（遗传学专业论文）黑斑蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测.pdf

蜊嗍j j | j i i i i i i | | i f + l l l l f j i j i rlllliii y 18 9 0 7 8 4 。 论文中除特别加以标注和 同志的研究成果对本人的 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：二乏l 么川日二_ 教三二：二 f、 年6 月艿日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 两栖动物是最原始的陆生脊椎动物，既有适应陆地生活的新的性状，又有从鱼类祖 先继承下来的适应水生生活的性状。两栖类动物皮肤裸露，为了适应复杂多样的生态环 境并维持自身的生存，皮肤起到重要作用。两栖类皮肤可以分泌大量功能复杂、种类繁 多的生物活性物质，对抵御有害环境因子侵袭有着重要作用。蛙类皮肤活性肽资源丰富 包括抗菌肽、舒缓激肽样多肽、血管紧张素因子、多肽生长因子、吗啡因子、保湿因子 等。生物活性多肽具有分子和功能的多样性。两栖类皮肤资源丰富，可用于生物活性多 肽的发现、纯化和功能研究。黑斑蛙( r a n an i g r o m a c u l a t a ) 属于蛙科、蛙属，广泛分布 在我国各地，资源丰富。 本论文选取辽宁省大连市金州登沙河镇的黑斑蛙为实验材料，运用反相高效液相色 谱技术对黑斑蛙皮肤分泌物中生物活性多肽进行提取和纯化，获得6 种皮肤生物活性肽。 利用m s 和q t o fm s m s 对6 种多肽的分子量和氨基酸序列进行了测定。首先利用电 刺激诱导方法取得黑斑蛙的皮肤分泌液。采用v y d a c t p 5 1 0 反相高效液相色谱，对皮肤 分泌液采用线性梯度洗脱，分离纯化得到6 个多肽。6 条多肽分子量从1 0 6 0 2 到3 2 4 5 9 道尔顿，由9 个到3 2 个氨基酸组成。其一级结构分别为r p p g f s p f r 、 r p p g f s d s s p l a p g t 、l k n v g k e v ( 捧d v e n e l r l a g h a r p i ，g k 、k s p g v g a l a g k k p h g l l l s g i ，k n v g g a e a g f d 、l g l g k v l g v g q r a l a h s p p k 、和l v p l v s y h l p v l 。 通过比对n c b i 蛋白质数据库，由9 个氨基酸组成的多肽r p p g f s p f r 是典型缓激肽 ( b r a d y k i n i n ) ，命名为b r a d y k i n i n - r n ；r p p g f s d s s p l a p g t 具有缓激肽的结构域保守序 列r p p g f s ，属于缓激肽相关肽b r p s ( b r a d y k i n i n - r e l a t e dp e p t i d e s ) ，命名为 r a n a k i n i n r n l 。l v p l v s y h l p v l 虽然不含有缓激肽的保守序列，但具有较高的缓激 肽活性，所以命名为r a n a k i n i n - r n 2 ，而其余多肽同已知其它两栖类皮肤多肽相似度很 低，属于新的多肽，分别命名为：n i g r o m i n - 1 ，n i g r o m i n 2 和n i g r o m i n 3 。抗菌活性测 定结果显示，这3 个新肽对2 种细菌均没有抑制作用。对3 个缓激肽和缓激肽相关肽进 行豚鼠离体回肠实验测定对肠肌收缩性的影响。实验结果显示b r a d y k i n i n - r n 和 r a n a k i n i n - r n l 豚鼠回肠的收缩强度呈现一个正的线性关系，b r a d y k i n i n i 蝌的缓激肽活 性比缓激肽r a n a k i n i n r n l 强。r a n a k i n i n - r n 2 随着浓度提高，其缓激肽活性达到最高 后活性受到抑制。 关键词：皮肤；生物活性肽：结构鉴定；质谱检测 r e s o u r c e 。w h i c hh a sm e d i c a lv a l u ei nn o r t h e a s tr e g i o n o fc h i n a r e s e a r c h e sh a v es h o w nt h a t r a n an i g r o m a c u l a t as k i nc o n t a i n sv a r i o u sa c t i v ep e p t i d e s ，s u c ha sb r a d y k i n i n - l i k ep e p t i d e ， b o m b e s i np e p t i d e 。g r o w t hf a c t o r , m o r p h i n ea n dm o i s t u r i z i n gf a c t o r s i nt h i sp a p e r , r a n an i g r o m a c u l a t ag r o w t hi nj i n z h o ud e n g s h a h eo fd a l i a no fl i a o n i n g w a sc h o o s e da st h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l n ei s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o no fb i o a c t i v ep e p t i d e sf r o mt h es k i no fr a n an i g r o m a c u l a t aw e r ec a r r i e do u t b yg e lc h r o m a t o g r a p h ya n dr p h p l c t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fp u r i f i c a t i o nw e r e s c r e e n e d , a n ds e v e no fs k i nb i o a c t i v ep e p t i d e sw e r eo b t a i n e d m sa n dq t o fm s m sw e r e u s e dt od e t e r m i n a t et h e i rm o l e c u l a rw e i g h ta n da m i n oa c i ds e q u e n c e s r a n an i g r o m a c u l a t a s k i ns e c r e t i o nw a so b t a i n e db ye l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n t h es e c r e t i o nw a sp u r i f i e du s i n g v y d a c t p 51 0r p h p l ci n t o6s i n g l ep e p t i d e s 1 1 1 er e s u l t so fa n a l y s i so f a m i n oa c i ds e q u e n c e s s h o w e d 也a tt h r e eo ft h e s ep e p t i d e sw e r eb r a d y k i n i no rb r a d y k i n i n - r e l a t e dp e p t i d e s a n dt h e o t h e r t h r e ew e r ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s t h e i rm o l e c u l a rw e i g h t sw e r ef r o m10 6 0 2t o 3 2 8 5 9 6d a l t o n , a n dc o m p o s e do f9t o3 2a m i n oa c i d s t h e i rp r i m a r ys t r u c t u r ew a s r p p ( 逦s p f , r p p g f s d s s p l a p g t ，l k n v g k e v ( 谭d v e n e l r l a g h a r p l g k , k s p g v g a l a g k k p h g l 】一l s g ik n v g g a e a g f d ，l g l g k ，g v g q ra i ，a h s p p ka n dl v p i s y h l p v l a r e rb l a s ts e a r c h e di nn c b ip r o t e i nd a t a b a s e s w ef o u n dt h a tp e p t i d e s r p p g f s p f rw a st y p i c a lb m d y k i n i nc o m p o s e do f9a m i n oa c i d sa n dr p p g f s d s s p l a p g t h a d 也em o t i fo fb r a d y k i n i n ( r p p g f s ) a n db e l o n g e dt ob r a d y k i n i n - r e l a t e dp e p t i d e s , n a m e di t r a n a k i n i n r n l a l t h o u g ht h ep e p t i d el v p l v s y h l p v ld o e sn o tc o n t a i nt h ec o n s e r v e d d o m a i no fb r a d y k i n i n , w es t i l ln a m e di ta sr a n a k i n i n - r n 2d u et oi t sh i g h e rh o m o l o g y 一一 辽宁师范大学硕士学位论文 b r a d y k i n i na c t i v i t y m e a n w h i l e ，t h er e s to fp e p t i d e ss h a r e dal o w e rh o m o l o yw i t hs o m e k n o w na m p h i b i a ns k i np e p t i d e s t h e r e f o r e ，m e ya r et h en e wp e p t i d e s ，n a m e dt h e ma s n i g r o m i n - 1 ，n i g r o m i n - 2 ，n i g r o m i n - 3 ，r e s p e c t i v e l y t h eb r a d y k i n i na c t i v i t yo fb r a d y k i n i na n db r a d y k i n i n - r e l a t e dp e p t i d e sw a st e s t e db y a s s a y i n g t h e c o n t r a c t i l e a c t i v i t y o ni s o l a t e d g u i n e ap i g i l e u m t h er e s u l t ss h o w e d b r a d y k i n i n - r na n dr a n a k i n i n r n ic o n t r a c t e dg u i n e ap i gi l e u mi nap o s i t i v e l i n e a r r e l a t i o n s h i p ，b r a d y k i n i na c t i v i t yo fb r a d y k i n i n - r nw a sm o r ep o t e n tt h a nr a n a k i n i n - r n l b m d y k i n i na c t i v i t yo fr a n a k i n i n - r n 2w a si n h i b i t e da f t e rr e a c h i n gi t sm a x i l n u m ，s h o w i n gt h a t t h ep e p t i d em i g h tb et h eb r a d y k i n i na n t a g o n i s tp e p t i d e k e yw o r d s ：s k i n ；b i o a c t i v ep o l y p e p t i d e s ；s 饥l c t u r ei d e n t i f i c a t i o n ；m a s ss p e c t r o m e t r y d e t e c t i o n m 黑斑蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 目录 摘要- i a b s t r a c t i i 弓l 言1 ，l j 1 文献综述。2 1 1 两栖类动物皮肤研究概况。2 1 1 1 生物活性肽简介2 1 1 2 生物活性肽在两栖类皮肤类别2 1 1 3 两栖类皮肤活性肽的活性6 1 1 5 两栖类皮肤活性肽的类别和其在哺乳动物细胞中的对应物。8 1 1 6 两栖类皮肤活性肽的应用及前景9 1 1 7 两栖类动物皮肤分泌物的研究状况1 0 1 1 8 本研究的预期目标1 2 2 黑斑蛙线粒体1 2 sr r n a 部分序列测定1 3 2 1 材料和方法1 3 2 1 1 材料1 3 2 1 2 方法1 3 2 2 结果与分析1 3 2 2 1 黑斑蛙线粒体d n a 提取1 3 2 2 2 黑斑蛙p c r 扩增和序列测定1 4 2 2 3 黑斑蛙1 2 sr r n a 基因序列与已知黑斑蛙1 2 sr r n a 基因序列比对1 5 2 3 讨论1 6 3 黑斑蛙皮肤单一活性多肽的制备1 7 3 1 材料和方法1 7 3 1 1 材料1 7 3 1 2 方法17 3 2 结果与分析1 8 3 2 1 黑斑蛙皮肤电刺激提取物的高效液相制备分离结果1 8 3 2 2 黑斑蛙皮肤电刺激分泌物制备各峰的分析液相纯化1 9 3 3i 寸论：2 2 4 黑斑蛙皮肤活性肽的氨基酸序列测定一2 3 一i 、卜 l 辽宁师范大学硕士学位论文 4 1 材料和方法一2 3 4 1 1 材料- 2 3 4 1 2 方法。一2 3 4 2 结果与分析一2 3 - 4 2 1 黑斑蛙皮肤生物活性肽的分子量测定一2 3 4 2 2 黑斑蛙皮肤生物活性肽的氨基酸序列分析2 3 4 2 3 黑斑蛙氨基酸序列经n c b i 蛋白库比对2 4 4 2 4 黑斑蛙皮肤活性肽的物理化学特性分析2 7 4 2 5 黑斑蛙生物活性肽的二级结构分析结果2 8 5 黑斑蛙皮肤活性肽的生物活性研究一3 0 一 5 1 材料和方法3 0 一 5 1 1 材料3 0 5 1 2 仪器。3 0 5 1 3 方法一3 0 5 2 结果与分析31 5 2 1 黑斑蛙皮肤活性肽的缓激肽活性3 1 5 2 1 黑斑蛙皮肤多肽的抗菌肽活性结果3 2 5 3 讨论3 3 - 结论一3 4 参考文献- 3 5 附录：j ；。j 3 9 攻读硕士学位期间发表学术论文情况4 5 一 致谢4 6 辽宁师范大学硕士学位论文 己i吉 ji 目 两栖类动物的生存环境非常复杂，因此两栖类皮肤中含有分子结构与功能多样的生 物活性分子来适应复杂环境和调节生理功能，特别是生物活性肽，素有生物活性肽巨大 储存库之称。此外，两栖类动物可以作为理想的生物模型，来研究生物活性肽的结构和 功能关系。值得关注的是，已经在两栖类皮肤中获得的活性肽大部分都能在哺乳动物中 找到与之相对应的对应物，并且具有广阔的药理与生理活性。因此，近年来在临床医学 方面受到人们广泛的关注【l 卅。 黑斑蛙( r a n an i g r o m a c u l a t a ) 俗称青蛙，分类学上隶属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙 属，是中国大陆分布最广的两栖动物之一，在东北亚、东亚地区也广泛存在，在大自然 的生态平衡中占重要地位。黑斑蛙的皮肤在适应多种多样的生态环境中起到重要的作 用，担任调节水平衡、抗茵、抵抗猎食者、呼吸、外分泌等多方面的功能。目前，国内 对黑斑蛙皮肤活性肽缺少系统的研究，对黑斑蛙皮肤活性肽提取分离技术以及功能方的 研究报道较少。黑斑蛙富含宝贵生物活性物质资源，并未充分发挥其药用、保健价值， 基于辽宁省黑斑蛙资源丰富的这一优势，本论文对黑斑蛙皮肤分泌物中的活性肽进行了 分离纯化及其功能的研究。如果能从黑斑蛙皮肤分泌物中提取分离到具有药用价值的生 物活性肽，必定能拓宽黑斑蛙的开发利用的新途径，丰富辽宁省的“北药 资源，并为 祖国的医药宝库增添一新的力量。 黑斑蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 1 文献综述 1 1 两栖类动物皮肤研究概况 1 。1 1 生物活性肽简介 生物活性肽，是生物体内就有特殊功能肽的总称，一般是对生物体的生命活动具有 裨益或具有生理作用的寡肽和较小的多肽。在生物体中存有多种活性肽，均具有不同的 空间结构和生物学功能，并参与体内重要的生命活动。现代营养学的研究表明：蛋白质 被人类摄食后，经过消化道的酶作用，大部分是以小肽的形式被消化吸收，而以游离氨 基酸形式消化吸收所占比例较小。研究人员发现，相对于游离氨基酸，肽被消化和吸收 速度比游离氨基酸快，从而有着更高的生物效价和更高营养价值。来源于食物中的生物 活性肽能够调节血压，抗氧化、抑菌、抗血栓、促进物质吸收、提高免疫力等对人类健 康起到多种作用。通过加工获得的生物活性肽其安全性好、成本低，易于工业化大规模 生产，渐渐受到各国科研人员的关注，所以生产生物活性肽具有良好的应用前景。生物 活性肽的活性，可作为引物加入非食品的介质中使得其产品具有某些功能；生物活性肽 具有较强的活性和多样性，能够提高身体生理活性，并全面调节人体生理功能；生物活 性肽在抑制肿瘤增长时起到很好的效果；生物活性肽是信息传递和调控的重要物质，广 泛应用于中枢神经并参与调节身体机能；生物活性肽具有免疫调节作用，不少的化学组 成和结构已经确定，它们有特异、安全和较高的免疫学活性；生物活性肽不但能提供人 体生长发育所需的营养物质，同时还具有特殊的生物学功能，促进人体对蛋白质、氨基 酸、维生素、镁、锌、钙、铜、硒、铁等多种对人体有益微量元素的吸收。 1 1 2 生物活性肽在两栖类皮肤类别 ( 1 ) 抗菌肽 抗菌肽是存在于多种生物天然免疫系统中，并由特定基因编码的一类具有抗菌活性 的小分子多肽，富含阳离子氨基酸残基，是热稳定性及两亲性的广谱抗菌分子，多数抗 菌肽的等电点在8 9 9 5 。它有多种结构，不仅仅作用于革兰氏阳性菌，也作用于昆虫、 真菌、肿瘤细胞和某些病毒，同时还能加速伤口愈合过程和免疫反应【5 吲。1 9 7 2 年，瑞 典科学家g b o m a n 等人【刀对惜古比天蚕( h y a l o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹注射蜡状芽孢杆菌 ( b a c i l l u sc e r e u s ) ，首次分离得到具有抗菌活性物质天蚕素( c e c r o p i n s ) ，并于1 9 8 1 年在n a t u r e 上公布了其氨基酸序列。 辽宁师范大学硕士学位论文 两栖类动物皮肤裸露、潮湿，这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境，为了抵 御病原微生物的侵袭，在长期的自然选择过程中，两栖类动物逐渐形成了一套防御机制。 其中抗菌肽作为抵御外界微生物的第一道防线，有着强大而广泛的抗菌功能。研究表明 两栖类抗菌肽具有抗菌效率高、抗菌谱广等优点，而且还不易引起微生物的耐药性等优 点。 抗菌肽的结构多种多样，研究发现一些抗菌肽与磷酸脂膜混合或者在酸性的环境中 能形成洳螺旋结构，例如c e c r o p i n ；一些多肽通过分子内的二硫键形成b 片层结构，如 d e f e n s i n ；另外一些多肽链上同时含有弘螺旋和肛片层结构，如a p i d a e c i l l s 。两栖类皮 肤抗菌肽的结构不同，说明抗菌肽在生物学功能具有多样性。第一个两栖类皮肤抗菌肽 是从欧洲花铃蟾( b o m b m av a n e g a 幻) 【8 】。到1 9 8 7 ，z a s l o f f 从非洲爪蟾皮肤分泌物中分 离出另外一种抗菌肽m a g a i n i n ，具有广谱的抗微生物活性( 包括抗多种细菌、真菌、原 虫) ，受到极大的关注【9 】。因此，促进了两栖类皮肤抗茵肽分离纯化、结构与功能研究， 以及临床应用研究。据不完全统计，目前已经从无尾两栖动物8 个属约4 0 多种的皮肤 中提取出了抗菌肽，并测定了序列。分别是肛褶蛙属、铃蟾属、雨滨蛙属、多指节蟾属、 叶泡蛙属、蟾属、耳腺爪蟾属和蛙属。中国有五个种是黑斑蛙、中国林蛙、大蹼铃蟾、 粗皮蛙和东方铃蟾。在有尾两栖动物中，几乎没有蛙皮抗菌肽的研究报道。在结构上， 人们根据分离纯化出的1 0 0 多种抗菌肽在结构上的同源性将其划分成各个家族。报道较 多的有b r e v i n i n 家族、r a n a m e r i n 家族、b o m b i n i n 家族、e s c u l e n t m 家族、m a g a i n i n 家 族、r a n a l e x m 家族和a l h i n 家族 1 0 - 1 3 】。m a g a i n i n 家族具有广谱的抑菌活性，不仅对于 革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、酵母以及原生生物均具有明显的抑制作用，并且 这族抗菌肽的溶血活性较低，同时对一些癌细胞也有很强的杀伤力，有望将其开发为新 一代抗生素和抗肿瘤药物。 两栖类抗菌肽种类繁多，但目前测定的两栖类抗菌肽的氨基酸序列的一级结构一般 为阳离子抗菌肽，它们具有一些共同的特征：( 1 ) n 端富含赖氨酸和精氨酸等极性氨基酸， 抗菌肽具有表面活性剂活性与这一特征有关；( 2 ) 绝大多数抗菌肽的第二位氨基酸残基是 t r p ，它对抗菌肽杀菌活性的高低起着至关重要的作用；( 3 ) c 端富含甘氨酸、丙氨酸等 非极性氨基酸，另外一些天然抗菌肽c 端通常酰胺化，可能与抗菌肽的广谱抗菌活性有 关；( 4 ) 中间富含脯氨酸，影响着抗菌肽的杀菌活性【1 4 1 。抗茵肽的二级结构是杀菌的关键， 现在人们认为它能形成弘螺旋结构、p 片层结构、延展结构以及g - l o o p 结构。抗菌肽具 有两亲性，其n 端易形成舡螺旋，中间易形成p 折叠，易于对病原体及病灶细胞的生 物膜进行攻击。抗菌肽按期结构特点分为：包含a 螺旋结构的，如非洲爪蟾皮肤的 1 ， 黑斑蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 m a g a i n i n s 。包含8 折叠的抗菌肽，如哺乳动物组织的防御素。有些抗菌肽同时含有这 两种结构。 抗菌肽功能上的最大优点是对真菌、病毒和原虫有高效广谱的杀菌活性。有些抗菌 肽同时还对癌细胞和实体瘤有攻击作用，但不破坏正常细胞。研究结果说明一些抗菌肽 除了具有抗菌作用外，同时还有一种或几种生物学作用，如爪蟾抗菌肽、人蚕素等【l 习。 具有有着较强抑菌活性同时没有溶血性的m a g a i n i n 家族，已经成为新一代的抗菌药物 进入2 3 期临床【1 6 1 。最近的研究表明，抗菌肽对性传播病原体一也有杀伤作用。另外， s i n h a 等在体外实验中发现一种来源于兔的c t 防御素f n f 1 ) 能够阻止单纯疱疹病毒( h s 的入侵和在细胞内的传播。 ( 2 ) 缓激肽 缓激肽是由前体蛋白质经酶解得到的，能引起血管扩张并改变血管渗透性的九肽， 由激肽释放酶( k a l l i k r e i n ) 直接降解激肽原或者赖氨酰舒缓激肽。在人体内的半衰期很短， 一般小于0 5 m i n ，因此测定体液中的缓激肽很困难，然而其代谢产物半衰期有8 6 l o l m i n ，常用高压液相色谱法( h p l c ) 或酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 测定。研究发现在 同种或不同种类型的细胞中，所有的已知第二信号系统能够被激活，表现出的生物活性 多种多样。缓激肽不仅引起病理生理反应，而且也发挥生理保护作用。 缓激肽及其氨基酸序列1 1 8 - 1 9 】未被获得之前的相当长的一段时间内，世人就知道有一 种未知的物质( 缓激肽) 存在，其生理活性已被实验确证。当时人们研究发现通过孵育 胰岛素后就从血液中释放出一种未知的物质，这种未知物质能够引起小猪回肠收缩缓慢 2 0 l 。希腊语中单词b r a d y k i n i n 有缓慢作用的意思，由此人们用b r a d y k i n i n 命名为缓激肽， 纯的缓激肽是1 9 6 0 年第一次被发现并检测了它的氨基酸序列。据研究缓激肽通过两种 不同受体b 1 和b 2 介导其生理作用。一方面，受体b 1 的数量在动物体内是一定的，因 此它对b r a d y k i n i n 不能起到应答作用。但有报道受体b 1 可能对缺失第9 个氨基酸残基 的缓激肽或其他激肽的d e s a r g 类似物起到应答作用。如：缓激肽对大鼠的离体回肠纵 纹平滑肌的收缩作用，就是由b 1 受体所介导的。另一方面受体b 2 在动物体内各种细 胞，起到应答作用需要缓激肽全肽链作为启动剂。如：缓激肽对豚鼠的离体回肠纵纹平 滑肌的收缩作用，则由b 2 受体所介导的【2 l 】。 缓激肽除了在哺乳类脊椎动物体内发现外，尤其是在两栖动物皮肤中，也发现了缓 激肽及其相关多肽存在。学者曾尝试将缓激肽从蛙类动物体内的血液中诱发产生，然后 经过分离纯化后来探讨它们的生活作用，然而这个实验项目最终没能取得成功。目前缓 辽宁师范大学硕士学位论文 激肽及相关多肽也从许多两栖类动物中获得。据最近的研究显示：缓激肽相关多肽已经 从有尾蛙加c 劝淞t r u e i ( 一种古老的青蛙) 的皮肤分泌物分离获得瞄】。 研究表明缓激肽对心血管系统有影响，m a e s t r i 2 3 等人通过实验发现：把小鼠的缓激 肽b 2 受体基因信号去除后，引起心力衰竭及扩张性心脏病。s i l i v a 等人将缓激肽转基因 到大鼠后，心率和血流动力学无变化，但实验动物平均动脉压显著下降，2 4 h 内血压节 律遭到破坏。研究结果发现缺失此基因的大鼠并没有因缓激肽的缺少而导致血压升高 嗍。心肌缺血时缓激肽起到保护心肌的作用。r a s h i d 2 5 1 等发现心肌梗死的面积减少由b 2 受体激动剂f r l 9 0 9 9 7 作用，而心肌梗死面积扩大则由b 2 受体拮抗剂h o e l 4 0 作用。迅速 磷酸化n o 合成酶和蛋白激酶，使缺血部位的心肌血流量，是缓激肽作用b 2 受体所致， 进而使心肌缺血部位的面积减少【2 6 】。 ( 3 ) 其他的生物活性肽 免疫活性肽( 1 m m u n o a c t i v e p e p t i d e s ) 包括外源性和内源性两种。来源于牛乳或人乳 中的酪蛋白主要是外源性的免疫活性肽1 2 7 。这类来源的免疫活性肽包括：具有免疫活性 的1 3 酪蛋白片段、a s l 酪激肽、p 酪激肽。免疫活性肽就有生理功能的多样性，强啡肽、 内啡肽和脑啡肽属于内源性阿片肽具有免疫刺激作用，使淋巴细胞增殖。经研究发现免 疫活性肽不仅具有提高机体免疫的能力，还具起到免疫调节的作用，同时还能激发淋巴 细胞增殖和增强巨噬细胞的吞噬能力，进而抵抗病原微生物对机体的侵袭。如：小鼠腹 腔巨噬细胞受脂多糖刺激产生i l - i 就是甲硫脑啡肽( m e n k ) ，进而促使小鼠淋巴细胞 增殖，产生几一6 、i l 2 等细胞因子【2 引。 抗氧肽有抗氧化的作用，人们比较熟悉是天然二肽一肌肽( c a r n o s i n e ) 存在于动物 的肌肉中。肌肽抑制体内由红蛋白、f e 2 + 和体外单线态氧催化的脂肪酸败作用。为了防 止食品的棕色反应【2 9 】，目前己在蜂蜜和蘑菇中分离去几种小分子抗氧肽，来抑制多酚氧 化酶的活性并与多酚氧化酶催化后的醌式产物反映，从而抑制聚合氧化物的形成。在食 品防腐方面抗氧化肽有广泛的应用前景。 b o m b e s i n 是从b o m b i n ab o m b i n a 的皮肤中分离得到的一种独特的多肽，此后结构和 活性相似的多肽l i t o r i n , r a n a t e n s i n 和p h y l l o l i t o r i n 等被人们从其他种类的青蛙中提取出 来。在哺乳动物中的类似物胃泌激素释放多肽的分离受b o m b e s i n 的发现指引。它们作 用于平滑肌，导致血管紧缩，尿液分泌被抑制。在神经系统治疗方面有较好应用潜力【3 0 一3 2 】 o c a e m l e i n s 分离自h y l ac a e r u l e a ，x e n o p u sl a e v i s 和p h y l l o m e d u s as a u v a g e i 3 3 一蚓。具 有止痛、体温调节和镇静的效果【3 5 1 。在哺乳动物中起相同作用的物质为胃泌激素和缩胆 囊肽一8 ( c c k - 8 ) 。 黑斑蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 x e n o p s i n 最早分离自x e n o p u sl a e v i s 。x e n o p s i n 类多肽可能是青蛙在遇到被捕食的 情况下起到抵御作用，因为它能导致捕食者如蛇类的口腔运动障碍，以便其逃脱1 3 6 j 。 抗凝肽中凝血酶抑制剂的研究较活跃。包括水蛭素、水蛭素衍生物以及一些特异性 较低分子量较小的肽类抑制剂。水蛭的水蛭素是由6 5 个氨基酸组成单一肽链的小蛋白。 水蛭素起到抗凝的作用是它对凝血酶有很高的亲和性，通过以等摩尔比与凝血酶非共价 键紧密结合的稳定复合物，从而使凝血酶失去裂解纤维蛋白原为纤维蛋白的能力，并阻 止纤维蛋白的凝固，阻止凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板反应，达到抗凝 的目的【3 7 - 3 s 。f u s e t a n i 3 9 从海绵t h e o m e u as p 属中分离得到3 个线性四肽，通过化学降 解法和2 d n m r 证明n a z u m a m i d ca 的结构2 ，5 二羟基苯基l 从r g - l p r o l i ea 氨基丁酸， 实验结果表明其具有凝血酶抑制活性。 1 1 3 两栖类皮肤活性肽的活性 两栖类皮肤活性肽无论是种类，还是数量，在皮肤中分布都非常丰富，并且其功能 复杂。在不同种类的两栖类皮肤中贮存着不同生理、药理活性的多肽，在生物功能上有 着多样性的特点。 ( 1 ) 抗肿瘤活性 研究发现从中国大蹼铃蟾中分离提取出的抗菌肽m a x i m i n 和非洲爪蟾分离提取出 的抗菌肽m a g a i n i n 在在微摩尔浓度水平就对肿瘤细胞显示不同程度的杀伤作用 4 0 l 。 ( 2 ) 抗病毒活性 抗菌肽d e r m a s e p t i n 从南美叶泡蛙( p h y l l o m e d u s as a u v a g i ) 皮肤中分离得到，研究显 示其对疱疹病毒具有抑制作用。此外，首次报道的抗艾滋病病毒抗茵肽来源两栖类，抗 菌肽m a x i m i n 3 是从中国大蹼铃蟾皮肤分离获得的，研究表明其具有抗艾滋病病毒活性 d 1 _ 4 2 1 o ( 3 ) 抗菌活性 两栖类皮肤抗菌肽具有抗细菌、抗真菌活性。从两栖类皮肤中获得抗菌肽通过研究 显示在较低的浓度下有着强大而广谱的抗菌活性，抗菌肽m a x i m i n 3 是从中国大蹼铃蟾 皮肤分离获得的，在浓度为11 5 t t g m l 可对痢疾杆菌、大肠杆菌及巨大芽孢杆菌抑制生 长。另外，最小抑菌浓度为1 5 i t g m l 时，对真菌白色念珠菌有抑制作用【柏】。同时研究 发现，将b u f o r i ni 和r a n a l e x i n 结合使用，可将氨苄西林抗性的表皮葡萄球菌起到较好 的杀伤效果【4 3 1 。 ( 4 ) 溶血活性 辽宁师范大学硕士学位论文 b o m b i n i n h 是从东方铃蟾( b o m b i n ao r i e n t a l i s ) 分离出的抗菌肽和b a x i m i n h 从中国大 蹼铃蟾分离出的抗菌肽，研究显示都具有明显的红细胞溶解活性。5 0 肛g m l 时的 m a x i m i n h 可以完全溶解兔红细胞嗍。 ( 5 ) 胚胎毒性 从非洲爪蟾得到得抗菌肽m a g a i n i n - 2 a m i d e 具有明显的胚胎毒性，导致小鼠胚胎的 死亡仅用微克级的浓度，这种抗菌肽也正被试图用作临床避孕药物嗍。 ( 6 ) 其他生物功能 据报道，d e r m a s e p t i n 是从南美叶泡蛙皮肤得到的抗菌肽，通过实验验证对疟原虫 具有抑制作用。最近研究，从两栖类动物p s e u d i sp a r a d o x a 得到的抗菌肽p s e u d i n ，其在 结构上与一种细胞凋亡因子d e f t 的一段区域显示了很高的相似性。前者对控制蝌蚪尾 部形态变化的细胞凋亡具有调节作用，而后者可以调节哺乳动物精原细胞的细胞凋亡 【4 5 】 o 1 1 4 两栖类皮肤活性肽的组织学分 两栖动物显著特征之一是皮肤裸露无毛、羽和鳞片结构嗣。因此，两栖类皮肤在日 常生活中担当着各种重要的功能包括：水分调节、体温调节、呼吸、伪装等【4 j 7 1 。两栖动 物的皮肤还具有抵抗和防御栖息环境中的病源微生物的功能 4 8 。5 0 】。两栖动物皮肤为双层 结构，即真皮( d e r m i s ) 和表皮( e p i d e r m i s ) 。真皮层中的大量毛细血管，这样两栖动物可以 通过皮肤进行有氧呼吸。同时表皮层是一层由死细胞组成，有利于两栖动物在陆地生活 是降低水在皮肤中的流失。两栖动物皮肤的色素胞中含有色素，它们与两栖动物的恐吓 性的防御行为( d e i m a t i cb e h a v i o r ) ，其色素胞分布在真皮层和表皮层之间或者在真皮层 外表面【5 1 5 2 1 。 两栖动物皮肤真皮层中存在许多腺体聚集体和腺体。在形态学上，青蛙皮肤腺体包 括粒状腺体( 毒腺) 和粘液腺体。粒状腺体分布在蛙的背部皮肤上。粒状腺体的直径为 4 0 0 - - 5 0 0 p m ，通过肉眼可以看到存在于背部皮肤显浅灰色斑点。沿着眼后线一直到肛 门区域形成一条皱褶【5 3 1 。由细胞内许多肌丝的肌上皮细胞组成 粒状腺体的最外层【5 5 1 。无尾目动物中外部肌上皮细胞层包被内部分泌层而形成合 胞体，这是与无足目动物和有尾目的分泌层结构组成细胞有所差别【5 6 1 。两栖动物皮肤中 的粒状腺体能够分泌出有毒或有害的物质。当用上皮细胞受到物质刺激或微生物的感染 等会引起其肌丝收缩，腺体被挤压，类似全浆分泌的机制释放出分泌物【5 7 】。向皮肤注射 去甲肾上腺素和肾上腺素【5 引，可迅速释放出乳白色的粘稠的分泌物。在位于表皮层的分 泌管内部，可发现分泌物颗粒降解后产生的无定形物质。相对于粒状腺体，粘液腺体个 体很小直径通常不超过1 0 0 p r o ，并且个体和数量都不如粒状腺体。粘液腺体在常位于两 黑斑蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测 栖动物的表皮层下，分泌物是通过连接腺体穿过表皮的分泌管送到体表，这种由粘液腺 体分泌出的分泌物为两栖动物的生存进化起到重要的作用。首先，分泌的粘液使动物的 皮肤光滑，可以避免被动物的捕食，起到逃脱作用。其次，分泌的粘液中含有其他一些 化学成分，如如蛙皮粘多糖和粘液素等。这些成分与体温调节、体表p h 值的调节及皮 肤润滑有关。同时蛙类抱对过程中粘液在起到重要作用，如蛙类中b r e v i c e p ss p p ，粘液 促使蛙在繁殖期两性紧紧粘在一起。 1 1 5 两栖类皮肤活性肽的类别和其在哺乳动物细胞中的对应物 同哺乳动物皮肤相比，两栖类皮肤中的活性物质类繁多、功能复杂。两栖类皮肤中 所储存大量的生物活性肽在生理方面有不同的作用。目前，根据其作用两栖类皮肤肽已 被划分成为1 4 个大类【5 9 - 6 4 ： ( 1 ) 血管紧张素样肽( n g i o t e n s i n 1 i k ep e p t i d e s ) 家族，在于肝脏和血液中主要有血管紧张素 存在，控制血压和调节体内的水盐平衡起到重要作用。它在哺乳类中的对应物为血管紧 张素( a n g i o t e n s i n ) 。 ( 2 ) 舒缓激肽样多肽( b r a d y k i n i n l i k ep e p t i d e s ) 家族，此肽可对离体豚鼠回肠、膀胱和狗、 免膀胱及猫小肠较强的刺激作用，能过促进大鼠子宫排卵。同时也可对动物产生降压及 舒张血管的作用。它的对应物为速激肽，主要存在于哺乳动物的血液及肝中。 ( 3 ) 蛙啡肽样多肽( d e r m o r p h i n l i k e p e p t i d e s ) 家族，这类肽具有强大镇静及镇痛功能，镇痛 活性是相同量的吗啡的2 0 0 0 倍。它在哺乳类中的对应物是脑啡肽( e n k e p h a l i n ) ，主要 存在于脑中。 ( 4 ) 趋化性蛙多肽类( c h e m o t a c t i cp e p i t d e s ) 家族，对于这类肽研究发现对巨噬细胞显示出 较强趋化活性。研究者进而推测其与两栖类抵抗微生物侵袭而产生的机体免疫反应有 关。目前，在哺乳类中还未找到同这个家族匹配的对应物。 ( 5 ) 速激样多肽( t a k y i n f n 1 i k ep e p t i d e s ) 家族，这种肽的