排列之结果，也一定是在漫漫的进化过 程中对d n a 序列与结构不断调整与筛选的结果，有其内在而深刻的含意，只是 人们还未充分认识而已。 3 核酸和分子问的作用力 通常，各种分子与核酸的结合区位于核酸的碱基、磷酸骨架以及戊糖环部分。 核酸由平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链形成的大沟、 小沟组成分子的识别位点。分子和核酸的作用方式主要有三种：非共价键结合 ( n o n - c o n v e r l a n c eb i n d i n g ) 、共价键结合( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) 和剪切作用f s h e a r i n t e r a c t i o n ) 。 4 3 1 非共价键结合 非共价键结合包括表面结合( o u t s i d eb i n d i n g ) 、沟槽结合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌 插结合( i n t e r c a l a t i o nb i n d i n g ) 一= 种模式。一般认为表面结合作用于d n a 双螺旋的 外壁。没有选择性。 沟槽结合是在核酸的大沟或小沟的碱基边缘直接作用，大分子蛋白质结合于 d n a 的大沟槽中，而大多数小分子则是在小沟槽区作用。小沟槽区内是a t 富集区，小分子通过与胸腺嘧啶碱基c 一2 上的羰基氧或线嘌呤碱基n 3 上的氮形 成氢键与a t 碱基结合。 嵌插结合是小分子的平面成分嵌入核酸的碱基之间。基于小分子的结构不 同，嵌插作用又可细分为单链嵌插和双链嵌插作用。与非共价键结合相比，小分 子与d n a 的共价键结合的序列特异识别能力要强的多。一些经典的嵌入剂主要 是平面的带正电的芳香族小分子，由于其分子体积小，具有一定的平面性，可以 嵌入到d n a 的双螺旋碱基对之间。非经典的嵌入剂主要有两类：一类是双嵌入 剂，它是两个嵌插环被不同长度的链共价连接起来，相对于一元嵌插剂来说，作 为药物的生物活性往往由于与d n a 的强结合而增强。另一类是带有多个大取代 基的嵌插剂。如果嵌插剂带的取代基太大，或有极性，或带有电荷，则对嵌插剂 结合及分解的动力学都会有影响。 3 2 共价结合( c o n v e r l a n c eb i n d i n g ) 药物与核酸的共价结合主要是同核酸各种碱基的反应，如亲核反应，亲电反 应，加成反应等。主要表现为核酸的烷基化及d n a 的链间交联、链内交联等， 共价结合的序列识别能力比非共价结合要强得多。早期使用的绝大多数抗癌药物 具有使d n a 烷基化的功能。它们对细胞的作用基本上没有选择性，所以l | 缶床使 用有严重的毒副作用，甚至有致癌作用。 3 3 剪切作用( s h e a ri n t e r a c t i o n ) d n a 断裂在d n a 修复、转录及突变中是很重要的生物学过程。具有剪切作 用的分子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选择性决定的。目前天然的抗 生素类d n a 断裂剂有博莱霉素、针棘霉素等。合成的d n a 断裂剂有邻菲咯啉 为配体的弱酸性金属配合物，它们具备对d n a 结构特异性断裂功能。 4 核酸的定量分析方法 目前，对d n a 的定量分析主要由三种方法：1 、光度分析法。其中又包括 基于磷含量的光度分析法、基于碱基的紫外吸收光度分析法和基于戊糖含量的光 度分析法三种；2 、荧光分析法。应用于d n a 测定和结构研究的是各种荧光试 剂探针；3 、共振光散射技术。各种超分子、小分子、高分子和有机小分子染料 用于此方法测定d n a ，其中光度分析法大都繁琐、耗时长。尽管荧光分析法以 其高灵敏度和高选择性在d n a 的定量分析中发挥着十分重要作用，但不少经典 的荧光探针存在不稳定、致癌、价格较贵等缺陷。而共振光散射作为一种新兴的 技术，具有简便、快速、灵敏度高、选择性高等优点，但其在分析化学中的应用 和研究中还有很多的不足，其理论，尤其是成因方面还存在较多争论。需要做大 量工作来进一步完善。 4 1 光度分析法 d n a 由磷酸根、碱基和脱氧戊糖三部分组成，因而可以通过光度分析法， 基于其组成成分对它进行测定。 a 、基于磷含量的光度分析法：d n a 中含磷与试样中d n a 的含量成正比， 约为9 2 ，因此只要从d n a 样品中测得含磷量，就可计算出样品中d n a 含量，这种方法称为定磷法。定磷法准确度好，灵敏度高，常作为其他 核酸测定方法的基准。 b 、基于碱基的紫外吸收的光度分析法：组成嘌呤和嘧啶的碱基具有共轭双 键，这使得d n a 能强烈吸收2 5 0 2 9 0n m 的紫外光，故只要测得样品的 吸光度，就可以计算出d n a 的浓度。该方法测定波长为2 6 0 和2 8 0n m ， 而在该测定波长下，许多有机物都能产生干扰。 c 、基于戊糖含量的分析法：根据d n a 中脱氧戊糖与硫酸、二苯胺( d p a ) 、 硫代巴比妥等的反应，亦可测定d n a 含量。 4 2 荧光分析法 荧光分析法已发展成为分析化学工作者必须掌握的一种重要的分析方法，荧 光分析法和一般的紫外一可见分光光度法相比，具有许多突出的优点：( 1 ) 灵敏 度高，可达l o 8 甚至1o - ”数量级；( z ) 选择性高；( 3 ) 具有多种测定参数：如荧光 寿命，荧光量子产率，荧光各向导性，激发波长、发射波长等；( 4 ) 具有多种检 测技术和方法，如同步荧光、导数荧光、偏振荧光、三维荧光、时间分辨荧光分 析法、荧光动力学分析法等n 有机染料撅针 有机染料作为核酸荧光探针研究的最早，发展的最快。其中最常用的是溴化 乙锭【2 】它是一种菲锭染料，在水溶液中荧光很弱，当插入到d n a 的碱基对之 间后，荧光效率大大提高，且激发波长产生较大的位移。将其它核酸探针与溴化 乙锭同时键合至r i d n a 上后，导致溴化乙锭的荧光猝灭，借此来研究药物与d n a 之闻的相互作用。吖啶橙( a o ) 能用于活细胞染色，将其用于细胞中核酸的研究 已有报道。a o 与核酸的结合方式有二种【3 “】：一种是在嵌入核酸双链的碱基对之 间形成a o d n a 复合物。另一种是与核酸骨架上的磷酸基团发生静电作用，形 成a o - - i ) 】n a 复合物。何品刚等人1 5 】采用荧光光谱法对d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 的 作用机理进行了研究，单聚体噻唑橙染料( t o ) 和唑黄f y o ) 以及它们的二聚体 t o t o 和y o y o 在水溶液中不发光，但与双链d n a ( d s d n a ) 形成络合物后荧光 量子产率显著提高，可用于检测0 4 一m o g l 的d n a 6 】。其他的有机染料如原黄素 f 二氨基吖啶1 能与d n a 形成共价键n 喹吖啶能够识别d n a 中的特定碱基对，以 插入的方式与d n a 结合n 色霉素a 3 和橄榄霉素能识别碱基序列却不能插入碱 基对之间t ”，这些物质大多有剧毒、易产生诱变、与d n a 发生不可逆结合 1 0 1 。 因此，寻找无毒、高效、简便的核酸荧光染料探针越来越受重视。赵一兵等报道 了一种基于消除水杨酸、邻氨基苯甲酸荧光自猝灭的d n a 探针【“】。水杨酸、邻 氨基苯甲酸的激发态和基态分子通过分子间氢键形成非荧光二聚体产生自猝灭， 由于d n a 中存在着4 种碱基、磷酸基、戊糖组分，它与水杨酸或邻氨基苯甲酸分 子共存时有竞争反应，破坏二聚体问的氢键，使荧光性单体的含量量增加，荧光 强度增强。此外，药物分子也是常用的核酸有机染料探针。卟啉、金属卟啉与核 酸的研究也很受重视，黄承志等人的研究表明【“，用核酸滴定一定浓度的水溶 性阳离子卟啉t m p y p 4 和t a p p ，二者的荧光被猝灭。北醌类衍生物( 如竹红菌 素h a ) ，是种新型的光疗药物，可用于皮肤病及癌症的治疗f 1 3 。偏端霉素【1 4 1 与d n a 以沟槽式结合为主，优先识别含a t 碱基的d n a 片段。纺锤霉素是一种 二价阳离子的抗病毒物质，它的酰胺( c o n h l 基和d n a d 、沟区的腺嘌呤碱基的 n 3 及胸腺嘧啶碱基的o 一2 之间形成了氢键 1 5 i 。利凡诺( r v n ) 是一种外用杀菌 剂、防腐剂，具有强荧光，以插入的方式与d n a 结合并导致荧光猝灭，检出限 为1 6n g m l ( 1 6 1 。己报道的药物荧光探针还有苯并喹嗪【1 0 l 、亚甲蓝、小檗碱【1 8 】 等。 金属离子荧光探针 目前作为核酸荧光探针的金属离子绝大多数是稀土离子，这主要是由于稀土 离子与生物大分子间的亲和力大，作用后能发射稀土离子的特征荧光，具有光谱 线窄、激发态寿命长、s t o c k s 位移大等优点，已成为核酸分析中常用的金属离子 荧光探针。其中最常用的是n “探针。慈云祥等【1 9 】通过测定核酸混合物酸变- 性 前后荧光强度并用差减法实现对d n a 和r n a 的分别测定。 金属离子配合物荧光探针 通常金属离子和有机配体形成配合物的发光光谱特性是由配合物中有机配 体和金属离子中那些较低电子激发态的性质和相对位置所决定的。作为d n a 结 构和构象探针的金属离子配合大致可分为以下几类： a 过渡金属及贵重金属配合物 核酸的二级结构可以利用过渡金属及贵重金属配合物的发光性质来探测。金 属卟啉类配合物是一类广泛存于自然界中的生物活性物质，m a s t r u z z oa 等人发 现，阳离子的四( 4 - n 一甲基毗啶基妒 啉及其金属配合物比阴离子型卟啉对癌细胞 的光动力学效应强。该类配合物不仅在癌症与肿瘤的光动力疗法中具有诱人的前 景，而且具有抗逆转录病毒的作用。m a r z l l i 及w h e e l e r 等科研小组的研究结果表 明，没有轴向配体的金属卟啉阳离子优先嵌入结合在5 g 3 序列的碱基平面之间， 并引起d n a 构象的相应变化，而具有轴向配体的金属卟啉阳离子因其较大的空 间位阻，优先x j d n a 双螺旋小沟中连续的a t 碱基对进行识剐。卧啉类金属配合 物与d n a 结合后，经过光、氧等活化剂活化后，能够选择性地切割d n a ，将其 进行化学修饰以后可望开发出选择性更好的人工合成酶或抗癌抗病毒药物。科研 工作者对于卟啉- - d n a 配合物的研究中已取得了多项研究成果，但仍未找到其 结合模式与生物活性之间的关系。因此，在该领域内进行深入研究必将具有重要 意义。八面体钉的配合物是一类较新的d n a 作用试剂，可用于d n a 二级结构探 针、d n a 特异性识别和切割试剂【琊”。根据配合物本身的形状、对称性、旋光 性以及与核酸特定部位相匹配原则【2 2 】，钉的配合物可对d n a 或r n a 进行识别。 b a r t o n 在研究金属配合物与d n a 作用时发现z n 2 + 、c o “、r u 2 + 等饱和的八面 体手性配合物具有识别d n a 二级结构的能力，从而发展了识别a 、b 和z 型 d n a 的手性配合物探针 2 3 2 4 】。凌连生等人在r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + 体系中加入d n a 后 荧光增强，以其作为d n a 的光分子开关，在p h 在9 3 1 1 5 的条件下建立了d n a 纳 克级的选择性测定方法【2 5 】。 b 稀土离子氨羧络合物 稀土离子氨羧络合物可作为核酸扩散控制无辐射能量转移荧光探针。黄承志 等通过对具有n 、o 配位基的8 羟基喹啉与不发荧光的稀土离子l a ( ) 、y ( 】叮) 、 s c ( i i i ) 以及a l ( ) 所形成的配合物与核酸作用的研究表明 2 6 3 0 】，它们能与核酸构 成三元荧光体系，荧光量子产率比相应的金属离子与8 一羟基喹啉二元络合物大很 多，荧光寿命增长最大发射波长发生蓝移，并依此建立了核酸的测定方法。慈 云祥等人【3 l j 通过1 b “p h e n 作为核酸荧光探针，利用配合物与碱基之间的能量转 移，实现了r n a 和热变性d n a 的检测；利用核酸与e u “四环素及其同系物生成 配合物间作用后延长了稀土离子的荧光寿命【”，减少了非辐射跃迁的能量损失 增强了荧光峰的强度，并采用时间分辨技术，提高了测量的灵敏度。 c 其它金属配合物 葸醌类药物是临床上常用的一种抗癌药物。杨景和领导的研究小组 3 3 。4 】研究 了b e “，a l “与1 ，2 ，4 一三羟基蒽醌( t h a q ) 形成的配合物与核酸作用。研究发现， b e - - t h a q 与d n a 2 _ 间通过沟槽式结合增强了探针微环境的疏水性，使其荧光强 度大大增强；而r n a 没有沟槽，因而不能增强该探针的荧光强度，据此实现r n a 存在下d n a 的选择性定量测定。 光化学荧光探针 光化学荧光分析法f p c f ) 是基于物质吸收了紫外一可见辐射而引起诸如光加 成、光分解、光氧化还原及光异构等光化学反应，导致物质的结构或性质发生了 某些变化。形成荧光发射功能团，发生荧光增强或猝灭及荧光物质的激发或发射 波长发生移动等现象，从而使物质的荧光检测性质得到改善， 借此提高荧光分 析的灵敏度和选择性。李文友等人首次运用光化学荧光探针( 维生素k 3 芦j 和9 ，1 0 一蒽醌一2 一磺酸钠似o s f 3 6 ) 实现了对d n a 和r n a 的测定，提高了d n a 检测 的灵敏度，开辟了生物大分子新的研究领域。 4 3 共振光谱法 共振光散射的研究不需要专门的仪器，在普通的荧光分光光度计上选择合适 的激发和发射通带宽度。采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器 所得的同步光谱( 即 = ，即为光散射粒子的共振散射光谱【翊。由于共振光散 射光谱属于同步光谱，可把散射粒子看作能发射出与激发光相等波长的发光体， 故而共振光散射信号属于同步发光p 8 】。 有机染料试剂 在共振光散射分析测定核酸的技术中，常用一些染料分子作为r l s 探针。它 是基于染料在核酸等生物大分子上进行堆积，即生物大分子对染料起了富集作 用，使其上染料浓度远大于溶液中游离的染料浓度，相当于聚集体的生成，使 散射球体体积增大，所以尽管体系的吸收谱图无变化，但却观测到强烈增强的 r l s 信号【3 9 】。各种染料m e s o 一4 ( 对三甲基氨基) 卟啉f 1 1 a p p ) 【帅】、醌亚胺类的染料 如藏红t ( s n 【4 1 】、中性红( n r ) 【4 2 - 4 5 、亚甲基蓝( m b ) 【舶卅；某些碱性三苯甲烷染料 如乙基紫( e 【”弗】、晶紫 【4 9 5 0 l 、甲基紫( m f 4 9 5 1 1 和玫苯胺( r l ) i s 2 1 等均能与 核酸结合而使r l s 急剧增强并产生新的r l s 光谱，用于核酸的分析测定。具有 较高的灵敏度。酚藏花g i ：( p s ) 与核酸作用能导致体系折光指数发生变化，使r l s 强度急剧增加【5 3 】：耐尔蓝( n b ) 的硫酸盐1 5 “q 用于小牛胸腺d n a ( c t d n 的测定， 灵敏度很高，检出限最低可达0 4n g m l ；陈小明等还进行了灿烂甲酚蓝( b c b v 5 7 1 和副品红( p r l ) p q 共振散射法测d n 的研究。近来关于罗丹明染料如罗丹明 b 皿b ) 【5 9 】、丁基罗丹明b ( b r b ) “、罗丹明6 g ( r h 6 g ) 1 6 1 j 与核酸作用的共振光散 1 0 射光谱的研究也有报道。另外，许金钩等人将合成的四氨基铝酞菁掣p c ) 用于 测定纳克级核酸i6 2 】，并将其用于金黄色葡萄球菌d n a 的测定，所得结果与紫外 吸收法一致。 在一些表面活性剂存在下，d n a 与染料产生共振光散射光谱的增强作用的 研究也时有报道。如碱性三苯甲烷染料亮绿( b g ) 和孔雀石绿( m g ) 与核酸结合后 的r l s 强度变化不明显【4 ”，而在溴代十六烷基甲基铵( c r m a a ) 的存在，b g 【6 3 - 6 4 和m g 6 5 - 6 6 1 与d n a 体系的共振光散射大大增强，其它的研究还有很多，如十六 烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 使得阴离子染料间苯二酚黄( r 【6 7 】与d n a 结合，溴代 十六烷基毗啶( c p b l 存在下间甲酚紫( c p ) f 6 8 屿d n a 发生作用，这些都使得体系 的共振光散射大大增强，即表面括性剂对d n a 与染料作用产生的共振光散射具 有敏化作用。 表面活性剂 刘绍璞等研究了5 种阳离子表面活性剂作为与核酸反应的共性剂( c s ) 与核 酸反应使其r l s 急剧增强，而且5 种c s 与核酸具有相同的反应条件和光谱曲 线，文中还对五种阳离子表面活性剂与核酸的反应机理、核酸构象对r l s 的影 响等进行了讨论f 见表2 1 。 大粒子散射试剂 李正平将大粒子散射( 粒子直径在2 0 0 - - 7 0 0n m ，其散射光的性质属于d e b y e 散射和m i e 散射，称其为大粒子散射技术) 用于核酸的共振散射分析【”，效果很 好。在强酸性介质中，核酸首先变性，然后单链核酸聚集为大粒子，粒子的大小 与紫外可见光的波长相当，由动态激光散射仪测得在强酸性介质中粒子的水合半 径与其浓度呈线性关系【7 ”。由大粒子产生的光散射强度在很宽的范围内与核酸 的浓度成正比( 见表3 ) 。该方法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便、所用试 剂易得到的优点，应用前景广泛。 硫酸鱼精蛋白是一种小分子蛋白，它能与核酸通过强静电力作用结合为大粒 子的复合物，其散射光强度在p h2 2 4 4 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液中达至h 最 大【7 2 】。由此建立的核酸的大粒子散射分析方法的线性范围为0 0 5 ，6 0 0ug m l ； 其检出限分别为1 2 5n g m l 的小牛胸腺d n a 、9 0n g m l 的鱼精子d n a 、1 8 0 n 彰m l 的酵母r n a 。其优点是蛋白质、核苷酸和大部分金属离子都不干扰对核 酸测定的结果。 表1d n a 和有机染料的共振光散射作用 t a b l e1r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n go fr e a c t i o nb e t w e e n d n aa n do r g a n i cd y e s 染料试剂 d n ap h 值 最大波长 线性范围文献 也竺! ! 型里兰 1 p a a c t d n a7 4 84 3 2 00 0 6 一o - 3 64 0 s t c t d n a5 6 7 43 2 8 00 2 54 1 n rc t d n a2 3 3 3 0 。00 0 4 8 - 5 2 54 2 n rc t d n a7 6 7 85 3 5 0-43 n rc t d n a7 6 7 85 3 5 00 - 1 24 5 n rc t d n a5 0 7 03 3 5 00 0 64 4 m bc t d n a6 8 7 8 7 4 3 5 5 00 ，1 44 6 m bd n a5 5 7 5 3 5 0 00 2 - 1 44 7 e vc t d n a5 0 一l o 05 1 0 00 0 5 4 8 e vc t d n a6 3 8 45 0 5 00 2 0 4 9 c vf s d n a 6 7 8 04 9 5 00 - 2 04 9 c vd n a 9 2 1 0 55 1 2 00 - 0 95 0 m vf s d n a6 7 - 8 o 5 2 0 o0 - 2 04 9 m vc t d n a1 0 3 4 4 00 1 - 0 75 1 r ld n a1 1 04 8 5 00 1 0 5 2 p sc t d n a7 2 8 03 4 0 00 - 3 55 3 n bc t d n a 7 2 - 8 02 9 3 80 1 o5 4 - 5 5 n b sc t d n a7 2 7 62 9 3 40 0 85 6 b c bd n a1 0 8 1 1 53 4 7 00 0 8 15 7 p r ld n a0 5 1 _ 53 3 5 00 1 1 55 8 r bc t d n a1 0 3 7 8 00 1 - 1 65 9 b r bc t d n a1 13 8 0 00 0 1 - 9 66 0 r h 6 gc t d n a1 14 0 0 00 0 5 - 3 7 06 1 t a a l p c c t d n a6 0 4 0 0 00 - 0 2 56 2 c t m a b b gc t d n a1 0 4 1 1 8 4 6 6 80 1 26 3 c 7 r m b b gc t d n a7 5 84 7 0 00 1 26 4 c n i a b b gc t d n a2 2 13 3 7 60 2 06 5 c n 订a b b gc t d n a9 74 8 2 00 0 2 1 6 0 0 6 46 6 c 1 a b r yf s d n a3 1 5 3 4 0 0 0 4 06 7 c p b c pc t d n a4 55 5 0 00 1 - 1 06 8 1 2 表2d n a 和表面活性剂的共振光散射作用 t a b l e2r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n go fr e a c t i o nb e t w e e n d n aa n ds u r f a c t a n t s 试剂d n ap h 值最大波长 线性范围文献 也巴! 竺型里兰 c d b a c c t d n a6 5 8 54 7 0 00 4 0 6 9 z e p h c t d n a6 2 - 8 54 7 0 0 0 4 06 9 c p bc t d n a 4 0 6 54 7 0 00 - 3 06 9 t p bc t d n a3 o 一6 24 7 0 。o0 3 。06 9 c t a bc t d n a3 0 8 24 7 0 00 - 2 56 9 表3 酸性介质中r n a 的共振光散射 t a b l e3r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n go fr n a i na c i d i cm e d i u m 试剂dna最大波长线性范围文献 n i nug m l h 2 s 0 4 c t d n a 3 1 0 00 0 8 7 0 07 1 h c lc t d n a 3 1 0 00 0 6 1 0 0 07 1 h n o ，c t d n a3 4 3 00 1 - 1 0 0 o7 1 h ，p 0 4c t d n a3 1 0 00 1 - 8 0 07 1 h c l 0 4 h a c c t d n a c t d n a 3 1 0 0 3 1 0 0 o 。0 4 - 8 。0 0 8 8 0 0 0 0 4 8 0 7 1 7 1 金属离子及其络台物 近来也有关于金属离子及其络合物与核酸作用的共振光散射现象的研究。 黄承志发现c o ( i i ) 5 c i p